水稻黑條矮縮病毒RNAi多價(jià)靶基因序列及應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種優(yōu)選的水稻黑條矮縮病毒RNAi多價(jià)靶基因序列，依次包括水稻黑條矮縮病毒S8編碼區(qū)的206bp片段；和S10編碼區(qū)的205bp；和S4編碼區(qū)的203bp；在S8的5’端加入BamH1酶切位點(diǎn)和CCG三個(gè)保護(hù)堿基，在S4的3’端加入XhoI酶切位點(diǎn)和ACA三個(gè)保護(hù)堿基。本發(fā)明通過(guò)特殊設(shè)計(jì)并優(yōu)化，針對(duì)RBSDV?S8、S10、S4三個(gè)基因共614bp的RNAi靶序列，獲得特定的水稻黑條矮縮病毒RNAi多價(jià)靶基因序列，克隆并構(gòu)建到RNAi載體pBDL03中，獲得RNA沉默載體pBDL03-S8+S10+S4，然后通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)到水稻品種泰粳394中。T1代陽(yáng)性植株對(duì)RBSDV具有良好的抗性。
【專(zhuān)利說(shuō)明】水稻黑條矮縮病毒RNAi多價(jià)靶基因序列及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及利用RNAi介導(dǎo)技術(shù)構(gòu)建抗水稻黑條矮縮病毒載體的方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]水稻黑條矮縮病毒(Rice black-streaked dwarf virus, RBSDV)隸屬呼腸孤病毒(Reoviridae)科斐濟(jì)病毒(Fi jivirus)屬，主要由灰飛風(fēng)(Laodelphax striatellusfallen)以持久性不經(jīng)卵方式傳播(Milne and Lovisolo, 1977;Azuhata et al.，1993)。該病毒主要引起水稻黑條矮縮病和玉米粗縮病，可侵染水稻、大麥、小麥、玉米等禾本科植物。RBSDV于20世紀(jì)40年代首先在日本發(fā)現(xiàn)，之后在20世紀(jì)60年代和90年代在我國(guó)華北、華東等地大規(guī)模流行，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失(徐秋芳等，2012)。近年來(lái)，RBSDV危害成逐年加重趨勢(shì)，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。該病在江蘇省2007年的發(fā)生面積為2.0 X 104hm2，至2008年迅速上升至2.6X105hm2,2009年則發(fā)展到約3.3 X 105hm2 (季英華等，2009)。RBSDV在我國(guó)引起了的病害日益嚴(yán)重，給我國(guó)的糧食安全帶來(lái)了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，如何控制并降低RBSDV的危害已是一個(gè)極具現(xiàn)實(shí)意義的問(wèn)題。選育和推廣抗病品種是防治水稻病毒病最經(jīng)濟(jì)、有效的方法，但存在抗性資源缺乏、育種周期長(zhǎng)、效率低等問(wèn)題，因此，充分利用各種分子手段有利于加速水稻抗病育種的進(jìn)程。
[0003]隨著近年來(lái)RN A干擾(RNA interference, RNAi)機(jī)制研究的不斷深入，利用RNAi的高效性和特異性來(lái)控制植物的病毒病已開(kāi)始得到重視和應(yīng)用(Cogoni andMacino, 2000)。1998 年 waterhouse 等(Waterhouseet et al., 1998)首次報(bào)導(dǎo)了利用 RNAi技術(shù)防治馬鈴薯Y病毒。Shimizu等(Shimizuet et al.，2009)利用RNAi沉默了水稻矮縮病毒(RDV)的pnsl2基因，獲得了具有RDV抗性的轉(zhuǎn)基因水稻。因此，采用RNAi技術(shù)培育抗病毒植物具有高度可行性。
