一種快速檢測松材線蟲的方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明屬于病蟲害檢疫領域，尤其涉及一種快速檢測松材線蟲的方法。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003] 松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)是造成松樹萎蔫病的一種病原線蟲，是 松樹的毀滅性病害。該病在日本、韓國、美國、加拿大、墨西哥等國均有發(fā)生，但危害程度不 一，其中以日本受害最重。此病1982年中國在南京市中山陵首次發(fā)現(xiàn)，而后相繼在安徽、廣 東、山東、浙江等省（區(qū)）局部地區(qū)發(fā)現(xiàn)并流行成災，導致大量松樹枯死，對我國的松林資源、 自然景觀和生態(tài)環(huán)境造成嚴重破壞，而且有繼續(xù)擴散蔓延之勢。被列為對內(nèi)、對外的檢疫性 林業(yè)有害生物。
[0004] 松材線蟲近距離傳播靠天牛等媒介昆蟲傳帶，遠距離傳播則主要借助感病苗木、 松材、枝椏及其他松木制品的調(diào)運進行。但是，有時松木、松木包裝材料中分離出來的線蟲 僅僅是滑刃類幼蟲，尤其是在冬季，松材線蟲在幼蟲階段越冬，因此在形態(tài)上就不能確定所 檢獲的線蟲是否是松材線蟲，必需經(jīng)過培養(yǎng)，促使幼蟲發(fā)育成為成蟲后，根據(jù)成蟲的形態(tài)特 征對其進行種的鑒定。
[0005] 目前，林間松材線蟲病的檢測和診斷中，把松材線蟲幼蟲培養(yǎng)成成蟲通常是將被 松材線蟲為害的松木樣品劈成小木條(直徑小于Icm)，在燒杯中清水浸泡24h，用篩子過濾 線蟲，將線蟲液倒進小培養(yǎng)皿中，置顯微鏡下，挑取3齡幼蟲到燒杯中，制備線蟲液作為培養(yǎng) 蟲樣。然后以真菌菌絲作為營養(yǎng)來源，以馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)平板、玉米粒為基質(zhì)進行 真培養(yǎng)，36h后可培養(yǎng)出成蟲來。這種方法從浸泡樣品到培養(yǎng)出成蟲需要60h的時間，還沒包 括挑取線蟲、制備線蟲液和制作PDA培養(yǎng)基的時間。這對于貨物來說停放時間長了，影響流 通和業(yè)主的生意，如果是苗木還因時間長失水而影響成活率。
[0006] 還有采用生物檢測儀器來檢測松材線蟲，但這種生物檢測儀器成本高，且準備和 檢測后觀察時間較長，正準率也無法達到100%。
[0007] 如何盡量縮短檢測時間，就成了急需解決的問題，尤其是口岸檢疫。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為了解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明的供一種快速檢測松材線蟲成蟲的方法，此方法 快速、成本低、易操作，適用范圍廣，不受檢測地域或條件的限制。
[0009] 解決以上技術(shù)問題的本發(fā)明中的一種快速檢測松材線蟲成蟲的方法，其特征在 于:包括以下步驟： (1)把野外采集回來的松材樣本用清水洗去雜質(zhì);把采集回來的標本上的泥土、木肩、 灰塵等贓物洗干凈，使之在浸泡時候的浸泡液中沒有雜質(zhì)。
[0010] (2 )把松材樣本放在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光照條件600LX-1200LX，溫度24-30°C，濕 度60-90%，時間8-12h; (3)把松材樣品劈成小木條，在燒杯中清水浸泡，同時置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，時間8-12h，溫度 24-30°C，光照條件600-1200LX，濕度60-90%; 經(jīng)步驟(2)培養(yǎng)后的松材再劈成小木條在中清水浸泡，使木條中的線蟲充分游離到水 中，同時由于在松材線蟲的適生溫度下浸泡，線蟲分離出來的時間要比冬天低溫條件下縮 短很多。
