一種鱷魚(yú)骨膠原蛋白肽粉的制備方法及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本申請(qǐng)涉及生物制品領(lǐng)域，更具體地，涉及一種鱷魚(yú)骨膠原蛋白肽粉的制備方法 及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 膠原蛋白是人體或其他動(dòng)物體內(nèi)含量最豐富的一類蛋白質(zhì)，主要存在于骨、皮、肌 腱、血管等組織，作為結(jié)締組織中極為重要的一種蛋白質(zhì)，起著支撐器官、保護(hù)機(jī)體的功能。 膠原蛋白作為天然的高分子化合物，具有合成高分子材料無(wú)法比擬的生物相容性和可降解 性，所以用途非常廣泛，遍及醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域。
[0003] 膠原蛋白肽是一種新型膠原蛋白類產(chǎn)品，是以膠原蛋白或富含膠原蛋白的物質(zhì)為 原料制備的。它具有原膠原蛋白或組成氨基酸所不具有的獨(dú)特生理功能，可完全溶解于水， 水溶液粘度低，分子量較小，因此，它更容易透過(guò)表皮被真皮吸收，也容易通過(guò)消化道被消 化，在日化、保健食品領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。
[0004] 關(guān)于膠原蛋白肽的制備，目前多見(jiàn)于以豬、牛的皮和骨、或水產(chǎn)來(lái)源酶解處理獲得 的膠原蛋白肽的研究。而以鱷魚(yú)特別是鱷魚(yú)骨為原料的膠原蛋白肽還少見(jiàn)報(bào)道。隨著鱷魚(yú) 人工養(yǎng)殖與繁殖技術(shù)的日趨成熟，食用鱷的量大增，每年都有大量的鱷魚(yú)骨被丟棄，不僅造 成資源浪費(fèi)，而且還會(huì)污染環(huán)境。如果能合理利用鱷魚(yú)骨的價(jià)值，將變廢為寶，并帶來(lái)顯著 的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值。
[0005] 目前膠原蛋白肽的制備，多采用酶解的生物學(xué)方法。酶法作用條件較溫和，產(chǎn)品的 相對(duì)分子質(zhì)量分布較窄，反應(yīng)條件和過(guò)程容易控制，安全性較高。酶法制備的膠原蛋白肽不 僅可應(yīng)用于功能性食品上，在醫(yī)學(xué)和藥學(xué)方面的應(yīng)用也被廣泛關(guān)注。由于原料為鱷魚(yú)骨，成 分質(zhì)地比較特殊，普通蛋白酶無(wú)法對(duì)鱷魚(yú)骨膠原蛋白進(jìn)行徹底地水解，且水解得到的產(chǎn)物 其生物學(xué)效應(yīng)不顯著。因此，對(duì)鱷魚(yú)骨進(jìn)行水解的難點(diǎn)在于水解酶的選擇以及不同酶間的 組合。由于不同底物的分子結(jié)構(gòu)和氨基酸序列存在差異，而不同的蛋白酶的水解作用位點(diǎn) 又不同，這直接導(dǎo)致不同蛋白酶的水解產(chǎn)物具有不同的生物學(xué)性質(zhì)和不同的相對(duì)分子質(zhì)量 分布范圍。酶的不同組合方式是調(diào)整產(chǎn)物分子質(zhì)量及分布的有效方法。在選擇用于水解鱷 魚(yú)骨的蛋白酶時(shí)，酶系、酶作用的強(qiáng)弱、酶的作用位點(diǎn)等都會(huì)對(duì)最終產(chǎn)物產(chǎn)生重要影響，對(duì) 多肽產(chǎn)品開(kāi)發(fā)起著至關(guān)重要的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明涉及一種鱷魚(yú)骨膠原蛋白肽粉的制備方法，包括:A.在溶劑中高壓蒸煮已 去除肌肉、脂肪的鱷魚(yú)骨，濃縮得鱷魚(yú)骨膠;B.