Fgfr2融合基因的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種FGFR2融合基因，更詳細(xì)而言，涉及一種編碼FGFR2蛋白質(zhì)和其它 蛋白質(zhì)的融合多肽的多核苷酸、該多核苷酸編碼的多肽以及檢測(cè)該多核苷酸或該多肽的方 法。另外，本發(fā)明涉及一種判定以該多核苷酸或該多肽為標(biāo)靶的利用FGFR2抑制劑的癌治 療的有效性的方法。進(jìn)而，本發(fā)明涉及一種利用了該有效性判定的癌治療方法。另外，本發(fā) 明也涉及用于這些方法的藥劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 膽道癌為由肝臟內(nèi)（肝內(nèi)膽道癌）及肝臟外（肝外膽道癌）的膽管上皮細(xì)胞發(fā)生 的浸潤(rùn)性非常高的癌。以東亞為中心發(fā)生頻率很高，但近年來(lái)，包括歐美在內(nèi)全世界性發(fā)生 頻率增加。由于發(fā)病早期缺乏臨床癥狀，因此很多病例大多在晚期被發(fā)現(xiàn)，其預(yù)后不良。手 術(shù)切除為唯一的完全治愈的治療，但復(fù)發(fā)率高，5年生存率為手術(shù)可能病例的15?25%。對(duì) 于不能手術(shù)的病例或復(fù)發(fā)病例，以現(xiàn)有化學(xué)療法顯示顯著療效的情況尚未得知，但最近有 報(bào)告，與其它化療法相比，鹽酸吉西他濱單獨(dú)使用或鹽酸吉西他濱和鉑制劑的并用顯示稍 微有效的成績(jī)。因此，對(duì)于膽道癌，強(qiáng)烈要求包括分子標(biāo)靶治療的新的有效的治療方法，迄 今為止，作為分子標(biāo)靶的候補(bǔ)，報(bào)告有EGFR、VEGFR、c-MET等。
[0003] 作為膽道癌中的驅(qū)動(dòng)突變，報(bào)告有KRAS及BRAF基因突變，另外，最近，作為酪氨酸 激酶的融合基因，在膽道癌中也報(bào)告有在腦腫瘤中被鑒定的GOPC-ROS1。沒(méi)有看到這些異常 的病例中的驅(qū)動(dòng)突變?nèi)耘f尚未得到鑒定。
[0004] FGFR(Fibroblast growth factor receptor :成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體）家族為 作為FGF (Fibroblast growth factor:成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子）的受體發(fā)揮作用的跨膜型酪 氨酸激酶分子的總稱。在人類中，屬于FGFR家族的分子已知有FGFRl?4這4種。在細(xì)胞 外區(qū)域具有3個(gè)Ig-Iike (免疫球蛋白樣）區(qū)域、1處跨膜區(qū)域，在細(xì)胞內(nèi)區(qū)域具有酪氨酸激 酶區(qū)域。已知FGFR家族促進(jìn)包含胃癌、乳腺癌、子宮癌、膀胱癌的許多癌的發(fā)生或進(jìn)展，有 報(bào)告在癌中引起各種基因組異常導(dǎo)致的活化（非專利文獻(xiàn)1)。
[0005] 例如，關(guān)于FGFR1，已知在乳腺癌和卵巢癌中發(fā)生基因擴(kuò)增，在惡性黑色素瘤中發(fā) 生基因突變，在白血病和乳腺癌中發(fā)生基因易位。另外，關(guān)于FGFR2,已知在胃癌和乳腺癌中 發(fā)生基因擴(kuò)增，在子宮癌或胃癌中發(fā)生基因突變。另外，關(guān)于FGFR3,已知在膀胱癌和唾液腺 癌中發(fā)生基因擴(kuò)增，在膀胱癌、子宮癌、骨髓瘤和前列腺癌中發(fā)生基因突變。
[0006] 關(guān)于FGFR參與的融合基因，迄今為止僅在FGFRl中有報(bào)告，多在血液腫瘤中被鑒 定。在血液腫瘤中報(bào)告有FGFR10P2-FGFR1 (非專利文獻(xiàn)2)、ZNF198-FGFR1 (非專利文獻(xiàn)3) 這樣的融合基因，就實(shí)體癌而言，在乳腺癌中報(bào)告有FGFR1-ZNF703 (非專利文獻(xiàn)4)。關(guān)于膽 道癌中的FGFR信號(hào)異常，在文獻(xiàn)中報(bào)告了作為其配體的FGF的表達(dá)（非專利文獻(xiàn)5)。
[0007] 作為以FGFR為標(biāo)靶的低分子抑制化合物，現(xiàn)在，對(duì)AZD4547、TKI258、E3810、 E7080、BIBF1120、Masitinib、BGJ398這樣的物質(zhì)進(jìn)行了臨床開(kāi)發(fā)。另外，以FGFR為標(biāo)靶的 抗體治療藥的開(kāi)發(fā)目前也在進(jìn)行中（非專利文獻(xiàn)1)。
