專利名稱：一種同時快速檢測多種微生物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物與醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，可以用于(但不限于)醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)和植物保護等基礎(chǔ)或應(yīng)用方面。
2.背景技術(shù)檢測微生物具有重要的基礎(chǔ)與應(yīng)用價值。例如，檢測醫(yī)學(xué)病原微生物，如艾滋病毒，能夠診斷艾滋病，或評價艾滋病人治療的效果；檢測獸醫(yī)病原微生物，如禽流感病毒，能夠診斷禽流感疫情；檢測農(nóng)作物的病原微生物，如水稻矮縮病毒，可以研究水稻矮縮病的防控措施。
微生物的檢測有多種技術(shù)。本發(fā)明所用的技術(shù)，追根溯源，是用PCR技術(shù)。PCR技術(shù)中文叫做聚合酶鏈式反應(yīng)，它是通過特異的引物來檢測各種微生物特有的核酸序列，并通過檢測微生物特有的核酸序列來達到檢測微生物的目的。
現(xiàn)有的檢測微生物的PCR技術(shù)絕大多數(shù)是一次操作只檢測一種微生物，只有少數(shù)能同時檢測多種微生物[1]。這些少數(shù)同時檢測多種微生物的PCR技術(shù)是在同一個PCR反應(yīng)管中加上多對引物，每對引物對應(yīng)不同的微生物，從而達到同時檢測多種微生物的目的，這種方法叫做Multiplex PCR技術(shù)[2，3，4，]。MultiplexPCR技術(shù)可以通過跑核酸電泳來檢測，也可以通過熒光信號來檢測[3，4]。它是和本發(fā)明最為接近的技術(shù)，但是和本發(fā)明又有許多不同。
Multiplex PCR技術(shù)至少有2個不足之處1)用此方法同時檢測的微生物的種類越多，它的反應(yīng)體系內(nèi)部的引物種類就越多，引物之間相互干擾性就越強，因而它能同時檢測的微生物的種類非常有限，一般不超過4種；2)如果通過熒光信號來閱讀檢測結(jié)果，上述干擾性更為突出。
本發(fā)明是以同時檢測雞禽流感病毒、新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、雞傳染性喉支氣管炎病毒、雞敗血霉形體、雞嗜血桿菌等雞6種病原微生物為例，具體說明本發(fā)明具體實施過程。以前從未有過同時檢測這6種病原微生物的實驗室方法的報道，也從未有過用本發(fā)明所用的方法檢測雞病原微生物的報道。
參考文獻[1]<作者>Dieffenbach CW，Dveksler GS.<書名>PCR PrimerA Laboratory Manual.<出版社>Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995年.<作者>Helps C，Reeves N，Egan K，Howard P，Harbour D.<期刊名>Detection ofChlamydophila felis and feline herpesvirus by multiplex real-time PCR analysis.Journal of Clinical Microbiology，2003年第41卷第6期第2734-2736頁[3]<作者>Beuret C.<題名>Simultaneous detection of enteric viruses by multiplexreal-time RT-PCR.<期刊名>Journal of Virological Methods，2004年第115卷第1期第1-8頁.<作者>Stram Y，Kuznetzova L，Guini M，等.<題名>Detection and quantitation ofAkabane and Aino viruses by multiplex real-time reverse-transcriptase PCR.<期刊名>Journal of Virology Methods，2004年第116卷第2期第147-154頁.
