專利名稱：一種基于vigs系統(tǒng)在油桐中研究楊樹功能基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于VIGS系統(tǒng)在油桐中研究楊樹功能基因的方法。
背景技術(shù)：
楊樹(Populus spp.)是世界范圍內(nèi)種植最為廣泛的一種速生樹木。在理想條件下，楊樹大約4年即可成材，是重要的建筑用材和造紙?jiān)?，同時還可作為可再生能源的原料。毛果楊的基因組測序已經(jīng)于2006年完成(Tuskan et al.，2006),楊樹基因組包含45000個蛋白編碼基因，并且其中大約12%的基因不能夠在模式植物擬南芥中找到同源基因。因此，找到快速而有效的方法闡明這些基因的功能意義重大。近年來，研究植物基因功能的方法主要是通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化產(chǎn)生穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株，然而這種方法由于周期較長，只適應(yīng)于小部分基因，并且在后期鑒定轉(zhuǎn)基因陽性是需要鑒定大量植株才能得到陽性株系(Takata.，2012)，獲得的轉(zhuǎn)基因植株往往含有一個至多個拷貝的外源基因(Spielmann et al.，1986)?，F(xiàn)已證明，多拷貝數(shù)的外源基因在轉(zhuǎn)錄翻譯過程中存在基因沉默的現(xiàn)象，導(dǎo)致其表達(dá)不穩(wěn)定(Lechtenberg etal.，2003)。與穩(wěn)定表達(dá)的方法研究基因功能相比，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的在活細(xì)胞內(nèi)瞬時轉(zhuǎn)化的方法具有明顯的優(yōu)勢，但是是一種不穩(wěn)定，容易引起植物自身的免疫防衛(wèi)反應(yīng)而導(dǎo)致現(xiàn)象不明顯或無現(xiàn)象(Anand et al.，2008),而且表型持續(xù)時間短,不利于長期觀察。研究發(fā)現(xiàn)，R NA病毒介導(dǎo)的基因沉默(VIGS)可以特異性地沉默目的基因，是一種快速高效地研究基因缺失的一種強(qiáng)大工具，并且已經(jīng)在多種植物中，尤其是草本植物中獲得了成功(Annette and Matthias, 2010)。而由煙草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)介導(dǎo)的VIGS由于其寄主范圍廣、構(gòu)建方便、效果明顯等特點(diǎn)，成為目前應(yīng)用范圍最廣的病毒載體。在木本植物里，Ye等人發(fā)現(xiàn)麻風(fēng)樹是煙草脆裂病毒的宿主之一，運(yùn)用TRV病毒介導(dǎo)的VIGS可以有效地沉默麻風(fēng)樹中的基因，使植株的表型發(fā)生一定變化(Ye etal.，2009)ο油桐作為一種重要的油料樹種，從其種子榨取的桐油是墨水、染料、樹脂等的原料(Sonntag, 1979)。最近的報(bào)道稱桐油還可以用來制造生物柴油(Chen et al.，2010)。油桐(Vernicia fordii)和麻風(fēng)樹(Jatropha curcas L)同屬大戟科,也可以誘導(dǎo)出TRV病毒介導(dǎo)的VIGS，因此如果能夠有一種基于VIGS系統(tǒng)在油桐中研究楊樹功能基因的方法，將大大推動楊樹的基因研究，但是目前并沒有相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種簡單、高效、低成本研究楊樹功能基因的新方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是一種基于VIGS系統(tǒng)在油桐中研究楊樹功能基因的方法,包括如下步驟:a、構(gòu)建載體:擴(kuò)增楊樹待研究基因片段，與TRV2載體相連接，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101 ；b、轉(zhuǎn)化:將轉(zhuǎn)后的陽性農(nóng)桿菌菌液與TRVl菌液按菌體質(zhì)量比1:1混合；C、轉(zhuǎn)入油桐:通過注射的方法將混合菌液接種在2 3周大的油桐幼苗嫩葉上，看到葉肉組織中有菌液的擴(kuò)散即可；d、檢測:大約2 3周后，觀察注射葉片之上新長出的油桐葉片的表型變化，并檢測葉片中TRV病毒的衣殼蛋白基因和轉(zhuǎn)移蛋白基因，檢測油桐中被沉默基因的表達(dá)情況，最后檢測被沉默基因的產(chǎn)物含量，反映基因沉默的程度，最后確定待研究楊樹基因的功能。