[0008] 另一方面，BICCl蛋白質(zhì)為具有參與RNA結(jié)合區(qū)域及蛋白質(zhì)相互作用的 SAM(sterile a motif)區(qū)域的分子，對(duì)Wnt通路進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)。另外，有報(bào)告因該蛋白質(zhì)的 功能異常而導(dǎo)致多囊性腎病和胰腺發(fā)生異常（非專利文獻(xiàn)6)。另外，已知AHCYLl蛋白質(zhì)具 有與S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶類似的區(qū)域，參與上皮細(xì)胞中的分泌（非專利文獻(xiàn)7)。
[0009] 但是，關(guān)于FGFR2基因、BICCl基因及AHCYLl基因這些任一種基因參與的融合基 因的存在、以及該融合基因與癌的關(guān)聯(lián)性的有無(wú)尚不清楚。另外，在包括膽道癌在內(nèi)的癌中 的融合基因等的闡明還不能說(shuō)充分，目前的現(xiàn)狀是期望鑒定可成為預(yù)測(cè)藥劑的治療有效性 指標(biāo)的突變基因或融合基因。
[0010] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0011] 非專利文獻(xiàn)
[0012] 非專利文獻(xiàn) I :Ahmad I.等，Biochim Biophys Acta.，2012 年，1823 卷，850 ?860 頁(yè)
[0013] 非專利文獻(xiàn) 2 :Popovici C.等，Blood，1999 年，93 卷，1381 ?1389 頁(yè)
[0014] 非專利文獻(xiàn) 3 :Xiao S.等，Nature Genet.，1998 年，18 卷，84 ?87 頁(yè)
[0015] 非專利文獻(xiàn)4 :"癌中的體細(xì)胞突變一覽（Catalogue of Somatic Mutations in Cancer)易位（translocation)基因（Genes) :FGFR1 ZNF703"，[online]，最終更新日：2011 年9月 28 日，英國(guó) Welcome Trust Sanger 研宄所，因特網(wǎng)〈URL:http://www. sanger. ac. uk/ perl/genetics/CGP/cosmic ? action = translocations&id = 174&fused = 59536)
[0016] 非專利文獻(xiàn) 5 :0gasawara S.等，Hepatol Res.，2001 年，20 卷，97 ?113 頁(yè)
[0017] 非專利文獻(xiàn) 6 :Kraus MR.等，Hum Mutat.，2012 年，33 卷，86 ?90 頁(yè)
[0018] 非專利文獻(xiàn) 7 :Yang D.等，J Clin Invest.，2011 年，121 卷，956 ?965 頁(yè)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0019] 本發(fā)明就是鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)具有的課題而完成的發(fā)明，其目的在于鑒定可成為 在膽道癌等中預(yù)測(cè)藥劑的治療有效性的指標(biāo)的基因。另外，本發(fā)明的目的在于提供一種以 該基因或其表達(dá)產(chǎn)物為標(biāo)靶而預(yù)測(cè)藥劑的治療有效性的新型的方法。進(jìn)而，本發(fā)明的目的 在于基于以該基因或其表達(dá)產(chǎn)物為標(biāo)靶的藥劑的治療有效性的預(yù)測(cè)而提供一種治療膽道 癌等的方法。進(jìn)而，本發(fā)明的目的在于提供一種用于在這些方法中檢測(cè)該基因或其表達(dá)產(chǎn) 物的藥劑。
[0020] 本發(fā)明的發(fā)明人為了達(dá)到上述目的而進(jìn)行了反復(fù)深入的研宄，結(jié)果，通過(guò)8例 膽道癌的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，鑒定了 FGFR2基因與其它基因（BICC1基因或AHCYLl基因）的框 內(nèi)（In-flame)融合轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。FGFR2基因與BICCl基因的融合基因（FGFR2-BICC1融 合基因）是由第10號(hào)染色體內(nèi)的倒位而產(chǎn)生的，F(xiàn)GFR2基因與AHCYLl基因的融合基因 (FGFR2-AHCYL1融合基因）是由第1號(hào)染色體和第10號(hào)染色體的相互易位而產(chǎn)生的。另 夕卜，在102例的膽道癌中研宄了這些融合基因的出現(xiàn)頻率，結(jié)果，F(xiàn)GFR2-AHCYL1融合基因的 出現(xiàn)頻率約為6. 9%，F(xiàn)GFR2-BICC1融合基因的出現(xiàn)頻率約為2. 0%。
