專利名稱：水稻黑條矮縮病毒rna干涉載體、構(gòu)建方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種適合單子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化、的水 稻黑條矮縮病毒RNA干涉載體、構(gòu)建方法及其在水稻上應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水稻是世界上最重要的糧食作物之一，在我國(guó)水稻占糧食生產(chǎn)和消費(fèi)的40%，其 在糧食安全和國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有舉足輕重的作用。自2000年以來(lái)，在江蘇、浙江、福建、江西 等稻區(qū)，由水稻黑條矮縮病毒(Rice black streaked dwarf virus, RBSDV)引起的稻黑條 矮縮病沉寂多年后再度爆發(fā)流行，流行地區(qū)約60%的稻田發(fā)病，一般田塊株發(fā)病率10 30%,嚴(yán)重田塊可高達(dá)40 80%以上。2004年，在浙江省中南部雜交稻種植區(qū)發(fā)病面積80 萬(wàn)畝，僅臺(tái)州市發(fā)病面積就達(dá)48萬(wàn)畝，占水稻播種面積的33%，損失產(chǎn)量2萬(wàn)余噸。2006 2007年在江蘇桐城、鹽城、泰州等地區(qū)的華粳6號(hào)、淮稻5號(hào)、II優(yōu)084等水稻品種上，病株 率一般在20-30%，嚴(yán)重的在80%左右，有的重病田病株率甚至高達(dá)90%以上，目前已擴(kuò)展 到湖南、山東等地，因此該病已成為威脅我國(guó)水稻生產(chǎn)的又一重要的病毒病。該病毒還可以 侵染我國(guó)的主要糧食作物玉米和小麥，由水稻黑條矮縮病毒(RBSDV)引起的玉米粗縮病是 威脅玉米生產(chǎn)的重要病毒病害。流行學(xué)研究結(jié)果表明該病害暴發(fā)、流行的主要原因是品種抗性的喪失和有效傳毒 介體種群數(shù)量的上升。由于灰飛虱傳毒的瞬時(shí)性和持久性、病毒病防治藥劑缺乏，使得防蟲(chóng) 治病十分困難，農(nóng)藥的使用也存在許多弊病，因此最為經(jīng)濟(jì)有效的途徑是利用品種自身的 抗性達(dá)到主動(dòng)防治病毒病害目的。然而傳統(tǒng)的育種方法由于缺乏理想的抗源(國(guó)內(nèi)尚未發(fā) 現(xiàn)抗黑條矮縮病毒的種質(zhì)資源)，獲得抗病、高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的雙重特性品種的難度很大。RNA干涉(RNA interference，RNAi)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種重要基因沉默現(xiàn)象，它 是指通過(guò)雙鏈RNA的介導(dǎo)的特異性的降解對(duì)應(yīng)序列的mRNA，從而特異性地抑制相應(yīng)基因的 表達(dá)，是植物對(duì)外來(lái)入侵者的一種重要的防御機(jī)制。本發(fā)明以近年在我國(guó)嚴(yán)重發(fā)生的黑條 矮縮病毒(RBSDV)為對(duì)象，利用植物轉(zhuǎn)基因工程技術(shù)將RBSDV SlO的部分核苷酸導(dǎo)入水稻， 通過(guò)其特異地干擾、降解或沉默RBSDV病毒基因在水稻植株內(nèi)的正常復(fù)制、積累和傳播，篩 選獲得抗RBSDV的水稻品系，為進(jìn)一步結(jié)合常規(guī)育種工作，改良現(xiàn)有的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)但不抗病 的水稻品種，以便實(shí)現(xiàn)利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得免疫或高抗RBSDV的水稻新品系的目的。

發(fā)明內(nèi)容
