專利名稱：一種體內(nèi)誘導(dǎo)出針對(duì)TNF-α分子的自身抗體的蛋白疫苗的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及基因克隆、基因重組、外源基因在原核細(xì) 胞中的表達(dá)、目的蛋白的純化、動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)、誘導(dǎo)抗血清的體外活性檢測(cè)以及惡病質(zhì) 治療、急性肺損傷治療、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療實(shí)驗(yàn)等技術(shù)領(lǐng)域，進(jìn)一步涉及一種在體內(nèi) 能夠誘導(dǎo)出針對(duì)TNF- a分子的自身抗體的蛋白疫苗的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
1. TNF- a分子及抗TNF- a治療的相關(guān)研究 1. 1 TNF-a分子1975年Carsw11等發(fā)現(xiàn)，卡介苗和細(xì)菌內(nèi)毒素感染的小鼠血清中有一種高活性的腫 瘤細(xì)胞毒因子，該物質(zhì)可使腫瘤發(fā)生出血性壞死，但對(duì)正常組織細(xì)胞無殺傷活性，將其 命名為腫瘤壞死因子。經(jīng)研究表明TNF - a是一種由單核/巨噬細(xì)胞分泌產(chǎn)生的多功能細(xì) 胞因子。人TNF-a基因位于第6號(hào)染色體，基因長4kb，由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組 成，與MHC基因密切連鎖，其前體由232個(gè)氨基酸組成，含有76個(gè)氨基酸的信號(hào)肽。小 鼠TNF基因位于17號(hào)染色體，也由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成，其前體由235個(gè)氨基 酸組成。人和小鼠TNF前體有79呢的同源性，切除信號(hào)肽后形成的成熟型人TNF-a由157 個(gè)氨基酸組成，分子量約為17KD，較小鼠成熟型TNF在73位多一個(gè)組氨酸殘基。人和 小鼠的成熟型TNF分子中相同位置上有兩個(gè)半胱氨酸(人69、 101位；鼠69、 IOO位)， 可以形成分子內(nèi)二硫鍵。從產(chǎn)生人TNF- a的細(xì)胞株培養(yǎng)上清中分離純化的TNF- a在非還 原的條件下分子量大小不等，在還原條件下分子量為17KD，與根據(jù)成熟型TNF氨基酸順 序推算的分子量理論值一致。這可能是因?yàn)門NF - a以不同程度的聚合體形式存在的原 因。目前己證實(shí)TNF活性形式是由3個(gè)17KD的亞基組成的三聚體。TNF-a是一種多功能的細(xì)胞因子。它除了能在體內(nèi)、外殺傷腫瘤細(xì)胞外，還具有誘 導(dǎo)炎癥反應(yīng)、抗病毒感染、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、促進(jìn)細(xì)胞增殖和活化等多種功能。TNF-a對(duì) 腫瘤具有直接抑制和細(xì)胞溶解作用，但不同腫瘤株對(duì)TNF-a的敏感性不同。TNF-a抗 腫瘤的機(jī)制不完全清楚，目前的研究結(jié)果表明TNF-a抗腫瘤的機(jī)制主要有(1)通過與腫瘤細(xì)胞TNF的表面受體結(jié)合而發(fā)揮細(xì)胞毒作用。目前已知的TNF受 體有兩種，TNFR I和TNFRII ，均為跨膜糖蛋白。TNFR I通過其胞漿區(qū)的約80個(gè)氨基酸殘基的死亡區(qū)(DD)介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。(2) 通過對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用，誘導(dǎo)凝血因子的表達(dá)，增加纖溶酶原抑制劑的 分泌，從而促進(jìn)血管內(nèi)凝血及血栓的形成，造成腫瘤組織的局部流血阻斷而發(fā)生壞死。(3) 通過介導(dǎo)殺瘤效應(yīng)細(xì)胞的作用和誘導(dǎo)腫瘤局部的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)殺瘤效應(yīng)細(xì) 胞的作用。在抗病毒方面，TNF- a可以選擇性的殺傷病毒感染的細(xì)胞，并對(duì)不同的病 毒感染具有不同的作用。如對(duì)VSV、 HSV等病毒具有抑制作用，但是對(duì)HIV具有促進(jìn)作 用。另外，TNF- a是重要的炎癥因子， 一方面它可以刺激內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)MHCI類抗原和 多種黏附分子的表達(dá)，促進(jìn)IL-1、 IL-6的表達(dá)，刺激內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞釋放一系列炎 癥介質(zhì)。另一方面TNF- a可促進(jìn)中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞黏附在內(nèi)皮細(xì)胞上， 從而參與炎癥反應(yīng)。TNF- a還能夠促進(jìn)T細(xì)胞和B細(xì)胞增值，促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生抗體； 活化單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，提高其殺傷活性；上調(diào)巨噬細(xì)胞MHCII類分子，提高其抗原 呈遞能力；提高巨噬細(xì)胞的吞噬能力增強(qiáng)ADCC作用。TNF - a還可以促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化，可以誘導(dǎo)骨髓樣白血病細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化， 促進(jìn)T細(xì)胞、B細(xì)胞的增殖，并對(duì)某些腫瘤細(xì)胞具有生長因子樣的作用，并協(xié)同EGF、 TOGF和胰島素的促增殖作用，促進(jìn)EGF受體的表達(dá)。 1. 2抗TNF-a治療雖然TNF-a自體內(nèi)具有多種生物學(xué)活性，但是研究發(fā)現(xiàn)，TNF-a在體內(nèi)持續(xù)、高水 平的表達(dá)時(shí)在多種疾病中發(fā)揮重要的作用，如惡液質(zhì)、胰島素抵抗、感染性休克、炎 癥反應(yīng)、自身免疫性疾病、移植抗宿主病等。TNF-a的這些負(fù)面作用也使其成為藥物研 究的重要靶點(diǎn)，研制TNF-a拮抗藥物為治療TNF-a水平增高相關(guān)疾病提供了一條好的途 徑。傳統(tǒng)的用于治療體內(nèi)TNF-ci的過量表達(dá)相關(guān)疾病的藥物主要有非甾類抗炎藥 (NSAIDS)，緩解疾病的抗風(fēng)濕藥物(DMARD)，皮質(zhì)甾類、免疫抑制劑和止痛劑。但 是這些藥物有的具有長期毒性，并且一些患者對(duì)此類藥物的治療不敏感。近年來， 一些 治療此類疾病的新藥相繼問世。主要有氨甲喋呤、來氟米特和一些生物制劑。氨甲喋 呤是一種葉酸類似物，其作用與免疫抑制和抗炎活性有關(guān)，但具有肝毒性。來氟米特是 Aventis公司開發(fā)的一種治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物，是一種免疫抑制劑，但在近年的臨床 用藥中發(fā)現(xiàn)，該藥也具有肝毒性，并且與出生缺陷有關(guān)。生物制劑主要是TNF-ci拮抗 藥物，經(jīng)臨床治療研究發(fā)現(xiàn)TNF-a拮抗藥物對(duì)此類疾病有較好的療效，并且具有較小 的副作用。目前，TNF- a拮抗藥物有infliximab、etanerc印t、adalimumab、CDP571和CDP870。其中■ infliximab、 etanerc印t禾口 adalimumab藥物已通過FDA批準(zhǔn)。Enbrel，屬名 Etanerc印t，是美國I腿nex和Wyeth-Ayerst Laboratories公司研制的基因重組 sT隨5與人IgGFc段的融合蛋白，可同時(shí)抑制TNF - a和TNF - P ， 1998年11月被FDA 批準(zhǔn)用于治療青少年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和腰肌炎，是第一個(gè)用于臨床上的基因工程可溶性受 體和抗TNF- a藥物。Remicade，屬名Infliximab,是Johnson & Johnson公司研制的 一種對(duì)人TNF- a具有中和活性的人鼠嵌和抗體，該抗體可變區(qū)為小鼠蛋白，而恒定區(qū) 則為人的蛋白序列，因此，其抗原性較小。Remicade可特異性結(jié)合可溶性及膜結(jié)合型TNF-a，從而抑制TNF-a引起的免疫及炎癥反應(yīng)，1999年11月該抗體被FDA批準(zhǔn)用來治療 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，后又被FDA批準(zhǔn)用來治療Crohn病，是第二個(gè)用于臨床上的基因工程抗 TNF - a藥物。Adalimumab是Abbott公司研制的一種具有TNF - a特異中和活性的重組 的完全的人IgGl單克隆抗體，比Remicade具有更小的抗原性，2002年12月被FDA批 準(zhǔn)用來治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，很快又被FDA批準(zhǔn)用來治療Crohn病，成為第三個(gè)用于臨床 上的基因工程抗TNF- d藥物。