[0011] 本發(fā)明中用松材樣品直接培養(yǎng)，松材線蟲是在樣品內(nèi)部，少于8小時，難以培養(yǎng)出。
[0012] (4)用淺盤法分離鏡檢，在普通顯微鏡下觀察； 若有成蟲，則松材有病癥，需要進行相應的處理;若沒有成蟲，則松材沒有病癥。
[0013] 因為蟲種的鑒定，是基于成蟲的特征，幼蟲無法鑒定，本實驗是快速把松木樣本中 的松材線蟲幼蟲培養(yǎng)成成蟲，以便于鑒定。
[0014] 淺盤法分離，即同漏斗分離法一樣，是分離線蟲的一種方法。而淺盤法是用淺盤對 松材樣品進行浸泡，用漏斗進行過慮，淺盤法比漏斗分離法能獲得更多的線蟲。松材線蟲子 很小，只能在顯微鏡下才能看見。
[0015] 本發(fā)明的優(yōu)化方案中所述步驟（2)中溫度25-28°C，濕度70-85%。松材線蟲的最適 溫度是25-28°C，超過32°C不能發(fā)育。濕度過低，樣品容易被烘干。
[0016] 進一步優(yōu)化方案中所述步驟(2)中溫度26°C，濕度80%。
[0017]又一優(yōu)化方案中所述步驟(2)中，光照條件700-1100LX，進一步優(yōu)化方案中所述步 驟(2)中，光照條件800-1000LX。
[0018]所述步驟(3)中小木條直徑<0.5cm。木條若直徑太大，線蟲無法充分游離出來。 本發(fā)明中這種檢測方法只需要16-24h的時間，能獲得相當多的成蟲供種類鑒定，較傳 統(tǒng)方法少了三分之二以上的時間，且操作簡單，方便，成本低，不需要太多的儀器和設備及 高深的技術(shù)，只需要幾個簡單的設備儀器就能發(fā)到檢測目的，且準確和重復性好，便于推廣 應用。應用前景廣闊，適用于各口岸檢疫機關(guān)，國內(nèi)各級森防檢疫機構(gòu)等，適應口岸貨物木 包裝的快速轉(zhuǎn)運，快速處理的要求;也適用于不緊急調(diào)運的情況。
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【具體實施方式】
[0020] 以下通過實例對本發(fā)明作進一步的說明，其中本發(fā)明中所需設備:光照培養(yǎng)箱、顯 微鏡各一臺，燒杯、漏斗、膠管、載玻片和蓋玻片>1。
[0021] 實例 1 把野外采集回來的松材(苗)用清水洗去泥沙或灰塵等雜質(zhì);將把樣本放在26°C的光照 培養(yǎng)箱，在光照600LX和濕度60%條件下，經(jīng)過8h，松材線蟲就會從幼蟲成長為成蟲;把松材 (苗)樣品劈成小木條(直徑小于〇.5cm)，在燒杯中清水浸泡，同時置于26°C的光照培養(yǎng)箱中 8h，光照600LX和濕度60%條件下;再用淺盤法分離鏡檢，在普通顯微鏡下就可以看到成蟲。 [0022]松材線蟲生長繁殖的最適溫度為25°C，低于10°C時不能發(fā)育，28°C以上繁殖會受 到抑制，在33°C以上則不能繁殖。
[0023]實例2 把野外采集回來的松材用清水洗去泥沙或灰塵等雜質(zhì);將把樣本放在24°C的光照培養(yǎng) 箱，在光照700LX和濕度90%條件下，經(jīng)過12h，松材線蟲就會從幼蟲成長為成蟲;把松材(苗） 樣品劈成小木條(直徑小于0.5cm)，在燒杯中清水浸泡，同時置于24°C的光照培養(yǎng)箱中12h， 光照700LX和濕度90%條件下;再用淺盤法分離鏡檢，在普通顯微鏡下就可以看到成蟲。
[0024] 實例3 把野外采集回來的松材用清水洗去泥沙或灰塵等雜