基于上述目的，本發(fā)明提供了可用于農(nóng)桿菌和基因槍遺傳轉(zhuǎn)化單子葉植物的2種 含有水稻黑條矮縮病毒(RBSDV)基因的RNA干涉(RNAi)載體，這些載體分別包含致病病毒 RBSDV 的 SlO 部分片段(RBSDV-HS10)。本發(fā)明還提供這些干涉病毒基因表達(dá)載體的構(gòu)建方法及應(yīng)用，為植物抗病育種工 程提供了 一種新的策略和思路。水稻黑條矮縮病毒RNA干涉載體，包括骨架載體和含有正、反義鏈的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其特征在于以RBSDV的SlO部分片段為正、反義鏈，所述RBSDV的SlO部分片段的序列如SEQ ID N03。所述骨架載體為pMCG161載體，所述正義鏈插入在酶切位點(diǎn)AscI和AvrII間，反 義鏈插入在酶切位點(diǎn)SpeI和SacI之間，命名為pMCG161+/_B，其結(jié)構(gòu)如圖6A所示。所述骨架載體為去掉潮霉素抗性基因的pCMBIA1301載體，所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)為干涉 載體PMCG161+/-B經(jīng)BamHI、HindIII酶切得到的，命名為pCMBIA1301+/_B，其結(jié)構(gòu)如圖6B 所示。PMCG161+/-B干涉載體的構(gòu)建方法，步驟如下(1)得到如序列SEQ ID N03所示的RBSDV的SlO 部分片段；⑵將步驟(1)的基 因部分片斷經(jīng)AsCI、AvrII雙酶切后，與同樣經(jīng)AsCI、AvrII酶切的載體pMCG161連接，得到 插入正向目的片段的重組質(zhì)粒PMCG161+B ；再將步驟(1)的基因部分片斷經(jīng)SpeI、SacI雙 酶切，與經(jīng)SpeI、SaCI酶切的載體pMCG161+B連接，即可得到插入正反義鏈的RNA干涉載體 PMCG161+/-B。所述步驟(1)采用如下方式以感染水稻黑條矮縮病毒RBSDV水稻總RNA為模板， 以SEQ ID NOl和SEQ ID N02所示序列為引物對(duì)，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增得到，SEQ ID NOl :5，-AGACTAGT GGCGCGCCTAATGGCTGACATAAGACTC-3’,SEQ ID N02 :5，-AGGAGCTC CCTAGGGTTGCGTGATGTTGGGTAAAG-3’。pCMBIA1301+/-B干涉載體的構(gòu)建方法，步驟如下(1)用限制性內(nèi)切酶XhoI酶切 PCMBIA1301載體，得到去除潮霉素標(biāo)記基因的pCMBIA1301載體，即pCMBIA1301_hpt_ ； (2) 將pMCG161+/-B用BamHI、HindIII酶切，得到的發(fā)夾結(jié)構(gòu)連入pCMBIA1301_hpf，得到無(wú)標(biāo) 記基因的RNA干涉載體pCMBIA1301+/-B。所述干涉載體在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。所述應(yīng)用為將上述干涉載體轉(zhuǎn)化有關(guān)受體植物，使之對(duì)水稻黑條矮縮病毒產(chǎn)生抗 性。所述干涉載體為PMCG161+/-B，所述轉(zhuǎn)化的方法為基因槍法。所述干涉載體為PCMBIA1301+/-B，所述轉(zhuǎn)化的方法為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。所述農(nóng)桿菌為根瘤農(nóng)桿菌菌株EHA105。所述受體植物為禾本科植物。所述禾本科植物為水稻。所述水稻品種為愛(ài)知旭(Oryzasativa cv. Aichiasahi)或皖粳97 (Wanjing 97)。本發(fā)明采用感染水稻黑條矮縮病毒(RBSDV)水稻總RNA為模板，根據(jù)非常保守的 RBSDV 的 SlO 基因設(shè)計(jì)了引物 SEQ ID NOl 和 SEQ ID N02，RT-PCR 擴(kuò)增得到 RBSDV-S10 基 因部分片段即RBSDV-HS10，將其作為正義鏈和反義鏈插入骨架載體中得到本發(fā)明的干涉載 體。將本發(fā)明的干涉載體轉(zhuǎn)入受體植物中，將使RBSDV發(fā)生沉默而不表達(dá)，從而使該受體植 物產(chǎn)生RSV病毒抗性。RNA干涉載體PMCG161+/-B，適合于基因槍轉(zhuǎn)化單子葉植物，可獲得抗RBSDV的轉(zhuǎn) 基因后代，該載體攜帶有氯霉素抗性基因和除草劑篩選標(biāo)記基因。采用的骨架載體是雙向 表達(dá)載體PMCG161，將RBSDV-HS10的正義鏈插入在酶切位點(diǎn)AscI和AvrII間，將負(fù)義鏈插 入在酶切位點(diǎn)SpeI和SacI之間，通過(guò)載體上的intro (rice ffaxy-a intron 1)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，這樣可用于基因槍轉(zhuǎn)化單子葉植物本發(fā)明將用限制性內(nèi)切酶Xho I酶切pCMBIA1301載體，得到去除潮霉素標(biāo)記 基因的 PCMBIA1301 載體，即 pCMBIA1301_hpt、然后將 pMCG161+/_B 干涉載體用 BamHI、 HindIII酶切，得到的發(fā)夾結(jié)構(gòu)連入pCMBIA1301 -hpt_，得到無(wú)標(biāo)記基因的RNA干涉載體 PCMBIA1301+/-B。