近年來，臨床研究表明抗TNF-ci在臨床治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié) 炎取得了較好的療效。2002年美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)發(fā)布的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療最新指南指 出，早期RA患者和使用DMARDS治療無效的患者對(duì)etanerc印t有效。使用足量氨甲喋呤 不能控制的進(jìn)行性活動(dòng)性的RA患者，etanerc印t和infliximab聯(lián)合使用有效，目前推 薦單獨(dú)使用infliximab或與氨甲喋呤聯(lián)合治療。Bang等]進(jìn)行了對(duì)照實(shí)驗(yàn)，研究了 Adalimumab對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Adaliraumab和氨甲喋呤聯(lián)合用藥 或單獨(dú)使用Adalimumab比安慰劑和氨甲喋呤聯(lián)合用藥或采用標(biāo)準(zhǔn)的治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié) 炎的方法有更高的ACR20、 ACR50和ACR70，使用Adalimumab可以明顯延緩關(guān)節(jié)損傷的 進(jìn)程，并且具有起效快、藥效持續(xù)時(shí)間長、耐受性好的優(yōu)點(diǎn)。TNF-a拮抗藥物治療除了可用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療外，也可應(yīng)用于其他TNF-a水平增高相關(guān)疾病的治療，如，惡病質(zhì)、克隆病、強(qiáng)直性脊柱炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、自 身免疫性皮膚病、移植抗宿主病、非感染性色素層炎和鞏膜炎等炎癥和自身免疫性疾病。雖然，在臨床上TNF- a單克隆抗體和可溶性受體具有較好的療效，但是，這些藥 物存在有用藥量大、需長期反復(fù)使用、易引起超敏反應(yīng)的缺陷。除此之外，昂貴的藥費(fèi) 也是阻礙此類藥物廣泛應(yīng)用的原因。據(jù)統(tǒng)計(jì)，臨床上每位接受Enbel治療的病人平均年 花費(fèi)為1. 5萬美元，接受Humiral或Remicade治療的病人平均年花費(fèi)為9萬美元，如 此昂貴的藥費(fèi)即使在發(fā)達(dá)國家也是難以負(fù)擔(dān)的。 2.治療性疫苗 2. 1研究進(jìn)展近年來，針對(duì)人類自身蛋白的單克隆抗體在治療急、慢性疾病的過程中顯示出了良 好的效果。但是，造價(jià)的昂貴和使用上的不便限制了單克隆抗體的廣泛應(yīng)用，因此，由 被動(dòng)地接受這種抗體蛋白轉(zhuǎn)向?qū)で筢槍?duì)人類自身蛋白的主動(dòng)免疫疫苗，既用主動(dòng)免疫的 治療方式替代被動(dòng)免疫，成為蛋白藥物的發(fā)展方向。目前，治療性疫苗的研究已成為一 個(gè)熱點(diǎn)，涉及很多疾病，如慢性病毒感染、過敏、腫瘤、阿爾海默茨病、糖尿病、高 血壓、肥胖癥以及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。治療性疫苗使人的免疫系統(tǒng)發(fā)生有利于患者的反應(yīng)。大部分的疫苗可以分為兩大 類 一類是誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生體液免疫反應(yīng)，產(chǎn)生抗體；另一類是誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生細(xì)胞免疫反 應(yīng)，產(chǎn)生細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTLs)。后一類治療性疫苗主要用于腫瘤和病毒感染性疾病 的治療。絕大多數(shù)的預(yù)防性疫苗都是通過誘導(dǎo)抗體的產(chǎn)生來保護(hù)機(jī)體的，這就證明通過誘導(dǎo) 抗體來治療感染性疾病是一種有效的治療方法。與預(yù)防性疫苗相比，治療性疫苗的發(fā)展 就要緩慢的多，直到近幾年治療性疫苗才看到成功的希望。同時(shí)，單克隆抗體在治療疾 病方面所取得的巨大成功預(yù)示著能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的治療性疫苗有著廣闊的發(fā) 展前景。實(shí)際上，已經(jīng)有動(dòng)物試驗(yàn)表明誘導(dǎo)出一定水平的內(nèi)源性特異性抗體來治療疾病 是可能的，如阻斷TNF-a以治療炎癥性疾病。人源化的抗TNF-a單克隆抗體已經(jīng)被證明在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和Crohn' s病 (節(jié)斷性回腸炎)方面十分有效。目前已經(jīng)有幾種TNF-a的阻斷劑上市，包括兩種單 克隆抗體(infliximab, adalimumab)和一種受體阻斷劑(etanerc印t)，它們正在幫 助成千上萬的病人減輕痛苦，而且年收入達(dá)到20億美元。所以阻斷過量表達(dá)的TNF-a 能夠達(dá)到治療疾病的效果。在動(dòng)物試驗(yàn)中已經(jīng)證實(shí)通過主動(dòng)免疫可以特異性誘導(dǎo)出 TNF-a的中和性抗體，而且誘導(dǎo)的抗體滴度足以治療動(dòng)物關(guān)節(jié)炎模型。其他的動(dòng)物試驗(yàn)表明，可以通過誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生高滴度抗體來治療以下疾病針對(duì)血 管緊張素的疫苗可以治療高血壓；針對(duì)IL-9的疫苗可以治療病原體引起的嗜酸性細(xì)胞增 多癥；針對(duì)IL-5的疫苗可以治療哮喘；針對(duì)N-methyl-D-aspartate rec印tor-1 (NMDAR1) 的疫苗可以治療中風(fēng)。另外，針對(duì)一些性激素如人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotro- pin HCG)的免疫可以降低婦女體內(nèi)的激素水平而達(dá)到避孕效果；針對(duì)促性 腺素釋放激素(GnRH)的疫苗可以用于治療晚期前列腺癌；在晚期胰腺癌病人中，利用 治療性疫苗誘導(dǎo)出針對(duì)胃泌素(gastrin)的抗體可以延長病人的生命。那么，治療性疫苗的研究中存在哪些問題呢？最近在針對(duì)阿爾海默茨病的治療性疫 苗的研制過程所發(fā)生的情況似乎對(duì)這個(gè)問題做了回答。阿爾海默茨病是一種看起來非常適合用治療性疫苗進(jìn)行治療的疾病，這種病的發(fā)病過程長達(dá)數(shù)年甚至數(shù)十年。如果能用 治療性疫苗誘導(dǎo)出持續(xù)時(shí)間較長的抗體的話，那么無疑是一種理想的治療方法，尤其是 這種病人經(jīng)常忘記吃藥。阿爾海默茨病的特征是大腦中斑塊的沉積，這種斑塊中含有Ae-肽，這種AP-肽 是從淀粉樣蛋白的前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)衍生來的。在編碼APP 的基因發(fā)生突變導(dǎo)致A 0 -肽的生成增加的人群中，阿爾海默茨病在早年就開始發(fā)生了 。 表達(dá)這種突變的APP的轉(zhuǎn)基因小鼠大腦內(nèi)有大量的斑塊沉積，這種斑塊與阿爾海默茨病 病人腦中發(fā)現(xiàn)的斑塊相似。用AP-肽加上強(qiáng)免疫佐劑來免疫這種轉(zhuǎn)基因小鼠會(huì)使小鼠腦 中的斑塊減少，小鼠的精神表現(xiàn)明顯好轉(zhuǎn)。隨后， 一種針對(duì)阿爾海默茨病的治療性疫 苗開始了臨床試驗(yàn)，在臨床I期試驗(yàn)證明其有良好的耐受性后，包括300多名病人的臨 床II期緊跟著開始了，但是沒有想到的是6%的試驗(yàn)對(duì)象由于產(chǎn)生無菌性腦炎而被迫停 止試驗(yàn)。隨后研究證實(shí)，這種副作用與抗體的滴度沒有關(guān)系，實(shí)際上， 一名沒有產(chǎn)生抗 體反應(yīng)的受試病人也得了無菌性腦炎。另外，在一名病人的大腦中發(fā)現(xiàn)有大量的淋巴細(xì) 胞浸潤。這些研究結(jié)果與一種假說相一致，那就是在病人中發(fā)現(xiàn)的副作用是由于AP-肽特異性的T淋巴細(xì)胞引起的，而不是由于抗體引起的。這就要求能夠研制出不引起T 淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫的第二代疫苗。那么，這種針對(duì)阿爾海默茨病的治療性疫苗的 效果如何呢？在前面提到的臨床II期試驗(yàn)中，在誘導(dǎo)出抗A P -肽抗體的病人中有一部分 認(rèn)知力的減弱確實(shí)推遲了，有一些病人甚至在接受治療的這一年中意識(shí)狀態(tài)有了好轉(zhuǎn)。 如果在疫苗設(shè)計(jì)時(shí)能夠解決其安全性問題，那么在不久的將來，針對(duì)阿爾海默茨病的治 療性疫苗就會(huì)出現(xiàn)。另一類稍有不同的疫苗對(duì)安全性的要求更低一些，那就是針對(duì)上癮藥物的疫苗。在 動(dòng)物試驗(yàn)中針對(duì)可卡因和尼古丁的疫苗降低了這些藥物在大腦中的水平，消除了它們的 成癮癥狀，試驗(yàn)動(dòng)物在接受了免疫后對(duì)藥物不再依賴。在臨床I期試驗(yàn)中，可卡因疫苗 被證明有良好的耐受性，并且可以誘導(dǎo)出良好的抗體反應(yīng)，現(xiàn)在，人們正在翹首以待它 的有效性結(jié)果。2. 