[0004]RBSDV含有10條雙鏈RNA(S1_S10)，目前已知RBSDV多個(gè)分離物的基因組全序列，而且部分編碼蛋白的功能已得到初步驗(yàn)證。如S8編碼的蛋白P8為最小的結(jié)構(gòu)蛋白，P8進(jìn)入寄主并在病毒與寄主互作過(guò)程中對(duì)寄主基因的表達(dá)起負(fù)調(diào)控的作用(Li et al., 2007)；SlO編碼蛋白(63.3kDa)為病毒粒子的外層衣殼蛋白(Liu et al.，2007);S4可編碼結(jié)構(gòu)蛋白 B-突起(Zhang et al.，2001)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種優(yōu)選的水稻黑條矮縮病毒RNAi多價(jià)靶基因序列，所述基因序列是特定選取了水稻黑條矮縮病毒RBSDV的S8、S10、S4編碼區(qū)基因序列的組合，設(shè)計(jì)構(gòu)建了抗RBSDV的多價(jià)RNA沉默載體，通過(guò)試驗(yàn)證明了其轉(zhuǎn)化后具有很好的抗
病毒活性。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種水稻黑條矮縮病毒RNAi多價(jià)靶基因序列，依次包括水稻黑條矮縮病毒S8編碼區(qū)的206bp片段，對(duì)應(yīng)S8基因30~131bp，1015~1118bp ;和SlO編碼區(qū)的205bp，對(duì)應(yīng)SlO基因的433~637bp ;和S4編碼區(qū)的203bp，對(duì)應(yīng)S4基因的2218~2420bp ;在S8的5’端加入BamHl酶切位點(diǎn)和CCG三個(gè)保護(hù)堿基，在S4的3’端加入XhoI酶切位點(diǎn)和ACA三個(gè)保護(hù)堿基。
[0007]優(yōu)化后的水稻黑條矮縮病毒RNAi多價(jià)靶基因序列如SEQ ID N0.1所示。
[0008]本發(fā)明的RNAi靶序列，可以克隆并構(gòu)建到RNAi中間載體中，進(jìn)而獲得RNA沉默載體，然后再通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)到植物植株中。所述中間載體可以為tENTRA-S8+S10+S4，也可以為其他已知的載體；獲得的多價(jià)RNA沉默載體為pBDL03-S8+S10+S4。
[0009]只要含有本發(fā)明的水稻黑條矮縮病毒RNAi多價(jià)靶基因序列的載體都可以應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物的培育中，用于防治水稻黑條矮縮病毒病。植物優(yōu)選為水稻，也可以為其他同源性高的植物植株。
[0010]本發(fā)明通過(guò)特殊設(shè)計(jì)并優(yōu)化，針對(duì)RBSDV S8、S10、S4三個(gè)基因共614bp的RNAi靶序列，獲得特定的水稻黑條矮縮病毒RNAi多價(jià)靶基因序列，克隆并構(gòu)建到RNAi載體pBDL03中，獲得RNA沉默載體pBDL03-S8+S10+S4，然后通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)到水稻品種泰粳394中。TI代陽(yáng)性植株對(duì)RBSDV具有良好的抗性。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0011]圖1是本發(fā)明的水稻黑條矮縮病毒RNAi多價(jià)靶基因序列圖；
[0012]圖2是RNAi表達(dá)載體雙酶切驗(yàn)證，其中:M:Trans2k plus II ;1:質(zhì)粒PBDL03-S8+S10+S4 的 KpnI/SacI 雙酶切；2:質(zhì)粒 pBDL03_S8+S10+S4 ；
[0013]圖3是TO代轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)，其中M:分子標(biāo)量Trans2K ;1~7轉(zhuǎn)基因植株；8野生型植株；
[0014]圖4是TO代轉(zhuǎn)基因植株的熒光檢測(cè)，其中A轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株；B野生型植株；
[0015]圖5是Tl代轉(zhuǎn)基因水稻的dot-ELISA檢測(cè)，其中:A~D行:轉(zhuǎn)基因陰性植株；E~J行:轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株(Al，El:健康的泰粳394 ；A2, E2:健康的日本晴；A3，E3:感病的玉米)。
【具體實(shí)施方式】
[0016]為進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，結(jié)合以下實(shí)施例具體說(shuō)明:
[0017]實(shí)施例1三價(jià)RNAi基因片段的核苷酸序列與克隆