由于該干涉載體不僅適合于超毒力菌株，且不含有抗生素基因，有利于將 來(lái)轉(zhuǎn)基因植物的安全釋放。最終構(gòu)建的RBSDV無(wú)標(biāo)記基因RNA干涉載體pCMBIA1301+/_B不攜帶抗生素或除 草劑抗性基因，適合農(nóng)桿菌介導(dǎo)的單子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化，可獲得抗RBSDV的轉(zhuǎn)基因后代；與 攜帶潮霉素和卡那霉素抗性的抗性基因的PCMBIA1301的空白載體經(jīng)農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)進(jìn) 行單子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化對(duì)比，這樣即可方便抗性愈傷組織的篩選，又可通過(guò)后代分離，方 便得到無(wú)標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因再生植株，減少轉(zhuǎn)基因植物帶來(lái)的生物安全性隱患。根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化方法是目前應(yīng)用最為廣泛的轉(zhuǎn)化方法之一，已成 功的應(yīng)用于單、雙子葉植物的轉(zhuǎn)基因研究中。本發(fā)明最終構(gòu)建的干涉載體PCMBIA1301+/-B 適合超毒力菌株EHA105等農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化。利用根瘤農(nóng)桿菌EHA105將其導(dǎo)入 水稻，所得到的轉(zhuǎn)基因植株可以使入侵的致病病毒發(fā)生RNA沉默現(xiàn)象，使病毒不能繁殖或 積累，從而使植物具備對(duì)病毒的抗病性。本發(fā)明利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的方法進(jìn)行水稻的遺傳轉(zhuǎn)化，借助水稻細(xì)胞 RdRp的轉(zhuǎn)錄作用，產(chǎn)生RBSDV的SlO基因，再由DicerIII的作用產(chǎn)生SiRNA，當(dāng)水稻受RBSDV 侵染時(shí)，就可產(chǎn)生SiRNA，從而達(dá)到利用RNA干擾介導(dǎo)對(duì)RBSDV抗性，最終篩選出免疫或高抗 RBSDV的轉(zhuǎn)基因水稻植株。本發(fā)明已得到以水稻模式品種愛(ài)知旭為受體的水稻TO代再生植株，轉(zhuǎn)化RBSDV載 體PCMBIA1301+/-B的植株是122株，通過(guò)人工接種的方法在溫室進(jìn)行了抗病篩選，其中7 株未表現(xiàn)癥狀(0級(jí))，23株表現(xiàn)輕微癥狀(I級(jí))，54株表現(xiàn)中等癥狀(II級(jí))，38株嚴(yán)重 癥狀(III)。經(jīng)PCR檢測(cè)，未表現(xiàn)癥狀的7株全部擴(kuò)增到目的基因，表現(xiàn)輕微癥狀的23株中 有僅有8株有陽(yáng)性條帶，同時(shí)受體愛(ài)知旭28株，除1株未發(fā)病外，其余發(fā)病嚴(yán)重，全部為II 或III級(jí)，發(fā)病株率為96%。，這說(shuō)明轉(zhuǎn)基因水稻植株較受體有明顯的抗病性。本發(fā)明為植物抗病基因工程提供了一種干擾病毒基因表達(dá)載體及其構(gòu)建方法與 應(yīng)用，為轉(zhuǎn)基因技術(shù)及RNA干擾在生物抗性育種中的應(yīng)用提供了新的思路。將該載體轉(zhuǎn)入 水稻中，成功獲得了抗病植株，實(shí)現(xiàn)了利用RNA干擾原理獲得抗RSV水稻新材料的預(yù)期目 標(biāo)，為RNA干擾介導(dǎo)的植物抗性育種及基因工程提供了成功的實(shí)例，彌補(bǔ)了 RNA干擾介導(dǎo)的 RBSDV抗性在本領(lǐng)域研究中的空缺。利用本發(fā)明的干擾載體轉(zhuǎn)化所得的抗性生物體可以是任何微生物、植物或其組 織、細(xì)胞，以及由此所獲得具有任何抗病活性的微生物、植物，以及該類植物后代的種子、雜 交和轉(zhuǎn)育后代。本發(fā)明轉(zhuǎn)化單子葉植物的RNA干涉載體的構(gòu)建方法，包括如下步驟1) RBSDV特異性核苷酸序列的獲得(RBSDV-HS10)以感染水稻黑條矮縮病毒(RBSDV)水稻總RNA為模板，以SEQ ID NO. 1 (上游引 物)和SEQ ID NO. 2 (下游引物)為引物對(duì)，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增RBSDV-HS10，得到PCR產(chǎn)物，目 的片段為290bp。