3.發(fā)明內(nèi)容為克服現(xiàn)有的PCR技術(shù)不能同時檢測很多種微生物，以及難以用通過熒光信號來閱讀檢測結(jié)果的兩個不足，本發(fā)明的發(fā)明人設(shè)計并通過試驗確認了一種新的PCR技術(shù)。這項PCR技術(shù)被本發(fā)明人命名為“同組PCR”技術(shù)。它針對本發(fā)明的技術(shù)問題的解決方案是設(shè)計一組PCR反應(yīng)，這一組PCR各個PCR反應(yīng)發(fā)生在不同的管子中，因而不相互干擾；所要檢測的各種微生物分別對應(yīng)著這一組PCR反應(yīng)中某一個或幾個PCR反應(yīng)，這一組PCR反應(yīng)共用同一臺PCR儀器和同一個反應(yīng)程序，從而達到同時檢測多種微生物的效果；各個PCR反應(yīng)所擴增的產(chǎn)物在50bp-1000bp之間，使得既能夠通過核酸電泳來閱讀檢測結(jié)果，也能夠通過熒光信號來閱讀檢測結(jié)果。
現(xiàn)在許多PCR儀器都有96個反應(yīng)孔，如果一種微生物平均對應(yīng)著兩個PCR反應(yīng)，每個PCR反應(yīng)只需要占用PCR儀器上一個反應(yīng)孔，那么在一個有96孔的PCR儀上按照上述“同組PCR技術(shù)”最多可以檢測48種微生物。
由于這一組共用同一臺PCR儀器和同一個反應(yīng)程序，所以在引物設(shè)計時受到一定的限制。例如，如果采用普通的PCR儀器，則理論上這一組PCR反應(yīng)中各個PCR反應(yīng)所用的引物Tm值應(yīng)當(dāng)大致相同，而且擴增產(chǎn)物的大小也大致相同，使得各個PCR反應(yīng)可以共用同一個檢測程序，甚至反應(yīng)體系內(nèi)除引物外其余成分都可一致；如果采用梯度PCR儀器，則這一組PCR反應(yīng)中各個PCR反應(yīng)所用的引物Tm值可以有一定的差異，但是各個PCR反應(yīng)需要放在合適的位置上，使得各個PCR反應(yīng)可以采用同一個反應(yīng)程序。
本發(fā)明的“同組PCR”技術(shù)有以下幾種形式(并不局限于以下幾種)。
1)普通的同組PCR技術(shù)，特征是檢測的核酸模板是DNA或由RNA轉(zhuǎn)化而來的cDNA，它是各種形式的“同組PCR”技術(shù)的核心和基礎(chǔ)。
2)同組RT-PCR技術(shù)，特征是檢測的核酸模板是RNA，它在PCR反應(yīng)前進行反轉(zhuǎn)錄(英文縮寫為“RT”)，將RNA轉(zhuǎn)化為DNA，再進行PCR反應(yīng)。
3)熒光同組PCR技術(shù)，它的特征是用熒光信號檢測PCR反應(yīng)的結(jié)果，可以進一步細分為檢測DNA的普通的熒光同組PCR技術(shù)和檢測RNA的熒光同組RT-PCR技術(shù)。
4)同組梯度PCR技術(shù)，它的特征是用梯度PCR儀器來操作，這一組PCR反應(yīng)中各個PCR反應(yīng)所用的程序不同，但是在某些環(huán)節(jié)中各個PCR反應(yīng)的溫度可以不同(即可以有一定的梯度)，此技術(shù)可以實際上放寬了同組PCR技術(shù)對引物的設(shè)計要求，但是每個PCR反應(yīng)應(yīng)當(dāng)放在某一個確定的位置上。同組梯度PCR技術(shù)可以進一步細分為檢測DNA的普通的同組梯度PCR技術(shù)和檢測RNA的同組梯度RT-PCR技術(shù)。
由于各種微生物，無論是基因組為DNA的微生物，還是基因組為RNA的微生物，其基因流動過程中都存在RNA這個階段，因此理論上我們可以提取樣品中的總RNA，通過上述同組RT-PCR技術(shù)達到檢測各種微生物的目的。
同組RT-PCR技術(shù)中RT和PCR兩個步驟可以分開來操作，也可以并成一個步驟。如果分開來操作，利用隨機引物進行RT可以制備同組PCR反應(yīng)中各個反應(yīng)都能共用的cDNA模板。
與已有的并且最為接近的技術(shù)方案，即Multiplex PCR反應(yīng)相比，同組PCR技術(shù)有益效果是1)它能同時檢測很多種微生物，種類達到幾十種以上；2)各種微生物的檢測發(fā)生在不同的一個體系之內(nèi)，相互沒有干擾；3)可以通過熒光信號來閱讀檢測結(jié)果，并且通過熒光信號來閱讀檢測結(jié)果各個微生物檢測體系仍然不相互干擾。
4.具體實施方式
下面以同時檢測雞禽流感病毒、新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、雞傳染性喉支氣管炎病毒、雞敗血霉形體、雞嗜血桿菌為例具體說明本發(fā)明。
第一步，引物設(shè)計。