[0018]根據(jù)NCBI上提交的RBSDV序列，將其在DNAMAN6.0.3.99上進(jìn)行多序列比對(duì)與限制性酶分析，選取相對(duì)保守且不含BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)的S8、S10、S4編碼區(qū)基因片段，用武漢晶賽生物工程技術(shù)公司的在線設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行siRNA靶位點(diǎn)預(yù)測(cè)，在水稻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://signal, salk.edu/cg1-bin/RiceGE)進(jìn)行脫祀效應(yīng)預(yù)測(cè)。優(yōu)化獲得 614bp 的RNAi多價(jià)靶基因序列(如圖1所示JnSEQ ID N0.1所示)，依次包括S8編碼區(qū)的206bp片段(對(duì)應(yīng)S8基因30~131bp，1015~1118bp)、S10編碼區(qū)的205bp (對(duì)應(yīng)SlO基因的433~637bp)、S4編碼區(qū)的2 03bp (對(duì)應(yīng)S4基因的2218~2420bp)，在S8的5’端加入BamHl酶切位點(diǎn)和CCG三個(gè)保護(hù)堿基，在S4的3’端加入XhoI酶切位點(diǎn)和ACA三個(gè)保護(hù)堿基。將設(shè)計(jì)好的目的基因序列送上海捷瑞生物工程有限公司進(jìn)行合成，并構(gòu)建到tENTRA入門(mén)載體中，質(zhì)粒命名為tENTRA_S2+S6+S10。根據(jù)載體tENTRA序列設(shè)計(jì)引物:Tentra_forward(5，-CCATGGGAACCAATTCAGTCGAC-3，)和 Tentra-reverse (5，-GTACAAGAAAGCTGGGTCTAG-3，)；以質(zhì)粒tENTRA-S2+S6+S10為模板擴(kuò)增目的基因片段，送上海生工北京測(cè)序部進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，序列用軟件DNAMAN6.0.3.99進(jìn)行分析。
[0019]實(shí)施例2三價(jià)RNAi植物表達(dá)載體的構(gòu)建
[0020]利用紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳分別檢測(cè)入門(mén)載體tENTRA_S2+S6+S10和目的載體PBDL03的濃度和純度，然后將入門(mén)載體和目的載體按照1:1的比例進(jìn)行LR反應(yīng)。按照 Gat eway? LR Clonase ? II Enzyme Mix (Invitrogen)試劑盒說(shuō)明書(shū)構(gòu)建 IOul反應(yīng)體系，25°C過(guò)夜，加入Iul的Proteinase K溶液，37°C處理IOmin終止反應(yīng)。取Iul上述反應(yīng)液轉(zhuǎn)化trans5 α感受態(tài)細(xì)胞,離心后將其均勻的涂布在含50mg/L卡那霉素的固體LB平板上，挑取單克隆用于質(zhì)粒提取和雙酶切驗(yàn)證(圖2)，并根據(jù)目的載體pBDL03上的Gus-1inker 序列設(shè)計(jì)引物⑶S3 (5’ -CAGTCCATTAATGCGTGGTCGT-3’)和⑶S4 (5’ -TGTATCACCGCGTCTTTGATCG-3’)，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序驗(yàn)證正確的RNAi植物表達(dá)載體命名為 pBDL03-S8+S10+S4。
[0021]實(shí)施例3農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因水稻的獲得
[0022]通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將RNAi植物表達(dá)載體pBDL03-S8+S10+S4轉(zhuǎn)化水稻品種泰粳394，具體實(shí)驗(yàn)步驟:
[0023](I)誘導(dǎo)愈傷組織
[0024]a:選取優(yōu)良水稻成熟 種子并脫殼成糙米。將適量的糙米轉(zhuǎn)移到50ml離心管中(以下步驟均需無(wú)菌操作)，加入75%的乙醇溶液浸潤(rùn)并清洗糙米2min，倒掉乙醇溶液，并用無(wú)菌水沖洗種子2次。
[0025]b:用有效氯為2%的次氯酸鈉清洗種子一次，間歇搖動(dòng)離心管30分鐘。倒掉次氯酸鈉溶液，用無(wú)菌水沖洗種子4次，前三次每次五分鐘，最后一次浸泡30分鐘，間歇搖動(dòng)離心管。