回收PCR產(chǎn)物，與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH 5α (購(gòu)自北京全式金公司)得到陽(yáng)性質(zhì)粒PMD18-T-HS10，進(jìn)行序列驗(yàn)證，測(cè)序正確的目的片段即可用于RNA 干涉載體的構(gòu)建。所述SEQ ID NOl和SEQ ID N02的序列如下SpeI AscI
SEQ ID NO 1 :5，-AGACTAGT GGCGCGCCTAATGGCTGACATAAGACTC-3’SacI AvrIISEQ ID N02 :5，-AGGAGCTC CCTAGGGTTGCGTGATGTTGGGTAAAG-3’2)病毒RNA干涉載體(中間載體)的構(gòu)建將上述回收的PCR產(chǎn)物經(jīng)AscI、AvrII雙酶切后，與同樣經(jīng)AscI、AvrII酶切的載 體PMCG161連接，得到插入正向目的片段的重組質(zhì)粒-PMCG161+B。同樣將上述PCR產(chǎn)物經(jīng) SpeI, SacI雙酶切，與經(jīng)Spel、SacI酶切的載體pMCG161+B連接，即可得到插入正、反義鏈 的RNA干涉載體pMCG161+/-B，經(jīng)PCR擴(kuò)增檢測(cè)、核苷酸序列分析，目的片段序列正確的干涉 載體可用于基因槍轉(zhuǎn)化單子葉植物，獲得單抗RBSDV的轉(zhuǎn)基因植株。這些干涉載體攜帶有 氯霉素抗性基因和除草劑篩選標(biāo)記基因。由于pMCG161載體帶有氯霉素抗性基因，而農(nóng)桿菌EHA105抗氯霉素，因此上述 構(gòu)建的適合基因槍轉(zhuǎn)化水稻的干涉載體不能直接用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化。而 PCAMBIA1301載體是農(nóng)桿菌法轉(zhuǎn)化水稻的常用載體，具有潮霉素抗性和卡那霉素抗性。3)無(wú)標(biāo)記基因載體pCMBIA1301_hpt_的獲得用限制性內(nèi)切酶XhoI酶切pCMBIA1301載體，經(jīng)電泳檢測(cè)、回收、純化大片段后， 再經(jīng)T4DNA連接酶16°C連接過(guò)夜，即可得到去除潮霉素標(biāo)記基因的PCMBIA1301載體，即 pCMBIA1301-hpt_。4)無(wú)標(biāo)記載體基因病毒RNA干涉載體的構(gòu)建將載體pMCG161+/-B 和 pCMBIA1301-hpf 用 BamHI、HindIII 酶切，回收大片段，在 T4DNA連接酶作用下(16°C連接過(guò)夜)，將中間載體上的發(fā)夾結(jié)構(gòu)連入pCMBIA1301-hpt_，得 到無(wú)標(biāo)記基因的RNA干涉載體pCMBIA1301+/-B。經(jīng)PCR檢測(cè)、序列分析正確的干涉載體即 可用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的單子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化，獲得不含有標(biāo)記基因的單抗RBSDV的轉(zhuǎn)基因再 生植株。


圖1. RBSDV的SlO部分片段(HSlO)的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道1. DL2000, 2.健康水稻植株，3-5. RBSDV分離物圖2.連入病毒正義鏈重組質(zhì)粒PMCG161+B的PCR鑒定結(jié)果圖3.連入正、負(fù)義鏈重組質(zhì)粒PMCG161+/-B的鑒定結(jié)果圖4.無(wú)標(biāo)記基因載體pCMBIA1301_hpt_的PCR檢測(cè)結(jié)果泳道1. DL2000，2.空白對(duì)照，3-15. pCMBIA1301_hpt-圖5.重組質(zhì)粒pCMBIA1301+/-B的PCR鑒定結(jié)果泳道l.DL2000，2.空白對(duì)照，3.空白質(zhì)粒pCMBIA1301，4_ll.重組質(zhì)粒圖6A. pMCG161+/-B干涉載體圖譜圖 6B pCMBIA1301+/-B 干涉載體圖譜圖7. RBSDV-HS10重組農(nóng)桿菌的PCR鑒定結(jié)果