2誘導(dǎo)自身抗體的理論研究針對(duì)自身蛋白的治療性疫苗是如何誘導(dǎo)自身免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對(duì)自身蛋白的抗體 呢？要產(chǎn)生足夠高的滴度的特異性抗體以治療相關(guān)疾病，治療性疫苗必須克服三個(gè)障 礙T細(xì)胞耐受、B細(xì)胞耐受、在沒有佐劑和抗原長效制劑的情況下誘導(dǎo)出抗體。眾所 周知，人體免疫系統(tǒng)主要是對(duì)外來入侵者發(fā)動(dòng)攻擊的，而對(duì)機(jī)體本身是不攻擊的，這可 能是由于機(jī)體具有能夠識(shí)別"非我"與"自我"的能力。免疫系統(tǒng)的這種特性通常被稱為耐受或無反應(yīng)性。耐受發(fā)生在B細(xì)胞和T細(xì)胞水平。 一般來說，T細(xì)胞耐受更嚴(yán)格一 些。對(duì)許多抗原來說，在發(fā)生T細(xì)胞耐受的同時(shí)，正常的B細(xì)胞株卻在體內(nèi)存在。實(shí)際 上，有三種機(jī)制導(dǎo)致了免疫耐受細(xì)胞株剔除，即特異性的淋巴細(xì)胞從淋巴細(xì)胞群中被 徹底剔除；免疫無能，即特異性的淋巴細(xì)胞存在，但其功能不能被激活；免疫忽略，即 具有免疫功能的淋巴細(xì)胞存在，但是由于沒有遇到以抗原形式存在的自身抗原，所以不 能被激活。對(duì)T細(xì)胞來說，誘導(dǎo)耐受和無能的主要器官是胸腺(中心耐受)，但誘導(dǎo)耐 受也可以在外周進(jìn)行。B細(xì)胞耐受主要在骨髓中誘導(dǎo)，但也可在外周誘導(dǎo)。通常，對(duì)于 普遍表達(dá)的豐富抗原的免疫耐受更容易闡明。在針對(duì)外來抗原的免疫反應(yīng)中，T細(xì)胞和B細(xì)胞互相配合才能有效地產(chǎn)生抗體當(dāng) 受到外來抗原免疫時(shí)，特異性的B細(xì)胞結(jié)合抗原，產(chǎn)生起始的激活信號(hào)。另外，B細(xì)胞 內(nèi)吞抗原，在其表面呈現(xiàn)抗原肽和MHCII類分子的復(fù)合物。通常，B細(xì)胞不能激活TH細(xì) 胞。要激活TH細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞是必不可少的，樹突狀細(xì)胞攝取抗原，并在其細(xì)胞表 面呈遞抗原肽和MHCII類分子的復(fù)合物，激活TH細(xì)胞。激活后的TH細(xì)胞識(shí)別B細(xì)胞表 面呈現(xiàn)的抗原肽和MHCn類分子的復(fù)合物，引起B(yǎng)細(xì)胞增殖、抗體的產(chǎn)生以及抗體類別 的轉(zhuǎn)換。如果因?yàn)槊庖吣褪芏狈H細(xì)胞的協(xié)同作用，那么就不會(huì)產(chǎn)生抗體。在針對(duì) 自身蛋白的疫苗的設(shè)計(jì)過程中，如果將自身抗原與外源蛋白或多肽載體融合或偶聯(lián)在一 起，就有可能繞過TH細(xì)胞耐受自身抗原特異性的B細(xì)胞就能夠攝取該自身抗原以及 與其相連的載體蛋白，并在其表面呈現(xiàn)載體肽與MHCII類分子的復(fù)合物，由于TH細(xì)胞對(duì) 載體蛋白沒有免疫耐受，所以能夠被激活，從而協(xié)同自抗原特異性的B細(xì)胞產(chǎn)生針對(duì)自 身抗原的特異性抗體。與T細(xì)胞耐受相比，B細(xì)胞耐受要寬松得多。實(shí)際上，在許多情況下，自身特異性B 細(xì)胞在體內(nèi)以正常的頻率出現(xiàn)，如果受到抗原和TH細(xì)胞的共同作用就會(huì)被激活。所以對(duì) 許多可溶性自身蛋白來講，體內(nèi)存在其特異性B細(xì)胞株，尤其當(dāng)這種蛋白不是非常富余 表達(dá)的時(shí)候更是這樣。對(duì)于這類蛋白或多肽，將其與載體蛋白相連，繞過T細(xì)胞耐受， 就有可能產(chǎn)生有效的疫苗。實(shí)際上，利用這種策略，針對(duì)多種自身激素的抗體反應(yīng)已經(jīng) 被誘導(dǎo)出來了。3、 TNF-a自體疫苗的研究進(jìn)展目前，TNF-ci疫苗研究主要集中在篩選TNF-ci抗原表位、融合蛋白疫苗和DNA疫苗 幾個(gè)方面。Sioud等用人TNF純化類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人的抗血清，得到具有TNF-a中和活 性的TNF-a自身抗體，用此抗體篩選噬菌體隨機(jī)九肽庫，用篩選得到的噬菌體顆粒免疫 小鼠，誘發(fā)了鼠抗人TNF-a抗體，研究表明重組噬菌體可作為疫苗研究的有效工具。Dalum等用T輔助細(xì)胞表位和TNF- a融合表達(dá)的蛋白免疫二型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎小鼠模 型，結(jié)果小鼠的癥狀得到了緩解，為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和慢性感染疾病的治療開辟了一條新 途徑。Blank等用編碼TNF- a的DNA免疫抗磷脂綜合癥的小鼠，在小鼠體內(nèi)誘發(fā)了抗TNF-a抗體，這些抗體可以阻滯TNF-a引起的內(nèi)皮細(xì)胞活性，抑制了單核細(xì)胞對(duì)活化的內(nèi)皮 細(xì)胞的黏附，與對(duì)照組相比可以明顯的改善抗磷脂綜合癥小鼠的癥狀。Waterston等比 較了TNF-a單克隆抗體和TNF-a自體疫苗在治療腫瘤轉(zhuǎn)移的效果，結(jié)果表明兩者在小鼠 體內(nèi)都可成功的減少肺腫瘤的轉(zhuǎn)移。近來Waterston等通過一期臨床試驗(yàn)評(píng)估了 TNF-a 自體疫苗的免疫原性和安全性，不幸的是盡管疫苗誘發(fā)的血清抗體可以識(shí)別變性的人 TNF-a分子，但是卻不能中和天然狀態(tài)的人TNF-a分子，分析原因可能是因?yàn)榭乖募兓^程中是抗原變性的原因。以上研究表明，雖然TNF- a自體疫苗也是一種治療TNF- a表達(dá)過高相關(guān)疾病的好方 法，但是，篩選有效的T細(xì)胞輔助表位，適合的表位插入位置以及適合純化方法都成為 TNF-a自體疫苗研究的關(guān)鍵性問題。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于，提供一種篩選出一種人TNF-a自體疫苗分子，使之在體內(nèi)誘 導(dǎo)出針對(duì)人TNF- a分子的特異性抗體的治療性疫苗，為TNF- a表達(dá)過高的相關(guān)疾病提供 一種新的治療藥物。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是首先對(duì)小鼠TNF-a基因系列截短，將其克隆入pGEX-4T-l原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大 腸桿菌。在大腸桿菌中獲得高效表達(dá)，菌體蛋白走SDS-PAGE后，切膠免疫小鼠，通過對(duì) 誘導(dǎo)的抗體滴度的分析結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)確定T輔助表位的插入位置為小鼠TNF126 位至140位氨基酸序列，相應(yīng)人TNF127位至141位氨基酸。利用人工合成的方法用編碼TT830-844 ( QYIKANSKFIGITEL ) 、 HEL46-61 (NTDGSTDYGILQINSR)和PADRE (AKFVAAWTLKA)氨基酸的基因序列替換編碼小鼠TNF-a 126位至140位氨基酸序列的核酸，從而獲得mTNF-TT, mTNF-HEL， mTNF-PADRE基因 片段，將其插入pBV220原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。在大腸桿菌中獲得高效表達(dá)，經(jīng) 純化后得到mTNF-TT, mTNF-HEL, mTNF-PADRE蛋白。本發(fā)明構(gòu)建出的三種TNF-a融合蛋白疫苗，用該蛋白進(jìn)行免疫后，在小鼠體內(nèi)可產(chǎn) 生高滴度的抗mTNF-ci自身抗體，并且該抗體的血清能夠在體外中和mTNF-a對(duì)L929細(xì) 胞的殺傷作用。比較這三種分子誘導(dǎo)針對(duì)mTNF-a自身抗體的滴度，篩選出mTNF-PADRE 具有最好的免疫效果。用mTNF-PADRE重組蛋白免疫小鼠可以減輕mTNF- a誘導(dǎo)的惡病質(zhì)小鼠，LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠的以及二型膠原誘導(dǎo)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的癥狀。將構(gòu)建好的pBV220-mTNF-TT， pBV220-mTNF-HEL， pBV220-mTNF-PADRE質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸 桿菌，在大腸桿菌中獲得高效表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)裂菌、溶解包涵體、凝膠柱純化，蛋白純度可達(dá)95%以上。純化后的 mTNF-TT， mTNF-HEL， mTNF-PADRE蛋白在體外能夠與小鼠TNF-a多克隆抗體結(jié)合，并且 失去了小鼠TNF-a的生物活性。用純化的mTNF-TT， mTNF-服L， mTNF-PADRE蛋白免疫小 鼠，比較抗血清，mTNF-PADRE具有最好的免疫效果。在小鼠體內(nèi)經(jīng)mTNF-PADRE蛋白免 疫后，能夠減輕mTNF-ci誘導(dǎo)的惡病質(zhì)小鼠，LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠的以及二型膠原 誘導(dǎo)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的癥狀。