[0021] 進(jìn)而，認(rèn)為這些基因融合導(dǎo)致FGFR2蛋白質(zhì)的活化，在產(chǎn)生這種活化的患者中，認(rèn) 為FGFR2抑制劑為在治療中顯示有效性的物質(zhì)。為此，將這些融合基因分別導(dǎo)入于正常細(xì) 胞，結(jié)果確認(rèn)這些細(xì)胞獲得貼壁非依賴性的集落形成能力，即癌化。另外得知，在該細(xì)胞中 觀察到FGFR2蛋白激酶的活化，進(jìn)而，作為其下游信號(hào)的MPK的磷酸化也亢進(jìn)。
[0022] 另外，將表達(dá)FGFR2融合基因的細(xì)胞移植在裸鼠的皮下，結(jié)果確認(rèn)該細(xì)胞具有體 內(nèi)成瘤能力。
[0023] 另一方面，也確認(rèn)該FGFR2蛋白激酶的活化、MAPK的磷酸化、貼壁非依賴性的集落 形成能力、體內(nèi)成瘤能力通過(guò)FGFR2抑制劑、或通過(guò)FGFR2融合多肽的激酶結(jié)構(gòu)域的失活而 顯著地得到抑制。
[0024] 基于以上幾點(diǎn)，本發(fā)明的發(fā)明人能夠在膽道癌等中以該基因融合為標(biāo)靶預(yù)測(cè)利用 FGFR2抑制劑的治療有效性，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)，如果對(duì)在該預(yù)測(cè)中判定為藥劑治療有效的患者投與 該藥劑，則能夠有效地進(jìn)行治療，從而完成了本發(fā)明。
[0025] 因此，本發(fā)明涉及一種編碼FGFR2蛋白質(zhì)與其它蛋白質(zhì)的融合多肽的多核苷酸、 由該多核苷酸編碼的多肽、該多核苷酸或多肽的檢測(cè)方法、以該多核苷酸或該多肽的存在 為指標(biāo)判定利用FGFR2抑制劑的癌治療有效性的方法、利用了該有效性判定的癌治療方 法、以及用于這些方法的藥劑，更詳細(xì)而言，提供以下的發(fā)明。
[0026] < 1 >-種多核苷酸，其為編碼FGFR2蛋白質(zhì)與其它蛋白質(zhì)融合的多肽的多核苷 酸，其編碼在癌細(xì)胞中表達(dá)的多肽。
[0027] < 2 >如< 1 >所述的多核苷酸，其中，其它蛋白質(zhì)為BICCl蛋白質(zhì)或AHCYLl蛋 白質(zhì)。
[0028] < 3 >如< 1 >或< 2 >所述的多核苷酸，其中，癌細(xì)胞為膽道癌細(xì)胞。
[0029] < 4 >一種由< 1 >?< 3 >中任一項(xiàng)所述的多核苷酸編碼的多肽。
[0030] < 5 >-種檢測(cè)試樣中的< 1 >?< 3 >中任一項(xiàng)所述的多核苷酸或< 4 >所述 的多肽存在或不存在的方法，其包括：
[0031] (a)使藥劑與試樣接觸的工序，該藥劑用于特異性地檢測(cè)試樣中的該多核苷酸或 該多肽存在或不存在、以及
[0032] (b)檢測(cè)該多核苷酸或該多肽存在或不存在的工序。
[0033] < 6 >-種藥劑，其用于利用< 5 >所述的方法檢測(cè)試樣中的< 1 >?< 3 >中 任一項(xiàng)所述的多核苷酸或< 4 >所述的多肽存在或不存在，所述藥劑包含具有至少15個(gè)堿 基的鏈長(zhǎng)的下述（a)?（c)中任一項(xiàng)所述的多核苷酸或下述（d)所述的抗體，
[0034] (a)作為選自與編碼FGFR2蛋白質(zhì)的多核苷酸雜交的探針和與編碼其它蛋白質(zhì)的 多核苷酸雜交的探針中的至少一個(gè)探針的多核苷酸，
[0035] (b)作為與編碼FGFR2蛋白質(zhì)的多核苷酸和編碼其它蛋白質(zhì)的多核苷酸的融合點(diǎn) 雜交的探針的多核苷酸，
[0036] (c)作為以?shī)A有編碼FGFR2蛋白質(zhì)的多核苷酸和編碼其它蛋白質(zhì)的多核苷酸的融 合點(diǎn)的方式設(shè)計(jì)的一對(duì)引物的多核苷酸，
[0037] (d)與FGFR2蛋白質(zhì)和其它蛋白質(zhì)融合的多肽結(jié)合的抗體。
[0038] < 7 >-種判定利用FGFR2抑制劑的癌治療的有效性的方法，其包括檢測(cè)從患者 分離的試樣中的< 1>?< 3 >中任一項(xiàng)所述的多核苷酸或< 4 >所述的多肽存在或不 存在的工序，如果檢測(cè)出所述多核苷酸或所述多肽存在，則判定為所述患者利用所述FGFR2 抑制劑的癌治療的有效性尚。
[0039] < 8 >-種藥劑，其用于利用< 7 >所述的方法判定利用FGFR2抑制劑的癌治療 的有效性，所述藥劑包含具有至少15個(gè)堿基的鏈長(zhǎng)的下述（a)?（c)中任一項(xiàng)所述的多核 苷酸或下述（d)所述的抗體，
[0040] (a)作為選自與編碼FGFR2蛋白質(zhì)的多核苷酸雜交的探針和與編碼其它蛋白質(zhì)的 多核苷酸雜交的探針中的至少一個(gè)探針的多核苷酸，
[0041] (b)作為與編碼FGFR2蛋白質(zhì)的多核苷酸和編碼其它蛋白質(zhì)的多核苷酸的融合點(diǎn) 雜交的探針的多核苷酸，
[0042] (c)作為以?shī)A有編碼FGFR2蛋白質(zhì)的多核苷酸和編碼