泳道1. DL2000，2.空白對(duì)照，3. DH5 α ,4-10.重組質(zhì)粒 圖8.水稻成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)圖9.水稻成熟胚愈傷組織的繼代培養(yǎng)圖10.愈傷組織與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)圖11.抗性愈傷組織的篩選圖12.抗性愈傷組織的分化圖13分化小苗的壯苗培養(yǎng)圖14. TO轉(zhuǎn)基因水稻幼苗圖15. TO代轉(zhuǎn)基因再生植株的PCR鑒定泳道1. DL2000, 2.健康水稻植株，3-12.轉(zhuǎn)基因TO代植株圖16Τ0代轉(zhuǎn)基因愛(ài)知旭植株和對(duì)照在大田的抗病性表現(xiàn)Α.轉(zhuǎn)基因植株，B.非轉(zhuǎn)基因植株
具體實(shí)施例方式實(shí)驗(yàn)中所用的pMD18-T購(gòu)自大連寶生物公司(Takara公司)，感受態(tài)細(xì)胞DH 5 α 購(gòu)自北京全式金公司。實(shí)驗(yàn)中使用的載體PMCG161保存在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病毒實(shí) 驗(yàn)室(可向公眾免費(fèi)發(fā)放)，是專門適用于禾本科植物轉(zhuǎn)化的RNA干擾載體，它含有來(lái)源于 水稻的Rice waxy-a intron 1，位于5442bp_6576bp，在它的上游含有AscI和AvrII兩個(gè) 酶切位點(diǎn)，用來(lái)連接目的基因的正向片段，在它的下游含有SpeI和SacI位點(diǎn)，可用來(lái)連接 目的基因的反向片段，最終獲得雙鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)。載體pCMBIA1301是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻的常用載體(該載體保存在中國(guó)農(nóng)業(yè) 科學(xué)院植物保護(hù)研究所病毒組實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，可向公眾免費(fèi)發(fā)放)，具有潮霉素抗性和卡那霉素 抗性。經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室改造的pCMBIA1301_hpt_也可向公眾發(fā)放，通過(guò)單酶切位點(diǎn)BamHI和 HindIII可以將中間載體pMCG161+/-B上的目的基因的發(fā)夾結(jié)構(gòu)插入其中，獲得無(wú)標(biāo)記基 因，且適合農(nóng)桿菌介導(dǎo)的單子葉植物遺傳的RNA干涉載體。實(shí)施例1、適合農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的水稻黑條矮縮病毒RNA干擾載體的構(gòu)建步驟1、設(shè)計(jì)RBSDV SlO片段的RNA干涉引物根據(jù)已公布的RBSDV SlO基因的序列(NCBI No. AJ297433)，以及pMCG161載體上 存在多克隆位點(diǎn)分析，利用AscI和AvrII可以將目的基因的正向片段連接到載體；而利用 SpeI和SacI可以將SlO部分核苷酸片段的反向片段連接到載體。因此設(shè)計(jì)了下述干涉引 物SpeI AscISEQ ID NOl :5，-AGACTAGT GGCGCGCCTAATGGCTGACATAAGACTC-3’SacI AvrIISEQ ID N02 :5，AGGAGCTC CCTAGGGTTGCGTGATGTTGGGTAAAG-3’步驟2 =RBSDV SlO部分片段特異性核苷酸序列的獲得以采集自山東濟(jì)寧的感染水稻黑條矮縮病毒(RBSDV)水稻總RNA為模板，以SEQID NOl (上游引物)和SEQ ID N02 (下游引物)為引物對(duì)，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增得到約287bpd 的條帶(圖1)，回收PCR產(chǎn)物，與pMDlS-Τ載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH 5α，得到陽(yáng)性質(zhì)粒 PMD18-T-HS10，進(jìn)行序列驗(yàn)證，序列分析結(jié)果表明，目的片段為RBSDV SlO的部分核苷酸片 段，說(shuō)明本發(fā)明得到的RB SDV SlO的部分核苷酸片段。PCR 反應(yīng)條件-MV 4min, (94°C Imin，56°C Imin，72°C Imin) 30 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 IOmin0 PCR產(chǎn)物在1. 