本發(fā)明中的mTNF-TT， mTNF-HEL ， mTNF-PADRE蛋白的制備方是人工合成 mTNF-TT830-844， mTNF-HEL46_61 ， mTNF-PADRE基因片段，將該片段插入pBV220載體中 構(gòu)建mTNF-TT830-844 , mTNF-HEL46-61 , mTNF-PADRE蛋白基因；含有目的基因 mTNF-TT830-844， mTNF-HEL46_61, mTNF-PADRE的原核表達(dá)載體的構(gòu)建及重組蛋白表達(dá)； 表達(dá)產(chǎn)物的鑒定；重組蛋白的純化；mTNF-TT830-844， mTNF-HEL46_61， mTNF-PADRE蛋 白免疫小鼠后產(chǎn)生的抗血清與小鼠TNF-a的結(jié)合作用；該抗血清在體外可以中和小鼠 TNF-a對(duì)L929細(xì)胞的殺傷；比較這三種分子誘導(dǎo)針對(duì)mTNF-a自身抗體的滴度，篩選出 mTNF-PADRE具有最好的免疫效果。本發(fā)明篩選的重組小鼠mTNF-PADRE蛋白，通過免疫小鼠可以突破小鼠的免疫限制， 產(chǎn)生高滴度抗小鼠TNF-a自身抗體，其對(duì)應(yīng)的重組人TNF-PADRE融合蛋白從而有可能在 人體內(nèi)產(chǎn)生抗人TNF-a自身抗體，為TNF-a表達(dá)過高的相關(guān)疾病的免疫治療提供一種新 的蛋白質(zhì)藥物。該自體疫苗的應(yīng)用目的在于以TNF-a為靶點(diǎn)篩選獲得一種能夠促使體內(nèi)產(chǎn)生針對(duì) TNF-a分子的中和抗體的自體疫苗，從而研究應(yīng)用主動(dòng)免疫的方法進(jìn)行TNF-a表達(dá)過高 的相關(guān)疾病的免疫治療。進(jìn)而減少單抗副作用，減輕病患負(fù)擔(dān)。


圖l是GST融合小鼠TNFa系列截短體表達(dá)質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果，圖中的標(biāo)號(hào)為1、 DL2000, 2、 <formula>formula see original document page 11</formula>酶切鑒定結(jié)果，3、 <formula>formula see original document page 11</formula>酶切鑒定結(jié)果，4、 <formula>formula see original document page 11</formula>酶切鑒定結(jié)果，5、 <formula>formula see original document page 11</formula>酶切鑒定結(jié)果，6、 <formula>formula see original document page 11</formula>酶切鑒定結(jié)果，7、 <formula>formula see original document page 11</formula>酶切結(jié)果。圖2是GST融合小鼠TNFa系列截短體IPTG誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果圖中的標(biāo)號(hào)為1、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，2、pGEX-4T-l-mTNFa/ DH5alPTG誘導(dǎo)，3、pGEX-4T-l-mTNFal-149/ DH5alPTG 誘導(dǎo)，4、 pGEX-4T-l-mTNFal-122/DH5alPTG誘導(dǎo)，5、 pGEX-4T-l-mTNFal-67/DH5alPTG 誘導(dǎo)，6、 pGEX陽4T-l-mTNFal-39/DH5alPTG誘導(dǎo)，7、 pGEX-4T-l-mTNFa/DH5a未誘導(dǎo)。 圖3是GST融合小鼠TNFa系列截短體的Western Blot鑒定結(jié)果；圖中的標(biāo)號(hào)為1、 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，2、 pGEX-4T-l-mTNFa/ DH5alPTG誘導(dǎo)，3、 pGEX-4T-l-mTNFal-149/ DH5alPTG誘導(dǎo)，4、 pGEX-4T-l-mTNFal-122/DH5alPTG誘導(dǎo)，5、 pGEX隱4T-l-mTNFal-67/ DH5alPTG誘導(dǎo)，6、 pGEX-4T-l-mTNFal-39/ DH5alPTG誘導(dǎo)，7、 pGEX-4T-l-mTNFa/ DH5a 未誘導(dǎo)。圖4是mTNFa及GST融合小鼠TNFa系列截短體的切膠定量，圖中的標(biāo)號(hào)為，1、 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，2、 GST-mTNFa， 3、 GST-mTNFal-149， 4、 GST-mTNFal-122， 5、 GST-mTNFal-67， 6、 GST-mTNFal-39， 7、 mTNFcu圖5是mTNFa及GST融合小鼠TNFtt系列截短體免疫抗血清的鑒定。圖6是小鼠和人TNF- a抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)果。其中(A)是小鼠TNF- a抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)果， (B)是人TNF-a抗原表位預(yù)測(cè)結(jié)果；圖7是pBV220-mTNF-TT、 pBV220-mTNF-HEL、 PBV220-mTNF-PADRE表達(dá)載體質(zhì)粒酶切圖。 A pBV220-TNF-TT酶切鑒定結(jié)果1、 DL2000, 2、 pBV220iTNF-TT ￡bof I和尸W I酶切結(jié)果， 3、 pBV220I和尸W I酶切結(jié)果；B pBV220_mTNF-HEL和pBV220-mTNF-PADRE酶切鑒定 結(jié)果1、 DL2000, 2、 pBV220-mTNF-HEL fcoWI和5kH酶切鑒定結(jié)果，3、 pBV220-mTNF-PADRE I和I酶切鑒定結(jié)果，4、 pBV220 fcoy I和I酶切結(jié)果。圖8是pBV220-mTNF-TT/ DH5 a ， pBV220-mTNF-HEL/ DH5 a和pBV220-mTNF-PADRE/ DH5 a 誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果。圖中的的標(biāo)號(hào)為l、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，2、 pBV220-mTNF-TT/DH5 a未誘導(dǎo)， 3、pBV220-mTNF-TT/ DH5 a誘導(dǎo)，4、pBV220-mTNF_HEL/DH5 a誘導(dǎo)，5、pBV220-mTNF-PADRE/ DH5a誘導(dǎo)。圖9是mTNF-TT、 mTNF-HEL、 mTNF-PADRE的純化結(jié)果，圖中的標(biāo)號(hào)為Al mTNF-TT過凝膠柱層析圖。Bl mTNF-TT過凝膠柱SDS-PAGE結(jié)果1、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，2、 上柱前，3、峰l， 4、峰2 (目的蛋白峰)，5、 mTNF-TT復(fù)性后；A2 mTNF-HEL過凝 膠柱層析圖。B2 mTNF-HEL過凝膠柱SDS-PAGE結(jié)果1、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，2、上柱前，3、 峰l， 4、峰2， 5、峰3 (目的蛋白峰)，6、 mTNF-HEL復(fù)性后；A3 mTNF-PADRE過凝 膠柱層析圖。B3 mTNF-PADRE過凝膠柱SDS-PAGE結(jié)果1、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，2、上柱前， 3、峰l, 4、峰2 (目的蛋白峰)，5、 mTNF-PADRE復(fù)性后。*為目的蛋白峰。圖10是mTNF-TT、 mTNF-HEL、 mTNF-PADRE、 mTNF純化蛋白的Western-blot鑒定，其中，l、蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，2、 pBV220-mTNF-TT/ DH5a未誘導(dǎo)，3、 mTNF-TT純化蛋白，4、 mTNF-HEL純化蛋白，5、 mTNF-PADRE純化蛋白，6、 mTNF純化蛋白。 圖ll是mTNF-TT、 mTNF-HEL、 mTNF-PADRE的生物活性鑒定； 圖12是mTNF-TT、 mTNF-HEL和mTNF-PADRE誘導(dǎo)的抗血清比較，A結(jié)合活性比較在1000倍和10， 000倍稀釋時(shí)，mTNF-PADRE組P<0.05 vs. mTNF-TT組，PO.01vs. mTNF-HEL組；B中和活性比較在2倍和4倍稀釋時(shí)，mTNF-PADRE組p<0.05 vs.mTNF-TT組，p<0.01 vs. mTNF-HEL組。圖13是mTNF-PADRE自體疫苗分子對(duì)惡病質(zhì)小鼠疾病模型的治療，其中，A、體重比較*P<0.05， **P<0.02， ***P<0.01; B、生存率比較mTNF-PADRE組P<0.05 vs生理鹽水組。圖14是mTNF-PADRE自體疫苗分子對(duì)內(nèi)毒素休克小鼠疾病模型的生存期的影響，其中， 生存率比較mTNF-PADRE組P<0.05 vs生理鹽水組，mTNF-PADRE plus with adjuvant組 P>0.05 vs生理鹽水組。圖15是mTNF-PADRE自體疫苗分子對(duì)二型膠原誘導(dǎo)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎小鼠發(fā)病率和小 鼠發(fā)病肢數(shù)影響，其中，A 。 二型膠原誘導(dǎo)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎小鼠發(fā)病率，B、 二型膠原誘 導(dǎo)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎小鼠小鼠發(fā)病肢數(shù)；圖16是mTNF-PADRE對(duì)CIA小鼠關(guān)節(jié)炎后足足厚的影響(*P<0.05)。圖17是mTNF-PADRE自體疫苗分子對(duì)二型膠原誘導(dǎo)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎小鼠關(guān)節(jié)評(píng)分的 影響。圖18是小鼠膝關(guān)節(jié)和踝關(guān)節(jié)病理檢測(cè)。 以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