設(shè)計并合成出12對引物(可以在上海生物工程有限公司合成)，分別對應(yīng)著上述雞6種病原微生物的基因組(每種微生物對應(yīng)2對引物)，這些引物的序列以前別人沒有報道過，它們的序列如下1)禽流感病毒第一對引物(編號為A1)INFS1(引物名稱，下同)AAGCCGAGATCGCGCAGAGAC(引物序列，下同)INFR1CCTTAGTCAGAGGTGACAGGATTGGTC2)禽流感病毒第二對引物(編號為A2)INFS2GCACTTGATATTGTGGATTCTTGATCGTINFR2CTCATAGACTCAGGCACTCCTTCCGT3)新城疫病毒第一對引物(編號為A3)NDVS1AACCACTCAGGCAAGGTGCTCTCANDVR1GCAAGGGCAACATGGTTCCTCA4)新城疫第二對引物(編號為A4)NDVS2TCTCTATCCAGGCTCAAGTATGGGTCAC
NDVR2ACTCATCTGCTGTCTCATACGCAGTCA5)雞傳染性支氣管炎病毒第一對引物(編號為A5)IBVS1ATGGCAAGCGGTAAGGCAACTGGIBVR1GGTGGCTTTGGTCCTCCTAGTTTGAT6)雞傳染性支氣管炎病毒第二對引物(編號為A6)IBVS2TAGTGTGGGTTGCTGCTAAGGGTGCIBVR2TCCCAACGGAAATTACCATCAGGTC7)雞傳染性喉支氣管炎病毒第一對引物(編號為A7)ILTVS1TGTCTTATTCCTCGTAGATAGGCACCCAILTVR1CCGCTTAGATATTGTGCAACAGGGA8)雞傳染性喉支氣管炎病毒第二對引物(編號為A8)ILTVS2GGATTTGGATATTTGCGAACAGGCILTVR2TGTACGTTGGAGGTAGGTGGTAGTATTCAT9)雞敗血霉形體第一對引物(編號為A9)mycopR1TGTGTTAACTGCAGCACCGAAGTATTCmycopS1ACTGTAAACGATGGATGTTAAGTGTCGGA10)雞敗血霉形體第二對引物(編號為A10)mycopS2CGCGTGAACGATGAAGGTCTTTTTAGmycopR2AATGGTACAGTCAAATTAATAGCTTTCCACTCTA11)雞嗜血桿菌第一對引物(編號為A11)HaemS1AAACCAACTAAAAGAGCAGCCCCTAATHaemR1CCATTGATATTCAACACGTAATGCAAGT12)雞嗜血桿菌第二對引物(編號為A12)
HaemS2CGAAGCAGCCAACTTAAAATTATCACAACHaemR2GAAACTAAGTAGTTAGCCACAGTGTCAGCAC第二步，組裝檢測試劑。
1)引物稀釋將每對引物等摩爾混合，并用純水將每個引物稀釋成12.5μmol/L，冷凍儲存；2)組裝反應(yīng)混合液(編號為“Mix 1”，所需試劑可以購自西安華美生物工程公司)反應(yīng)混合液中除了純水之外，還含有0.8mmol/L dNTP、3mmol/L MgCl2、(1/10)反應(yīng)體積的10x PCR緩沖液，1單位/25μL的Taq DNA聚合酶，(1/25)反應(yīng)體積的25×SYBR Green I。
第三步，反轉(zhuǎn)錄。
1)用Trizol(美國Invitrigen公司生產(chǎn))提取檢測樣品總RNA；2)用隨機引物進行反轉(zhuǎn)錄，所需試劑可以購自西安華美生物工程公司，具體的體系含有dNTP，0.8mmol/L；MgCl2，3mmol/L；5x RT緩沖液，1/5反應(yīng)總體積；隨機引物(N)6，2μmol/L；AMV逆轉(zhuǎn)錄酶，1U/25μL；RNasin，20U/μL，提取的RNA占反轉(zhuǎn)錄總體積(1/5)，反轉(zhuǎn)錄總體積25μL。然后，42攝氏度，反應(yīng)1個小時。
第四步，熒光同組PCR反應(yīng)。
1)取12μL上述第三步中反轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物(余下部分作為備份凍存起來)，加入到300μL的上述第二步中組裝的反應(yīng)混合液Mix 1，混勻，分裝到12個熒光PCR反應(yīng)管中，每個管24μL，然后依次加入上述第二步稀釋的12對引物，每管加1μL引物，進行熒光PCR反應(yīng)。
2)熒光PCR反應(yīng)條件為94攝氏度3分鐘，1個循環(huán)；94攝氏度30秒-60攝氏度30秒-72攝氏度1分鐘，4個循環(huán)；92攝氏度30秒-66攝氏度1分鐘，72攝氏度30秒，36個循環(huán)，在72攝氏度時收集熒光信號；95攝氏度2分鐘，再72攝氏度1分鐘，再從72攝氏度開始測定PCR產(chǎn)物的Tm值，每隔0.5攝氏度收集1次熒光信號。
第五步，結(jié)果分析。
1)在檢測未知樣品前，先用這6種病原微生物的標準陽性樣品按照上述過程各檢測10次，計算各個熒光PCR特異性產(chǎn)物的Tm值和非特異性產(chǎn)物的Tm值。
2)在檢測未知樣品時，如果某一個對應(yīng)A微生物的反應(yīng)孔出現(xiàn)PCR陽性熒光信號，并且產(chǎn)物的Tm值也與預(yù)期的一致，則被測樣品含有A微生物的可能性很大；此時如果另外一個也對應(yīng)A微生物的反應(yīng)孔也出現(xiàn)PCR陽性熒光信號，并且產(chǎn)物的Tm值也與預(yù)期的一致，那么可以認定被測樣品含有A微生物；如果代表某一種微生物的兩個反應(yīng)孔都沒有出現(xiàn)PCR陽性熒光信號，或者產(chǎn)物的Tm值都與預(yù)期的不一致，則說明樣品中沒有此種微生物。