0%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)。 步驟3、RBSDV-HS10距反向片段與載體pMCG161的連接轉(zhuǎn)化將上述PCR產(chǎn)物和載體pMCG161分別經(jīng)AscI、AvrII雙酶切后，65°C處理20min， 使內(nèi)切酶失活，在T4DNALigaSe作用下連接，將正向目的片段插入載體PMCG161，轉(zhuǎn)化大腸 桿菌DH 5 α，經(jīng)PCR鑒定(圖2)、序列分析正確的重組質(zhì)粒就是含有RBSDV-HS10的正向片 段的重組質(zhì)粒，命名為PMCG161+B。同樣將上述PCR產(chǎn)物經(jīng)SpeI、SacI雙酶切，與經(jīng)SpeI、SacI酶切的載體pMCG161+B 在T4DNA Ligase作用下連接，即可得到插入RBSDV-HS10正反向片段的RNA干涉載體 pMCG161+/-B，PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3，載體圖譜見(jiàn)圖6-A。該干涉載體可用于基因槍轉(zhuǎn)化單子 葉植物，獲得抗RBSDV的轉(zhuǎn)基因植株，也可以用做構(gòu)建無(wú)標(biāo)記RNA干涉載體的中間載體。該 干涉載體攜帶有氯霉素抗性基因和除草劑篩選標(biāo)記基因。步驟4、無(wú)標(biāo)記基因載體pCMBIA1301-hpt_的獲得用限制性內(nèi)切酶Xho I酶切PCMBIA1301載體，經(jīng)大片段柱回收、純化后，再 經(jīng)T4 DNA連接酶16°C連接過(guò)夜，即可得到去除潮霉素標(biāo)記基因的PCMBIA1301載體，即 pCMBIA1301-hpt_。通過(guò)PCR檢測(cè)潮霉素標(biāo)記基因的載體擴(kuò)增的目的片段為189bp (圖4)， 含有掉潮霉素標(biāo)記基因的載體擴(kuò)增的目的片段約為1200bp。步驟5、將干涉載體pMCG161+/-B經(jīng)BamHI、HindIII酶切后，回收得到約7. 5Kb的 目的片段，在T4DNA Ligase作用下(16°C連接過(guò)夜)，將其連入pCMBIA1301-hpt_載體，經(jīng) PCR檢測(cè)(圖5)、序列分析正確的載體即為無(wú)標(biāo)記基因的RBSDV-HS10的RNA干涉載體，命名 為pCMBIA1301+/-B (其圖譜見(jiàn)圖6-B)，該載體可用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的單子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化， 分別獲得不含有標(biāo)記基因的抗RSV的轉(zhuǎn)基因再生植株。至此本發(fā)明得到了適合單子葉轉(zhuǎn)化的2種RNA干涉載體，其中一種適合基因槍的 遺傳轉(zhuǎn)化的中間載體，另一種為適合農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化的最終載體。所構(gòu)建的2種干涉載 體中，正向片段和反向片段間有約為IlOObp的水稻內(nèi)含子片段，有利于維持發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形 成。最終構(gòu)建的1種RNA干涉載體不含有抗除草劑基因，減少了將來(lái)轉(zhuǎn)基因植物存在生物 安全性的隱患。實(shí)施例2、病毒RNA干涉載體電擊轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105由于重組質(zhì)粒pCMBIA1301+/-B向農(nóng)桿菌EHA105進(jìn)行熱擊轉(zhuǎn)化的效率很低，本發(fā) 明采取了電擊轉(zhuǎn)化的方法，獲得了含有目的基因的重組農(nóng)桿菌。具體步驟如下步驟1、將1 μ g質(zhì)粒(pCMBIA1301+/-B)與150 μ 1農(nóng)桿菌ΕΗΑ105感受態(tài)混勻，力口 入到滅菌后的電擊杯中，于2. 5KV電壓下進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。步驟2、然后加800μ 1液體培養(yǎng)基沖洗電擊杯并轉(zhuǎn)入EP管，28°C，220rpm搖培2h。步驟3、再取100 200 μ 1培養(yǎng)液涂YM(Kana 50 μ g/ml ；利福平50 μ g/ml)平板， 28°C培養(yǎng)約18小時(shí)。