具體實(shí)施方式
依照本發(fā)明的技術(shù)方案制備的人TNF治療性自體疫苗，首先篩選TNF分子的外源T 輔助表位插入位置，利用小鼠TNF- a系列截短體構(gòu)建與GST融合表達(dá)的系列融合蛋白， 切膠免疫小鼠，通過對(duì)誘導(dǎo)的抗體滴度的分析結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)確定T輔助表位的插 入位置為小鼠TNF126位至140位氨基酸，相應(yīng)人TNF的127-141位氨基酸；然后篩選適 合的外源T輔助表位，用編碼TT830-844 ( QYIKANSKFIGITEL ) ， HEL46-61 (NTDGSTDYGILQINSR)和PADRE (AKFVAAWTLKA)氨基酸的核酸序列替換小鼠TNF-a 126 位至140位氨基酸的核酸序列，從而獲得mTNF-TT、 mTNF-HEL、 mTNF-PADRE融合蛋白， 純化后免疫小鼠，比較這三種分子誘導(dǎo)針對(duì)mTNF-a自身抗體的滴度和體外中和mTNF-a活性的能力，篩選出mTNF-PADRE具有最好的免疫效果。用mTNF-PADRE重組蛋白免疫小鼠不僅可以減少mTNF- a誘導(dǎo)的惡病質(zhì)小鼠體重的減輕，同時(shí)還可以延長mTNF- a誘導(dǎo) 的惡病質(zhì)小鼠的生存期；延長LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠的生存期；減輕二型膠原誘導(dǎo) 的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的癥狀。其對(duì)應(yīng)的重組人TNF-PADRE融合蛋白從而有可能在人體內(nèi)產(chǎn) 生抗人TNF- a自身抗體，為TNF- a表達(dá)過高的相關(guān)疾病的免疫治療提供一種新的蛋白質(zhì) 藥物。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明疫苗的篩選，疫苗構(gòu)建和純化，免疫動(dòng)物，抗體檢定以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)工作， 按以下步驟完成 1.疫苗的制備和篩選 1. 1疫苗表位插入位置的篩選 1.1.1 GST-mTNF系列截短體表達(dá)載體的構(gòu)建依照小鼠TNF-a的氨基酸序列和大腸桿菌偏愛密碼子設(shè)計(jì)小鼠TNF-a的基因序列，交上海生工生物技術(shù)有限公司全基因合成，合成的基因克隆入pUC57中構(gòu)建含有小鼠 TNF- a的克隆載體pUC57-mTNF- a 。設(shè)計(jì)引物對(duì)克隆載體pUC57-mTNF- a進(jìn)行PCR獲得上 游含有EcoRl酶切位點(diǎn)，下游含有Sall酶切位點(diǎn)和終止密碼子的小鼠TNF-a的全長基 因和系列小鼠TNF-ci截短體基因，截短從小鼠TNF-ci的C端開始，截短位置為149位， 122位，67位和39位氨基酸，克隆入載體pGEX-4T-1中。構(gòu)建pGEX-4T-1-mTNF-a ， pGEX-4T-卜mTNF- a 149 , pGEX-4T-1-mTNF- a 122 ， pGEX-4T-l_mTNF- a 67 和 pGEX-4T-1-mTNF- a 39融合蛋白表達(dá)載體。構(gòu)建的質(zhì)粒載體分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5 a ， 挑取單克隆培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定獲得預(yù)期大小的插入片段(圖l),進(jìn)行測(cè) 序。工程菌命名為pGEX-4T-1-mTNF- a /DH5a ， pGEX-4T-1-mTNF- a 149/DH5a ， pGEX-4T-l-mTNF- a 122/DH5 a ， pGEX_4T-1-mTNF- a 67/DH5 a和pGEX-4T-1-mTNF- a 39/DH5 a 。全長小鼠TNF-a的基因序列為CTCCGTTCATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCACGTCGTAGCAAACCACCAAGTGGAGGAGAGAAGGGTGACCAACTCAGCGCTGAGGTCAATCTGCCGAAGTACTTAGACTTTGCGGAGTCCGGTCAGGTCTACTTTGGCGTTATTGCTCTG1.1.2重組蛋白表達(dá)挑取工程菌單菌落接種于5mLLB培養(yǎng)液(含AmplOOmg/L)中，37'C搖床培養(yǎng)過夜， 次日以l: IOO的比例轉(zhuǎn)接到含A卿的LB培養(yǎng)液中，在37'C搖床培養(yǎng)3h至對(duì)數(shù)生長中 期(ODe。。為0.4 0.6)，加入終濃度為lmmol/L的IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)4h。離心收集菌體。 1.1.3表達(dá)產(chǎn)物的鑒定 1.1.3.1SDS-PAGE鑒定取少許菌體蛋白加入30 u L水和30u L 2X載樣緩沖液，混勻。沸水中煮5min， 12000 rpm離心5 min,取10 y L上清加樣于15%分離膠6%濃縮膠，電壓160 V約lh，用0. 5% 考馬斯亮蘭R-250振蕩染色2 -3 h，脫色直至背景清晰后制備千膠保存(圖2)。 1.1.3.2免疫印跡反應(yīng)SDS-PAGE結(jié)束后，按Bio-Rad產(chǎn)品說明，凝膠靠近陰極一側(cè)，硝酸纖維膜(NC膜) 靠近陽極一側(cè)，置轉(zhuǎn)移緩沖液中(25 mmol/L Tris、 192 mmol/L Glycine、 20%甲醇)， 100V恒壓lh,將蛋白從凝膠電轉(zhuǎn)移至NC膜上，電轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出NC膜，用洗滌液 TBST (含0. 02 mol/L pH7. 4 TBS、 0. 4% Tween20)室溫洗3次，浸入封閉液(含2% BSA 的TBST)中37'C， lh，洗漆液(TBST)室溫洗3次，加入羊抗小鼠TNF-a多克隆抗體， 37'C孵育lh， TBST室溫洗膜3次，加入兔抗羊IgG-AP 二抗，37'C孵育1 h， TBST室溫 洗膜3次，再用TBS洗3次，NC膜浸入顯色液中，室溫避光顯色5min，蒸餾水沖洗終 止反應(yīng)(圖3)。 1.1.4融合蛋白抗原的制備用己知量的人血清白蛋白作為對(duì)照，走SDS-PAGE對(duì)以上系列融合蛋白進(jìn)行定量分 析(圖4)，對(duì)目的蛋白條帶進(jìn)行切膠，充分研磨后，稀釋至相同濃度免疫BALB/C小鼠。 1.1. 5動(dòng)物免疫1. L 5.1 BALB/C小鼠分組與免疫方案分組將35只雄性BALB/C小鼠分成7組，分別為GST切膠對(duì)照組，天然mTNF組， GST-mTNF組，GST- mTNF149組，GST-mTNF122組，GST-mTNF67組，GST-mTNF39組。在 第4次免疫后10天摘眼球采血，測(cè)定血清中抗mTNF抗體效價(jià)。免疫方案背部皮下多點(diǎn)注射；融合蛋白30yg/只；溶液總體積為200 P L/只，分 別隔周注射。1.1. 5. 2抗血清ELISA鑒定在第4次免疫后10天采血，收集抗血清，通過間接ELISA測(cè)定血清抗mTNF抗體效 價(jià)。ELISA實(shí)驗(yàn)方法如下-所需溶液的配制a. 包被緩沖液: 碳酸鹽緩沖液取Na2CO3: 0.32g(終濃度0.015mol/L), NaHCO3: 0.59g(終濃度 0.035mol/L), 純水定容至200mL(pH 9.6), 有效期: 兩周.
b. 洗滌液: 含0.5%Tween-20的PRS (pH 7.4).
c. 封閉液: 含1%BSA的洗滌液.
d. 稀釋液: 含0.5%BSA的洗滌液.
e. 底物緩沖液: Na2PHO4.12H2O: 1.84g, 檸檬酸: 0.51g純水定容至100mL(pH 5.0).
f. 底物顯色液: OPD: 8mg, 3% H2O2: 30 uL.
h. 終止液: H2SO4:１mol/L.
操作方法
包被取96孔ELISA板, 小鼠TNF-a蛋白溶解于包被緩釋液中(0.5ug/mL), 按100uL/孔加入孔板中. 4.C包被過夜.
然后倒掉包被緩釋液加入封閉液, 室溫封閉2h;
棄去封閉液, 用洗滌液洗6次, 每次2min;
分別加入倍比稀釋的小鼠人抗B7-H1單抗(500ug/mL)和抗血清, 100uL/孔, 室溫孵育1h;
棄去單抗和抗血清, 用洗滌液洗滌6次, 每次3min;
加入底物顯色液, 100uL/孔, 室溫, 顯色10min-20min;
加入終止液, 50uL/孔, 終止反應(yīng);
酶標(biāo)儀讀數(shù), 測(cè)定每孔在490nm的吸光值.