權(quán)利要求
1.用“同組PCR”技術(shù)來建立同時檢測多種微生物的技術(shù)，其特征是1)檢測反應(yīng)實際包含一組PCR反應(yīng)，這一組PCR反應(yīng)中各個PCR反應(yīng)發(fā)生在不同的管子中，因而不相互干擾；2)所要檢測的各種微生物分別對應(yīng)著這一組PCR反應(yīng)中某一個或幾個PCR反應(yīng)；3)各條引物設(shè)計恰當(dāng)，使得這一組PCR反應(yīng)可以共用同一臺PCR儀器和同一個反應(yīng)程序，甚至反應(yīng)體系內(nèi)除引物外其余成分都可一致；4)各個PCR反應(yīng)所擴增的產(chǎn)物在50bp-1000bp之間，使得既能夠通過核酸電泳來閱讀檢測結(jié)果，也能夠通過熒光信號來閱讀檢測結(jié)果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的技術(shù)，其特征是檢測對象為醫(yī)學(xué)病原微生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的技術(shù)，其特征是檢測對象為動物病原微生物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的技術(shù)，其特征是檢測對象為植物病原微生物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的技術(shù)，其特征是檢測對象為雞病原微生物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的技術(shù)，其特征是1)檢測對象為雞病原微生物；2)所用的引物含有以下12對共24條引物中任意一條或與其中任意一條相差不到3個堿基的引物AAGCCGAGATCGCGCAGAGAC，CCTTAGTCAGAGGTGACAGGATTGGTC，GCACTTGATATTGTGGATTCTTGATCGT，CTCATAGACTCAGGCACTCCTTCCGT，AACCACTCAGGCAAGGTGCTCTCA，GCAAGGGCAACATGGTTCCTCA，TCTCTATCCAGGCTCAAGTATGGGTCAC，ACTCATCTGCTGTCTCATACGCAGTCA，ATGGCAAGCGGTAAGGCAACTGG，GGTGGCTTTGGTCCTCCTAGTTTGAT，TAGTGTGGGTTGCTGCTAAGGGTGC，TCCCAACGGAAATTACCATCAGGTC，TGTCTTATTCCTCGTAGATAGGCACCCA，CCGCTTAGATATTGTGCAACAGGGA，GGATTTGGATATTTGCGAACAGGC，TGTACGTTGGAGGTAGGTGGTAGTATTCAT，TGTGTTAACTGCAGCACCGAAGTATTC，ACTGTAAACGATGGATGTTAAGTGTCGGA，CGCGTGAACGATGAAGGTCTTTTTAG，AATGGTACAGTCAAATTAATAGCTTTCCACTCTA，AAACCAACTAAAAGAGCAGCCCCTAAT，CCATTGATATTCAACACGTAATGCAAGT，CGAAGCAGCCAACTTAAAATTATCACAAC，GAAACTAAGTAGTTAGCCACAGTGTCAGCAC。
全文摘要
設(shè)計并通過試驗確認了一種新的PCR技術(shù)。此技術(shù)被發(fā)明人命名為“同組PCR”技術(shù)，它可以用來同時檢測多種微生物?！巴MPCR”是一組PCR反應(yīng)，這一組PCR反應(yīng)中各個PCR反應(yīng)發(fā)生在不同的PCR反應(yīng)管中，但是各個PCR反應(yīng)都采用同一臺PCR儀器并共用同一個反應(yīng)程序，甚至反應(yīng)體系內(nèi)除引物外其余成分都可一致，從而達到同時檢測多種微生物的效果。此“同組PCR”技術(shù)可以有普通的“同組PCR”、“同組RT－PCR”、“同組熒光PCR”、“同組熒光RT－PCR”、“同組梯度PCR”、“同組梯度RT－PCR”等多種形式。本發(fā)明以同時檢測雞禽流感病毒、新城疫病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、雞傳染性喉支氣管炎病毒、雞敗血霉形體、雞嗜血桿菌等雞6種病原微生物為例，具體說明用“同組PCR”技術(shù)同時檢測多種微生物的過程。
文檔編號C12Q1/04GK1657635SQ20041000713
公開日2005年8月24日 申請日期2004年2月19日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月19日
發(fā)明者陳繼明, 王志亮 申請人:農(nóng)業(yè)部動物檢疫所