采用本發(fā)明方法，僅需要將目的基因的非全長片段連接到TRV2載體上，就可以進(jìn)行油桐的侵染，不需要周期長的穩(wěn)定表達(dá)步驟和無菌操作，而且能夠在短時間內(nèi)產(chǎn)生表型。本方法簡單高效，成本低廉，適合大規(guī)模篩選楊樹基因的功能。通過這種篩選方式，可以對大量楊樹基因的功能進(jìn)行粗判，為進(jìn)一步研究這些基因提供依據(jù)和方向。


圖1:TRV2載體圖譜；圖2:用帶有楊樹PD S和CLAl基因序列的病毒(TRV-PtPDS和TRV-PtCLAl)侵染油桐幼葉約20天后，新葉的表現(xiàn)型；圖3:退綠的油桐新葉中油桐PDS和CLAl基因的表達(dá)量檢測的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，在不同循環(huán)數(shù)下(20-35循環(huán))，處理過的植株兩種基因的表達(dá)量較對照都明顯減少；圖4:退綠油桐葉片的葉綠素含量測定，與對照相比，兩種基因沉默的葉片葉綠素的含量明顯減少。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明一種基于VIGS系統(tǒng)在油桐中研究楊樹功能基因的方法，包括如下步驟:a、構(gòu)建載體:擴(kuò)增楊樹待研究基因片段，與TRV2載體相連接，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101 ；b、轉(zhuǎn)化:將轉(zhuǎn)后的陽性農(nóng)桿菌菌液與TRVl菌液按菌體質(zhì)量比1:1混合；C、轉(zhuǎn)入油桐:通過注射的方法將混合菌液接種在2 3周大的油桐幼苗嫩葉上，看到葉肉組織中有菌液的擴(kuò)散即可；d、檢測:大約2 3周后，觀察注射葉片之上新長出的油桐葉片的表型變化，并檢測葉片中TRV病毒的衣殼蛋白基因和轉(zhuǎn)移蛋白基因，檢測油桐中被沉默基因的表達(dá)情況，最后檢測被沉默基因的產(chǎn)物含量，反映基因沉默的程度，最后確定待研究楊樹基因的功能。TRV病毒的基因組在天然狀態(tài)下由兩條雙鏈RNA組成，RNAl主要為復(fù)制酶和轉(zhuǎn)移蛋白的編碼序列，RNA2主要為衣殼蛋白的編碼序列。在構(gòu)建此病毒載體時，人為將RNAl和RNA2分別與植物表達(dá)載體連接并命名為TRVl和TRV2。當(dāng)需要沉默某基因時，只需要將此基因部分序列的PCR產(chǎn)物通過TRV2上的多克隆位點(diǎn)與之連接，然后將TRVl和連接目的基因的TRV2分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中一起侵染植物。當(dāng)兩種載體都整合到同一個細(xì)胞的基因組中，在35S強(qiáng)啟動子的啟動下轉(zhuǎn)錄出病毒的RNAl和RNA2，這樣就將被拆分的病毒基因組重新組合到了一起，使病毒回復(fù)活性，而帶入的目的基因片段通過RNAi使其內(nèi)源的基因沉默。下面以毛白楊PtPDS基因和PtCLAl基因?yàn)槔齺碚f明本發(fā)明方法。實(shí)施例1楊樹總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄合成cDNA1、楊樹總RNA提取以楊樹幼葉為材料，將RNA提取中所用的藥勺、杵、研缽等均用95%酒精灼燒至冷卻后使用。取石英砂一勺于加熱器中加熱IOmin冷卻后使用。1.5mL離心管、塑料制品等均使用經(jīng)RNase處理(RNase Free )的AXYGEN產(chǎn)品?？