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示, 隨小鼠TNF-a從C端的逐步截短, 誘發(fā)的抗血清對(duì)小鼠TNG-a的抗體滴度逐步增加, 截短至67位截短體時(shí)抗體滴度為最高, 繼續(xù)截短抗體滴度下降, 說明TNF-a的N端有誘導(dǎo)自身抗體的重要表位.
1.1.6 計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)預(yù)測(cè)TNG-a抗原表位
用Kolaskar和Tongaonkar方法對(duì)小鼠和人TNG-a的抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè), 結(jié)果如圖6所示, 人和小鼠的TNG-a在10-21, 32-38, 111-125, 146-153氨基酸序列處具有共同的抗原表位.
1.1.7 疫苗表位插入位置的選擇
結(jié)合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 為了插入的外源T輔助表位不破壞TNG-a本身的抗原表位, 我們選擇小鼠TNG-a126-144位氨基酸為外源表位插入位置, 經(jīng)同源比對(duì)對(duì)應(yīng)人TNG-a的外源T輔助表位插入位置為人TNG-a127-144位氨基酸.1.2插入的抗原表位的篩選1.2.1小鼠TNF-TT， TNF-HEL和TNF-PADRE的構(gòu)建用編碼TT，服L， PADRE氨基酸的基因分別替換編碼小鼠TNF-a 126-140位氨基酸的 基因，從EcoR I和Sal酶切位點(diǎn)克隆入pBV220表達(dá)載體，構(gòu)建了 pBV220-mTNF-TT， pBV220-mTNF-HEL和pBV220-mTNF-PADRE表達(dá)載體，序列中EcoR I至Bgl II酶切位點(diǎn)為 小鼠TNF 1-125位氨基酸的基因序列，Bgl II至Nde I酶切位點(diǎn)為TT， HEL或PADRE氨 基酸的基因序列，Nde I至Sal I酶切位點(diǎn)為小鼠TNF-a 140-156氨基酸的基因序列， Bgl II和Nde I酶切位點(diǎn)用于克隆時(shí)表位的置換。構(gòu)建的質(zhì)粒載體分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞 DH5a，挑取單克隆培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定獲得預(yù)期大小的插入片段(圖7)， 進(jìn)行測(cè)序。工程菌命名為pBV220-mTNF-TT/DH5 a ， pBV220-mTNF-HEL/DH5 a 和 pBV220-mTNF-PADRE/DH5 a 。全長小鼠TNF-TT的基因序列(劃線部分為TT表位的核酸序列，加粗部分分別為Bgl II和Nde I酶切位點(diǎn))GTCTACTTTGGCGTTATTGCTCTG全長小鼠TNF-HEL的基因序列為(劃線部分為HEL表位的核酸序列，加粗部分分別 為Bgl II和Nde I酶切位點(diǎn))AGGACACCCCTGAGGGTGCTGAGCTCAAACCGTGGTATGAGCCGATCTACCTGGGCGGTGTCTTCCAGCTGAGATCCAGGTCTACTTTGGCGTTATTGCTCTG全長小鼠TNF-PADRE的基因序列為(劃線部分為PADRE表位的核酸序列，加粗部分 分別為Bgl II和Nde I酶切位點(diǎn))TTTGGCGTTATTGCTCTG1.2.2重組蛋白表達(dá)挑取工程菌單菌落接種于5mLLB培養(yǎng)液(含AmplOOmg/L)中，30'C搖床培養(yǎng)過夜， 次日以l: lOO的比例轉(zhuǎn)接到含Amp的LB培養(yǎng)液中，在30'C搖床培養(yǎng)3h至對(duì)數(shù)生長中 期(0De。。為0.4 0.6)， 42。C升溫誘導(dǎo)培養(yǎng)4h。離心收集菌體。SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)結(jié)果 (圖8)，在預(yù)期位置由新生條帶產(chǎn)生。 1.2.3重組蛋白的純化10克菌體蛋白懸浮于100ml裂菌緩沖液中(50mM Tris - HC1， pH 8. 0， 150mMNaCl)。 在冰浴中超聲15min (工作5sec，間隔10sec，功率300w)， 12, 000 rpm離心30min收集沉 淀。收集的裂菌沉淀用100ml飽含體洗滌液(4M Urea， l%Triton X-100， 5mM EDTA， 5mMP-mercaptoethanol， 50mMTris-HC1 pH8. 5)洗滌兩次，每次洗滌30min， 12， 000 rpm離心30min收集沉淀。洗滌后的沉淀用包涵體溶解液(20mM P iercaptoethanol ， 7M guanidine hydrochloride)溶解過夜，12， 000 rpm離心30 min收集上清。lml的TNF-TT包涵體溶解 上清以0.3ml/min的流速過S印hacry1-IOO層析柱(2.4 X70cm)， TNF-PADRE和TNF-HEL 包涵體溶解上清以O(shè). 5 ml/min的流速過S印hacry1-300層析柱(2. 4 X 100cm)，流動(dòng)相均 為50mM Tris-HCl， pH8.5， 8M urea， 100mM NaCl。收集目的峰，對(duì)復(fù)性液(10mM Tris-HCl， pH8. 5， 1/1000 (v/v) 3-mercaptoethanol， 1/105 (v/v) 0. 5MCuS04) 透析8hor復(fù)性，之后對(duì)雙蒸水透析過夜。Lowry法測(cè)定蛋白濃度。純化結(jié)果如圖9所示。 1.2.4重組蛋白的鑒定 1.2.4.1免疫原性及純度的鑒定純化的蛋白樣品經(jīng)15% SDS-PAGE，然后從凝膠電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，BSA封閉后， 用一抗(山羊抗小鼠TNF多克隆抗體)結(jié)合lhor， 二抗(兔抗山羊IgG-AP)結(jié)合30min， 最后用AP底物室溫避光顯色5min,蒸餾水沖洗終止反應(yīng)。結(jié)果顯示mTNF-TT, mTNF-HEL， raTNF-PADRE可以特異的和山羊抗小鼠TNF多克隆抗體結(jié)合(圖10)。純化得到的TNF-TT、 TNF-HEL、 TNF-PADRE進(jìn)行純度鑒定。色譜柱為排阻色譜柱 (7. 5mmX 300mm G2000SW column (T0S0H))，流動(dòng)相液為PBS，流速為O. 5ml/min，檢測(cè) 波長為280nm。結(jié)果如圖所示，純度均大于95%。 1.2.4.2細(xì)胞毒性試驗(yàn)將生長狀態(tài)良好的小鼠L929細(xì)胞調(diào)至106/ral的細(xì)胞懸液，恥孔培 養(yǎng)板中每孔加入100iil細(xì)胞懸液，50ml/l C02、 37'C培養(yǎng)過夜，棄上清，每孔加入系列 稀釋的復(fù)性后的TNF-TT， 5%C02、 37。C培養(yǎng)16h，棄上清，每孔加入30 p L的濃度為500 Pg/mL結(jié)晶紫染色3-5分鐘，用流水小心沖去結(jié)晶紫，摔干殘余水分，每孔加入脫色液IOO PL，酶標(biāo)儀570nm處測(cè)定吸光值。小鼠的TNF作為陽性對(duì)照，純化的GST蛋白作為陰性對(duì) 照。結(jié)果顯示TNF-TT、 TNF-服L、 TNF-PADRE均無TNF的細(xì)胞毒性(圖ll)。 1.2.4動(dòng)物免疫1. 2. 4. 1 BALB/C小鼠分組與免疫方案分組將25只雄性BALB/C小鼠分成5組，分別為佐劑組，小鼠TNF組，小鼠TNF-TT 組，小鼠TNF-HEL組和小鼠TNF-PADRE組。在第4次免疫后10天摘眼球采血，測(cè)定血清 中mTNF抗體效價(jià)。免疫方案背部皮下多點(diǎn)注射；30ug抗原/只；第l次使用完全佐 劑，第2、 3次和第4次使用不完全佐劑，佐劑溶液總體積為200uL/只，分別隔周注射。 1. 2. 4. 2抗血清ELISA鑒定在第4次免疫后IO天采血，收集抗血清，通過間接ELISA測(cè)定血清抗mTNF抗體效 價(jià)。ELISA實(shí)驗(yàn)方法如1. 1.5. 2所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖12所示，小鼠TNF-PADRE可以誘發(fā)最高的抗小鼠TNF抗體。與對(duì)照組， 小鼠TNF組，小鼠TNF-TT組，小鼠TNF-HEL組比較p<0. 01 。 1. 2. 4. 3抗血清中和活性鑒定在第4次免疫后10天釆血獲得的抗血清，通過對(duì)天然小鼠TNF對(duì)L929細(xì)胞殺傷的 阻斷實(shí)驗(yàn)測(cè)定比較抗血清的中和活性。所需溶液的配制a.完全培養(yǎng)基l: 10% FCS-DMEM培養(yǎng)液。b.完全培養(yǎng)基2: 3% FCS-DMEM培養(yǎng)液。c. 0.05%的結(jié)晶紫溶液50mg結(jié)晶紫用20ml無水乙醇溶解后，加 水定容至100ml，室溫保存。d.脫色液50ml水加入50ml無水乙醇和0. lml乙酸混勻 即可。 操作方法1. 用完全培養(yǎng)基1將小鼠L929細(xì)胞調(diào)至1X105 /ml， 100 u 1/孔加入96孔細(xì)胞培 養(yǎng)板，5% C20、 37。