[0026]c:將種子轉(zhuǎn)移到無(wú)菌濾紙上吸干水分，種子晾干后轉(zhuǎn)移到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)皿分散放置10-20粒種子，并用無(wú)菌膠帶把培養(yǎng)皿封口。
[0027]d:2000Lx、28°C、光周期14/24h誘導(dǎo)愈傷組織。
[0028](2)農(nóng)桿菌培養(yǎng)
[0029]農(nóng)桿菌接種于2mL YEB液體培養(yǎng)基中，加入相應(yīng)種類(lèi)和濃度的抗生素，本實(shí)驗(yàn)所用卡那霉素和利福平的濃度均為50mg/L,28°C、180r/min培養(yǎng)過(guò)夜。菌液5000r/min離心3min，倒掉上清液，菌體重懸后加入N6-As液體培養(yǎng)基中，As的濃度為400mg/L。測(cè)定菌體濃度，0D600在0.4-0.6之間。
[0030](3)侵染和共培養(yǎng)
[0031]選取淡黃色、緊湊、質(zhì)量好的愈傷組織放入無(wú)菌的50mL離心管，將制備好的農(nóng)桿菌菌液倒入離心管內(nèi)，完全浸過(guò)愈傷組織，輕輕搖動(dòng)lOmin，室溫靜置5min。倒掉菌液，用無(wú)菌吸水紙完全吸干愈傷組織表面殘留的菌液，然后將愈傷組織轉(zhuǎn)移到N6-As共培培養(yǎng)基上，22 °C黑暗條件下共培養(yǎng)2-3d。
[0032](4)篩選
[0033]共培養(yǎng)后的愈傷組織轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的50mL離心管中，用含有500mg/L卡那霉素的無(wú)菌水沖洗三次，每次輕輕搖動(dòng)3min，再用含有600mg/L卡那霉素的無(wú)菌水清洗一次，倒掉無(wú)菌水，用無(wú)菌吸水紙吸干愈傷組織表面多余的液體。然后轉(zhuǎn)移到含有500mg/L卡那霉素和
0.5g/L水解酪蛋白的N6篩選培養(yǎng)基，25°C光照培養(yǎng)15d后更換一次培養(yǎng)基。
[0034](5)分化和生根
[0035]篩選培養(yǎng)30d后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有0.lmg/L KT (激動(dòng)素)和0.lmg/L NAA(α -萘乙酸)的N6分化培養(yǎng)基，28°C光照培養(yǎng)14h，25°C暗培養(yǎng)10h。30d左右分化出小苗后，轉(zhuǎn)移到含有1/2MS和0.5mg/L NAA的固體培養(yǎng)基生根，根系發(fā)達(dá)后移栽到溫室培養(yǎng)。
[0036]實(shí)施例4轉(zhuǎn)基因水稻的分子生物學(xué)檢測(cè)
[0037]( I)轉(zhuǎn)基因水稻的PCR檢測(cè)
[0038]用DNA快速提取法(茍小清等2012)提取TO代轉(zhuǎn)基因水稻總DNA，根據(jù)目的載體PBDL03 上的 Gus-1inker 序列設(shè)計(jì)引物:⑶S-F(5’-CGATCAAAGACGCGGTGATACA_3’)和⑶S-R(5’ -ACGACCACGCATTAATGGACTG-3’)，進(jìn)行PCR檢測(cè)，均擴(kuò)出大約650bp的片段，與目的片段大小一致，而野生型水稻沒(méi)有擴(kuò)出目的片段(圖3只顯示部分結(jié)果)。初步證實(shí)所獲得的水稻為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗。
[0039](2)轉(zhuǎn)基因水稻的熒光檢測(cè)
[0040]質(zhì)粒pBDL03包含紅色熒光蛋白mCherry基因，PCR鑒定為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因苗用BLS燈式熒光檢測(cè)器(綠色激發(fā)光光源)在黑暗條件下均可觀察到紅光，而野生型未見(jiàn)紅光(圖4)。結(jié)果進(jìn)一 步對(duì)PCR鑒定為陽(yáng)性的水稻苗進(jìn)行驗(yàn)證，而且BLS燈式熒光檢測(cè)器檢測(cè)mCherry基因的表達(dá)可以用于轉(zhuǎn)基因水稻陽(yáng)性株的快速篩選。
[0041](3) TaqMan技術(shù)初步鑒定TO代轉(zhuǎn)基因水稻的拷貝數(shù)
[0042]TaqMan實(shí)驗(yàn)由大北農(nóng)生物技術(shù)中心完成。
[0043]綜上所述，通過(guò)PCR和熒光檢測(cè)，共獲得TO代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗60株，TaqMan技術(shù)初步鑒定TO代轉(zhuǎn)基因水稻有44株單拷貝，11株中拷貝，5株多拷貝。