俁NA 提取按照華舜 Server-SPIN DNA-free Plant RNA Isolation Kit 操作步驟進(jìn)行:I)在 1.5mL 離心管中加入裂解液(500 μ L RL+100 μ L 10%PVP+10 μ L 2-ΜΕ)；2)在液氮冷凍條件下將楊樹幼葉(IOOmg)和石英砂混合快速研成粉末，在液氮完全揮發(fā)之前，將粉末全部轉(zhuǎn)移到事先配制好的裂解液中，移液槍快速吹打混勻樣品；3)室溫放置5min后,全部移入過濾柱中，13400rpm離心5min,將上清全部移入另一個離心管中；4)加入上清液一半體積的W3，混勻后，全部移入吸附柱，12000rpm離心30s，倒掉收集管內(nèi)液體，將 吸附柱放回收集管中，若總體積超過750μ L，則分多次上柱；5)加入400 μ L RP，室溫靜置Imin后，離心lmin，倒掉收集管內(nèi)液體，將吸附柱放回收集管中；6)加入400 μ L W3液，室溫靜置Imin后，離心lmin，倒掉收集管內(nèi)液體，將吸附柱放回收集管中；7)向吸附膜中央加入40 μ L DNase I工作液。室溫靜置15min后，加入200 μ L RP液。離心lmin。倒掉收集管內(nèi)液體，將吸附柱放回收集管中；8)加入600 μ L W3液，離心lmin，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放回收集管中；9)加入250 μ L W3液，靜置lmin，離心2min，倒掉收集管中的液體，將吸附柱放回
收集管中；10)將吸附柱移入一個干凈的1.5mL離心管中，在吸附膜正中央加入50 μ L純水，靜置lmin，離心2min。將RNA輕微混勻后，保存于_70°C備用。2、楊樹總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA用TaKaRa One-step RT PCR Kit試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,反應(yīng)體系如表I所示:表I反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系
權(quán)利要求
1.一種基于VIGS系統(tǒng)在油桐中研究楊樹功能基因的方法，其特征在于:包括如下步驟: a、構(gòu)建載體:擴(kuò)增楊樹待研究基因片段，與TRV2病毒載體相連接，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101 ； b、轉(zhuǎn)化:將轉(zhuǎn)后的陽性農(nóng)桿菌菌液與TRVl菌液按菌體質(zhì)量比1:1混合； C、轉(zhuǎn)入油桐:通過注射的方法將混合菌液接種在2 3周大的油桐幼苗嫩葉上，看到葉肉組織中有菌液的擴(kuò)散即可； d、檢測:大約2 3周后，觀察注射葉片之上新長出的油桐葉片的表型變化，并檢測葉片中TRV病毒的衣殼蛋白基因和轉(zhuǎn)移蛋白基因，檢測油桐中被沉默基因的表達(dá)情況，最后檢測被沉默基因的產(chǎn)物含量，反映基因沉默的程度，最后確定待研究楊樹基因的功能。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于VIGS系統(tǒng)在油桐中研究楊樹功能基因的方法。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種簡單、高效、低成本研究楊樹功能基因的新方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種基于VIGS系統(tǒng)在油桐中研究楊樹功能基因的方法，包括如下步驟a、構(gòu)建載體；b、轉(zhuǎn)化；c、轉(zhuǎn)入油桐；d、檢測。本方法簡單高效，成本低廉，適合大規(guī)模篩選楊樹基因的功能。
文檔編號C12Q1/68GK103215367SQ20131015577
公開日2013年7月24日 申請日期2013年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月27日
發(fā)明者姜淵忠, 羅克明, 葉勝龍, 段艷嬌 申請人:西南大學(xué)