C培養(yǎng)過夜。2. 用完全培養(yǎng)基2系列稀釋抗血清，1: 1與20U/ml的小鼠TNF混合，5% C20、 37。C孵育2h。3. 棄去96孔板中細(xì)胞培養(yǎng)上清，100 y 1/孔加入孵育后的抗血清和小鼠TNF混合液， 5% C20、 37。C繼續(xù)孵育16h。4. 棄去96孔板細(xì)胞培養(yǎng)上清，30"1/孔加入0.05%結(jié)晶紫染色3-5分鐘，流水小 心沖去結(jié)晶紫，甩干培養(yǎng)孔殘余水份，100ul/孔加入脫色液，酶標(biāo)儀570nm測(cè)定光密度 值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖12所示，小鼠TNF-PADRE誘發(fā)最高的抗小鼠TNF中和抗體，與對(duì)照組、 小鼠TNF組，小鼠TNF-TT組和小鼠TNF-HEL組比較p<0. 01 ?？寡彖b定表明PADRE具有最好的輔助TNF誘導(dǎo)自身抗體的能力。篩選出TNF-PADRE為 TNF自體疫苗的候選分子。2、 TNF-PADRE對(duì)小鼠TNF誘導(dǎo)的惡病質(zhì)模型的治療 2.1分組并免疫小鼠BALB/c小鼠，雄性，共30只，體重18-20克，按體重隨機(jī)分兩組，每10只一組， 組間體重統(tǒng)計(jì)學(xué)無差異。A組TNF-PADRE組，抗原溶解于生理鹽水中，50yg/只，200。 B組生理鹽水組。免疫方案前三次背部皮下多點(diǎn)免疫，第4次腹腔免疫，免疫溶液 體積為200ul/只，分別隔周注射。 2.2模型的誘導(dǎo)免疫的小鼠按體重每組各取5只，體重27-28克，組間體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，每天腹 腔注射小鼠TNF 1X 105111/只，每天稱量小鼠體重。免疫的小鼠按體重每組各取IO只，體重27-30克，組間體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，每天 腹腔注射小鼠TNF 2X105IUAR,統(tǒng)計(jì)小鼠的生存期。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖13所不，與對(duì)照相比TNF-PADRE可以減乾TNF誘導(dǎo)的惡病質(zhì)小鼠模I 的癥狀。3、 TNF-PADRE對(duì)LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠模型的治療 3. l分組并免疫小鼠BALB/c小鼠，雄性，共20只，體重18-20克，按體重隨機(jī)分兩組，每10只一組， 組間體重統(tǒng)計(jì)學(xué)無差異。A組TNF-PADRE組，抗原溶解于生理鹽水中，50lig/只，200。 B組生理鹽水組。免疫方案前三次背部皮下多點(diǎn)免疫，第4次腹腔免疫，免疫溶液 體積為200nl/只，分別隔周注射。 3.2模型的誘導(dǎo)Pg /只，統(tǒng)計(jì)小鼠的生存期。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖14所示，與對(duì)照相比TNF-PADRE可以延長LPS誘導(dǎo)的惡病質(zhì)小鼠模 型的癥狀。4 TNF-PADRE對(duì)二型膠原誘導(dǎo)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎小鼠模型的治療 4. 1誘導(dǎo)劑的制備-將II型膠原溶于0.1M醋酸制成4mg/mL的溶液，與等體積的完全弗氏佐劑(弗氏 不完全佐劑加入終濃度2mg/mL的卡介苗)混合后以注射器反復(fù)推吸乳化，配制成II型 膠原終濃度為2mg/mL的乳劑。 4.2動(dòng)物的免疫從上海斯萊克動(dòng)物中心購買5周齡的DBA-1近交系小鼠21只，隨機(jī)分為三組，第 一組4只，免疫方法為皮下多點(diǎn)免疫，免疫劑量為10(^L生理鹽水/只，隔周免疫一次， 共免疫四次。第二組8只，免疫方法與第一組相同。第三組9只免疫方法為皮下多點(diǎn)免 疫mTNF-PADRE，免疫劑量為50ug/只，隔周免疫一次，共免疫四次。 4.3模型的誘導(dǎo)和治療免疫后10天，第一組小鼠每只尾根部皮內(nèi)注射100pL生理鹽水；第二組和第三組 小鼠每只尾根部皮內(nèi)注射100nL誘導(dǎo)劑。誘導(dǎo)21天后第一組小鼠每只尾根部皮內(nèi)再次 注射50nL生理鹽水;第二組和第三組小鼠每只尾根部皮內(nèi)再次注射50pL相同的誘導(dǎo)劑。小鼠發(fā)病率和發(fā)病肢數(shù)統(tǒng)計(jì)第二次誘導(dǎo)后次日即開始統(tǒng)計(jì)II型膠原誘導(dǎo)的小鼠類 風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率和平均每只小鼠的發(fā)病肢體數(shù)。結(jié)果如圖15所示，與對(duì)照相比 TNF-PADRE可以降低II型膠原誘導(dǎo)的小鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率和平均每只小鼠的發(fā)病 肢體數(shù)。小鼠后足足厚的測(cè)量第—次誘導(dǎo)后次日即開始測(cè)量后足的足厚，測(cè)量丄具為螺旋 測(cè)微器。雙尾T檢驗(yàn)檢驗(yàn)組間差異。結(jié)果如圖16所示，與對(duì)照相比TNF-PADRE可以降 低II型膠原誘導(dǎo)的小鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的小鼠后足足厚。小鼠關(guān)節(jié)炎病變?cè)u(píng)分標(biāo)準(zhǔn)第二次誘導(dǎo)后次日即開始開始觀察前后足腫脹程度并評(píng) 分，以每只鼠前后關(guān)節(jié)病變?cè)u(píng)分為急性關(guān)節(jié)炎分?jǐn)?shù)。關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritis index, AI) 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下0分一無紅腫；l分一關(guān)節(jié)稍腫；2分一關(guān)節(jié)輕度紅、腫、熱；3分一關(guān) 節(jié)中度紅、腫、熱，輕度功能障礙；4分一關(guān)節(jié)重度紅、腫、熱，嚴(yán)重功能障礙，無法 負(fù)重，晚期畸形。累積4個(gè)踝關(guān)節(jié)的得分即為每只小鼠的關(guān)節(jié)評(píng)分。雙尾T檢驗(yàn)檢驗(yàn)組 間差異。結(jié)果如圖17所示，與對(duì)照相比TNF-PADRE可以降低II型膠原誘導(dǎo)的小鼠類風(fēng)濕 關(guān)節(jié)炎的小鼠關(guān)節(jié)炎病變?cè)u(píng)分。小鼠膝關(guān)節(jié)和踝關(guān)節(jié)病理檢測(cè)小鼠膝關(guān)節(jié)和踝關(guān)節(jié)以10%福爾馬林溶液固定72h， 脫鈣液(8%甲酸溶液和8%鹽酸溶液等量混勻)脫鈣10天，每日換液，待骨軟化后以流 水沖洗36h，再經(jīng)蒸餾水沖洗，石蠟包埋后切成5um厚的切片，蘇木精-伊紅(HE)染 色。加拿大樹膠封片。光鏡下觀察關(guān)節(jié)腔的病理改變，每組樣品選兩張典型的切片與顯 微鏡下觀察并照相。其他切片密封后4'C保存。結(jié)果如圖18所示，與對(duì)照相比TNF-PADRE 可以降低II型膠原誘導(dǎo)的小鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)的病變程度。 5.本發(fā)明的效果經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)本發(fā)明的效果如下(1) 篩選并構(gòu)建了TNF-PADRE融合蛋白疫苗。(2) 該疫苗保持了 TNF的免疫原性，去除了TNF的生物活性。(3) 通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)該融合蛋白能夠在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)出高滴度中和抗體。(4) 初步證明了該蛋白作為腫瘤疫苗可在一定程度上可以減輕TNF誘導(dǎo)的惡病質(zhì)小 鼠模型的癥狀，延長LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠的生存期，減輕二型膠原誘導(dǎo)的類風(fēng)濕 性關(guān)節(jié)炎小鼠的癥狀。pBV220-mTNF-TT/DH5 a ， pBV220-mTNF-HEL/DH5 a和pBV220-mTNF-PADRE/DH5 a基因序列全長小鼠TNF-TT的基因序列其中劃線部分為TT表位的核酸序列，加粗部分分別 為Bgl II和Nde I酶切位點(diǎn)GTCTACTTTGGCGTTATTGCTCTG全長小鼠TNF-HEL的基因序列其中劃線部分為HEL表位的核酸序列，加粗部分分 別為Bgl II和Nde I酶切位點(diǎn)TGGAGTGGCTGAGCCAGCGCGCCAACGCCCTCCTGGCCMCGGCATGGATCTCMAGACAACCAACTGGTGGTGCCCAGGTCTACTTTGGCGTTATTGCTCTG全長小鼠TNF-PADRE的基因序列其中，劃線部分為PADRE表位的核酸序列，加粗 部分分別為Bgl II和Nde I酶切位點(diǎn)TGCTAAATTCGTTGCTGCATGGACTCTGAAAGCTGCAGCTCATATGTTAGACTTTGCGGAGTCCGGTCAGGTCTAC TTTGGCGTTATTGCTCTG