[0044]實(shí)施例5轉(zhuǎn)基因水稻的抗RBSDV鑒定
[0045](I)Tl代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗的準(zhǔn)備
[0046]利用TaqMan技術(shù)鑒定為單拷貝的TO代苗編號(hào)8，9，10，11，收獲種子后種植Tl代苗,經(jīng)PCR及突光檢測(cè)(未顯不)鑒定為陽(yáng)性的8號(hào)株系12株(編號(hào)8-1~18-12),9號(hào)株系5株(編號(hào)9-1~9-5), 10號(hào)株系20株(編號(hào)10-1~10-20), 11號(hào)株系8株(編號(hào)11-1~11-8)。
[0047](2)室內(nèi)接種 RBSDV
[0048]在接種籠內(nèi)用帶毒灰飛虱按照4頭/株群體接種2-3葉期Tl代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗及陰性苗，在25±3°C的溫室接種3天，每天趕蟲(chóng)2-3次。三天后用殺蟲(chóng)劑殺死介體灰飛虱，將接種幼苗移植無(wú)蟲(chóng)溫室進(jìn)行培養(yǎng)，接種45天后進(jìn)行dot-ELISA檢測(cè)及病情指數(shù)調(diào)查。病情指數(shù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參考路銀貴等人的玉米粗縮病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(路銀貴等，2006)和農(nóng)技植保函[2011]219號(hào):關(guān)于印發(fā)《南方水稻黑條矮縮病測(cè)報(bào)調(diào)查技術(shù)規(guī)范暫行辦法》的通知制定(表 I)。
[0049]表1水稻黑條矮縮病病情嚴(yán)重度分級(jí)指標(biāo)
[0050]
【權(quán)利要求】
1.一種水稻黑條矮縮病毒RNAi多價(jià)靶基因序列，其特征在于:依次包括水稻黑條矮縮病毒S8編碼區(qū)的206bp片段，對(duì)應(yīng)S8基因30~131bp，1015~1118bp JPSlO編碼區(qū)的205bp，對(duì)應(yīng)SlO基因的433~637bp ;和S4編碼區(qū)的203bp，對(duì)應(yīng)S4基因的2218~2420bp ；在S8的5’端加入BamHl酶切位點(diǎn)和CCG三個(gè)保護(hù)堿基，在S4的3’端加入XhoI酶切位點(diǎn)和ACA三個(gè)保護(hù)堿基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻黑條矮縮病毒RNAi多價(jià)靶基因序列，其特征在于:所述序列如SEQ ID N0.1所示。
3.含有權(quán)利要求1或2所述的水稻黑條矮縮病毒RNAi多價(jià)靶基因序列的RNAi中間載體。
4.含有權(quán)利要求1或2所述的水稻黑條矮縮病毒RNAi多價(jià)靶基因序列的多價(jià)RNA沉默載體。
5.用權(quán)利要求3所述的RNAi中間載體構(gòu)建的多價(jià)RNA沉默載體。
6.權(quán)利要求4所述的多價(jià)RNA沉默載體用于培育轉(zhuǎn)基因植物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于:所述植物為水稻。
8.權(quán)利要求5所述的多價(jià)RNA沉默載體用于培育轉(zhuǎn)基因植物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于:所述植物為水稻。
10.一種防治水稻黑條矮縮病毒病的方法，其特征在于:將權(quán)利要求4所述的多價(jià)RNA沉默載體轉(zhuǎn)化 入水稻植株中，獲得抗黑條矮縮病毒的水稻植株。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK103820442SQ201410082118
【公開(kāi)日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2014年3月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月7日
【發(fā)明者】郭立華, 邱德文, 楊秀芬, 曾洪梅, 袁京京, 趙成金 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所