步驟4、經(jīng)挑取單菌落于5ml YM液體培養(yǎng)基(Kana 50 μ g/ml ；利福平50 μ g/ml)， 28°C，220rpm，搖培 16_24h 即可。步驟5、重組農(nóng)桿菌的PCR鑒定菌落PCR鑒定結(jié)果(見(jiàn)圖7)表明，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子和載體質(zhì)粒為模板的陽(yáng)性對(duì)照分別 擴(kuò)增到約290bp左右的條帶；以未轉(zhuǎn)化的空的EHA105菌液為模板的陰性對(duì)照未得到目的片
段。 實(shí)施例3RBSDV-HS10的RNA干擾載體的應(yīng)用。應(yīng)用上述含有RBSDV目的片段發(fā)夾結(jié)構(gòu)的重組農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化有關(guān)受體植物_愛(ài)知旭 水稻品種，使之產(chǎn)生對(duì)水稻黑條矮縮病毒病毒病的抗性(圖8-14)。本發(fā)明已得到以水稻模式品種愛(ài)知旭為受體的水稻TO代再生植株，轉(zhuǎn)化RBSDV載 體 pCMBIA1301+/-B 的植株是 122 株(圖 16)。實(shí)施例4、轉(zhuǎn)基因植株(TO代)的PCR鑒定本發(fā)明以SEQ ID NOl/SEQ ID N02為引物對(duì)，對(duì)以愛(ài)知旭為受體的轉(zhuǎn)RBSDV-HS10 干涉載體的再生水稻植株TO代122株進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果表明未表現(xiàn)癥狀的7株全部擴(kuò) 增到目的基因，表現(xiàn)輕微癥狀的23株中有僅有8株擴(kuò)增約為290bp的目的條帶(圖15)，陽(yáng) 性率為12.3%，說(shuō)明目的基因整合進(jìn)了水稻的基因組。實(shí)施例5、轉(zhuǎn)基因植株對(duì)水稻條紋病毒的抗性測(cè)定本發(fā)明通過(guò)人工接種的方法，在溫室對(duì)已得到122株轉(zhuǎn)基因TO代再生植株抗病篩 選，接種40天后，7株未表現(xiàn)癥狀(0級(jí))，23株表現(xiàn)輕微癥狀(I級(jí))，54株表現(xiàn)中等癥狀 (II級(jí))，38株嚴(yán)重癥狀(III)。同時(shí)接種受體28株，除1株為0級(jí)，2株為I級(jí)外，其余均 發(fā)病嚴(yán)重，全部為II或III級(jí)，發(fā)病株率為96%，這說(shuō)明轉(zhuǎn)基因水稻植株較受體有明顯的抗 病性(圖16)。雖然本發(fā)明只采用了 PCMBIA1301+/-B轉(zhuǎn)化了水稻，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根 據(jù)常規(guī)知識(shí)可以得知，采用基因槍法同樣可以將PMCG161+/-B轉(zhuǎn)化其它受體植株，得到相 同的效果。
權(quán)利要求
水稻黑條矮縮病毒RNA干涉載體，包括骨架載體和含有正、反義鏈的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其特征在于以RBSDV的S10部分片段為正、反義鏈，所述RBSDV的S10部分片段的序列如SEQ ID NO3。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻黑條矮縮病毒RNA干涉載體，所述骨架載體為PMCG161 載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的水稻黑條矮縮病毒RNA干涉載體，所述正義鏈插入在酶切位 點(diǎn)AscI和AvrII間，反義鏈插入在酶切位點(diǎn)SpeI和SacI之間。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻黑條矮縮病毒RNA干涉載體。所述骨架載體為去掉潮霉 素抗性基因的PCMBIA1301載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻黑條矮縮病毒RNA干涉載體，所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)為權(quán)利要求 3所述的水稻黑條矮縮病毒RNA干涉載體經(jīng)BamHI、HindIII酶切得到。