權(quán)利要求
1.一種體內(nèi)誘導(dǎo)出針對(duì)TNF-α分子的自身抗體的蛋白疫苗的構(gòu)建方法，其特征在于，該方法采用人工合成mTNF-TT830-844，mTNF-HEL46-61，mTNF-PADRE基因片段，將該片段插入pBV220載體中構(gòu)建mTNF-TT830-844，mTNF-HEL46-61，mTNF-PADRE蛋白基因；含有目的基因mTNF-TT830-844，mTNF-HEL46-61，mTNF-PADRE的原核表達(dá)載體的構(gòu)建及重組蛋白表達(dá)，經(jīng)表達(dá)產(chǎn)物的鑒定、重組蛋白的純化，將mTNF-TT830-844、mTNF-HEL46-61、mTNF-PADRE蛋白免疫小鼠后產(chǎn)生的抗血清與小鼠TNF-α的結(jié)合作用，該抗血清在體外可以中和小鼠TNF-α對(duì)L929細(xì)胞的殺傷；比較這三種分子誘導(dǎo)針對(duì)mTNF-α自身抗體的滴度，篩選出mTNF-PADRE蛋白；將篩選的mTNF-PADRE蛋白，通過免疫小鼠可突破小鼠的免疫限制，產(chǎn)生高滴度抗小鼠TNF-α自身抗體，其對(duì)應(yīng)的重組人TNF-PADRE融合蛋白能在人體內(nèi)產(chǎn)生抗人TNF-α自身抗體，即可得到TNF-α分子的自身抗體的蛋白疫苗。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，按以下步驟完成 (1) TNF-PADRE基因的克隆及原核表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)大腸桿菌偏愛密碼子、人和小鼠TNF氨基酸序列以及PADRE氨基酸序列，設(shè) 計(jì)TNF-PADRE基因序列，其中小鼠TNF-PADRE的基因序列用PADRE的編碼序列取代 小鼠TNF126-140位氨基酸的編碼序列，對(duì)應(yīng)人TNF-PADRE的基因序列用PADRE的 編碼序列取代人TNF127-141位氨基酸的編碼序列；設(shè)計(jì)小鼠TNF-PADRE的基因序列， 上游引入Ecoll酶切位點(diǎn)，下游引入SalI酶切位點(diǎn)，并克隆入載體pBV220中；將上述載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a ，測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為pBV220-mTNF-PADRE， 工程菌命名為pBV220-mTNF-PADRE /DH5a;其基因序列為CTCCGTTCATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCACGTCGTAGCAAACCACCAAGTGGAGG虹AGCAGGACACCCCTGAGGGTGCTGAGCTCAAACCGTGGTATGAGCCGATCTACCTGGGCGGTGTCTTCCAGCTGAGATC TGCTAAATTCGTTGCTGCATGGACTCTGAAAGCTGCAGCTCATATGTTAGACTTTGCGGAGTCCGGTCAGGTCTACTTTGGCGTTATTGCTCTG; (2)重組蛋白表達(dá)挑取工程菌單菌落接種于5mL LB培養(yǎng)液中，所述的LB培養(yǎng)液含AmplOOmg/L， 3(TC搖床培養(yǎng)過夜，次日以1: IOO的比例再次轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng)液中，在3(TC搖床培養(yǎng) 3h，至對(duì)數(shù)生長中期OD6oo為0.4 0.6， 42'C升溫誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)4h,離心收集菌體；(3)表達(dá)產(chǎn)物的鑒定 (D SDS-PAGE取30yL裂菌上清，加入30uL 2X載樣緩沖液，混勻；另取其他樣品加入30uL 水，混懸后再加入30uL2X載樣緩沖液混勻，沸水中煮5min, 12000 rpm離心5 min， 取10ixL上清加樣于18%分離膠6%濃縮膠，上樣后電壓為60 V, 20min，樣品進(jìn)入分 離膠后電壓升至100V， 4h 5h，用0.5%考馬斯亮蘭R-250振蕩染色2 h 3h，脫色直 至背景清晰后制備干膠保存；② 免疫印跡反應(yīng)SDS-PAGE結(jié)束后，按Bio-Rad產(chǎn)品說明，凝膠靠近陰極一側(cè)，硝酸纖維膜靠近陽 極一側(cè)，置轉(zhuǎn)移緩沖液中，緩沖液的配方為25mmol/LTris、 192 mmol/L Glycine、 20% 甲醇，100V恒壓lh，將蛋白從凝膠電轉(zhuǎn)移至NC膜上，電轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取出硝酸纖維 膜，用洗滌液TBST室溫洗3次，洗滌液TBST含有0.02 mol/L pH7.4 TBS、0.4% Tween20， 室溫洗3次，浸入封閉液中，該封閉液含2。/。BSA的TBST， 37°C， 1 h,以TBST洗滌 液室溫洗3次，加羊抗小鼠TNF- a多克隆抗體，37'C孵育1 h， TBST室溫洗膜3次，加 入兔抗羊IgG-AP 二抗，37'C孵育1 h， TBST室溫洗膜3次，再用TBS洗3次，NC膜 浸入顯色液中，室溫避光顯色5min，蒸餾水沖洗終止反應(yīng)；③ 融合蛋白的純化和復(fù)性取含pBV220-mTNF-PADRE重組質(zhì)粒的菌株大量誘導(dǎo)菌液，5000 rpm離心10min，收 菌，超聲裂菌；4'C， 12000rpm，離心20min,分別收集上清液和沉淀；將溶解的沉淀和上清分別取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，對(duì)目的蛋白的表達(dá)形式進(jìn)行分 析，在證實(shí)目的蛋白以包涵體的形式表達(dá)后，用層析純化所溶解的沉淀；按lg菌體加10 mL裂菌緩沖液的比例將菌體重懸，冰浴條件下進(jìn)行超聲裂菌；12000rpm，離心15min， 收集的裂菌沉淀用100ml飽含體洗滌液洗滌兩次，該洗滌液為4MUrea， l%TritonX-100， 5mMEDTA, 5mMp-mercaptoethano1， 50mMTris-HC1， pH8.5;洗滌后的沉淀用包涵體 溶解液溶解過夜，包涵體溶解液為20mM卩-mercaptoethano1， 7M guanidine hydrochloride; 12， 000 rpm離心30min收集上清；lml的TNF-PADRE的包涵體溶解上清，以0.5 ml/min 的流速過2.4xl00cm的Sephacryl-300層析柱，流動(dòng)相均為50mM Tris—HC1， pH8.5、 8M urea, lOOmMNaCl;收集目的峰，以復(fù)性液透析復(fù)性8h，復(fù)性液為10mM Tris-HC1， pH8.5，以體積比1/1000的p-mercaptoethanol，體積比1/105的0.5MCuS04，之后以雙蒸 水透析過夜，用Bradford法測(cè)定蛋白濃度，即可篩選出mTNF-PADRE融合蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種體內(nèi)誘導(dǎo)出針對(duì)TNF-α分子的自身抗體的蛋白疫苗的構(gòu)建方法，方法采用人工合成mTNF-TT830-844，mTNF-HEL46-61，mTNF-PADRE基因片段，將該片段插入pBV220載體中構(gòu)建mTNF-TT830-844，mTNF-HEL46-61，mTNF-PADRE蛋白基因；含有目的基因mTNF-TT830-844，mTNF-HEL46-61，mTNF-PADRE的原核表達(dá)載體的構(gòu)建及重組蛋白表達(dá)，經(jīng)表達(dá)產(chǎn)物的鑒定、重組蛋白的純化，將mTNF-TT830-844、mTNF-HEL46-61、mTNF-PADRE蛋白免疫小鼠后產(chǎn)生的抗血清與小鼠TNF-α的結(jié)合作用，該抗血清在體外可以中和小鼠TNF-α對(duì)L929細(xì)胞的殺傷；比較這三種分子誘導(dǎo)針對(duì)mTNF-α自身抗體的滴度，篩選出mTNF-PADRE蛋白；將篩選的mTNF-PADRE蛋白，通過免疫小鼠可突破小鼠的免疫限制，產(chǎn)生高滴度抗小鼠TNF-α自身抗體，其對(duì)應(yīng)的重組人TNF-PADRE融合蛋白能在人體內(nèi)產(chǎn)生抗人TNF-α自身抗體，即可得到TNF-α分子的自身抗體的蛋白疫苗。
文檔編號(hào)A61K38/19GK101214372SQ20081001723
公開日2008年7月9日 申請(qǐng)日期2008年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月4日
發(fā)明者一 萬, 包春杰, 張英起, 萌 李, 鑫 秦, 薛曉暢, 葦 韓 申請(qǐng)人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)