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻黑條矮縮病毒RNA干涉載體的構(gòu)建方法，步驟如下(1)得到如序列SEQID N03所示的RBSDV的SlO部分片段；(2)將步驟(1)的基因部分片斷經(jīng)AscI、AvrII雙酶切后，與同樣經(jīng)AscI、AvrII酶切 的載體PMCG161連接，得到插入正向目的片段的重組質(zhì)粒pMCG161+B;再將步驟(1)的基因 部分片斷經(jīng)SpeI、SaCI雙酶切，與經(jīng)SpeI、SaCI酶切的載體pMCG161+B連接，即可得到插入 正反義鏈的RNA干涉載體pMCG161+/-B。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，所述步驟(1)采用如下方式以感染水稻黑條矮縮病 毒RBSDV水稻總RNA為模板，以SEQ ID NOl和SEQ ID N02所示序列為引物對(duì)，經(jīng)RT-PCR 擴(kuò)增得到，SEQ ID NOl :5’ -AGACTAGT GGCGCGCCTAATGGCTGACATAAGACTC-3’，SEQ ID N02 :5’ -AGGAGCTC CCTAGGGTTGCGTGATGTTGGGTAAAG-3’。
8.權(quán)利要求5所述的水稻黑條矮縮病毒RNA干涉載體的構(gòu)建方法，步驟如下(1)用 限制性內(nèi)切酶XhoI酶切pCMBIA1301載體，得到去除潮霉素標(biāo)記基因的pCMBIA1301載體， 即pCMBIA1301-hpt_ ； (2)將權(quán)利要求3所述的水稻黑條矮縮病毒RNA干涉載體用BamHI、 HindIII酶切，得到的發(fā)夾結(jié)構(gòu)連入pCMBIA1301-hpt_，得到無(wú)標(biāo)記基因的RNA干涉載體 PCMBIA1301+/-B。
9.權(quán)利要求1-5任一所述的水稻黑條矮縮病毒RNA干涉載體在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，為將權(quán)利要求1-5任一所述的水稻黑條矮縮病毒RNA 干涉載體轉(zhuǎn)化有關(guān)受體植物，使之對(duì)水稻黑條矮縮病毒產(chǎn)生抗性。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，所述干涉載體為權(quán)利要求3所述的水稻黑條矮縮病 毒RNA干涉載體，所述轉(zhuǎn)化的方法為基因槍法。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，所述干涉載體為權(quán)利要求5所述的水稻黑條矮縮病 毒RNA干涉載體，所述轉(zhuǎn)化的方法為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，所述農(nóng)桿菌為根瘤農(nóng)桿菌菌株EHA105。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的應(yīng)用，所述受體植物為禾本科植物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的應(yīng)用，所述禾本科植物為水稻。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的應(yīng)用，所述水稻品種為愛(ài)知旭或皖粳97。
全文摘要
本發(fā)明涉及“水稻黑條矮縮病毒RNA干涉載體、構(gòu)建方法及應(yīng)用”，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明將如SEQ ID NO 3所示的序列作為正、反義鏈建立了水稻條紋病毒RNA干涉載體pMCG161+/-B和pCMBIA1301+/-B。本發(fā)明為植物抗病基因工程提供了一種干擾病毒基因表達(dá)載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，為轉(zhuǎn)基因技術(shù)及RNA干擾在生物抗性育種中的應(yīng)用提供了新的思路。將該載體轉(zhuǎn)入水稻中，成功獲得了抗病毒植株，實(shí)現(xiàn)了利用RNA干擾原理獲得抗RBSDV水稻新材料的預(yù)期目標(biāo)，為RNA干擾介導(dǎo)的植物抗性育種及基因工程提供了成功的實(shí)例，彌補(bǔ)了RNA干擾介導(dǎo)的RBSDV抗性在本領(lǐng)域研究中的空缺。
文檔編號(hào)C12N15/66GK101967491SQ20101027609
公開(kāi)日2011年2月9日 申請(qǐng)日期2010年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月1日
發(fā)明者劉艷, 吳蓓蕾, 李紅偉, 李莉, 王錫鋒 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所