將得到的鱷魚(yú)骨膠用蛋白酶處理，得到酶解 液;C.將所述酶解液離心分離，取上清干燥，得到鱷魚(yú)骨膠原蛋白肽粉。在所述制備方法的 優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述在溶劑中高壓蒸煮的時(shí)間可以是30±5分鐘，其中所述溶劑可以是 水，優(yōu)選蒸餾水，其中所述鱷魚(yú)骨的重量與所述溶劑的體積的比例可以為1:3,其中所述濃 縮可以是濃縮至溶液的總體積的50%。在所述制備方法的優(yōu)選的實(shí)施方案中，其中所述蛋 白酶可以為木瓜蛋白酶，所述木瓜蛋白酶與所述鱷魚(yú)骨膠的重量比例可以為ο. 8%-1.8%， 優(yōu)選為1.6%。在所述制備方法的優(yōu)選的實(shí)施方案中，其中所述蛋白酶處理的條件可以是在 保持所述蛋白酶活性的pH下、在55°C± 2°C的溫度下水解4小時(shí)± 5分鐘。在所述制備方法的 優(yōu)選的實(shí)施方案中，其中所述離心可以是在室溫以4500rpm離心15±5分鐘。在所述制備方 法的優(yōu)選的實(shí)施方案中，其中所述干燥可以包括冷凍干燥和噴霧干燥，優(yōu)選冷凍干燥。
[0007] 本發(fā)明還涉及由本發(fā)明的制備方法制備的鱷魚(yú)骨膠原蛋白肽粉。
[0008] 本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的鱷魚(yú)骨膠原蛋白肽粉的用于保健品或化妝品的抗氧 化劑、抗DNA損傷劑或美白添加劑。
[0009] 本發(fā)明還涉及本發(fā)明的鱷魚(yú)骨膠原蛋白肽粉作為保健品或化妝品中的抗氧化劑、 抗DNA損傷劑或美白添加劑的用途。
[0010] 鱷魚(yú)骨含有豐富的膠原蛋白，通過(guò)現(xiàn)代生物技術(shù)的酶法適當(dāng)處理后，能夠獲得優(yōu) 質(zhì)的膠原蛋白肽。
[0011] 本申請(qǐng)的實(shí)施方案中，本發(fā)明人所選擇的木瓜蛋白酶為巰基蛋白酶，是一種在酸 性、中性、堿性環(huán)境下均能分解蛋白質(zhì)的蛋白酶，可水解蛋白質(zhì)和多肽中精氨酸和賴氨酸的 羧基端，并能優(yōu)先水解那些在肽鍵的N-端具有兩個(gè)羧基的氨基酸或芳香L-氨基酸的肽鍵。 本申請(qǐng)的實(shí)施例示出，木瓜蛋白酶水解鱷魚(yú)骨膠原蛋白的產(chǎn)物為具有還原性末端的產(chǎn)物， 具有很好的生物學(xué)效應(yīng)。
[0012] 此外，本申請(qǐng)公開(kāi)的鱷魚(yú)骨膠原蛋白肽粉的制備方法，不同于以往處理原材料的 復(fù)雜工序，而是跳過(guò)了從原料中提取膠原蛋白的工藝，直接對(duì)原材料進(jìn)行處理，獲得了功效 良好的優(yōu)質(zhì)膠原蛋白肽，達(dá)到了簡(jiǎn)化制備工藝的目的。
[0013] 本申請(qǐng)制備的鱷魚(yú)骨膠原蛋白肽粉不僅可以提高鱷魚(yú)生產(chǎn)加工的附加值，同時(shí)可 減少環(huán)境污染、避免資源浪費(fèi)，從而取得良好的社會(huì)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本申請(qǐng)實(shí)施例中的實(shí) 驗(yàn)結(jié)果表明，本申請(qǐng)的鱷魚(yú)骨膠原蛋白肽粉在抗氧化、體外抗DNA損傷方面效果顯著;在對(duì) 蘑菇酪氨酸酶活性的實(shí)驗(yàn)中，本申請(qǐng)的鱷魚(yú)骨膠原蛋白肽粉對(duì)酪氨酸酶活性具有顯著的抑 制效果，說(shuō)明其具有很好的美白功效。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1顯示了不同蛋白酶對(duì)鱷魚(yú)骨膠水解的影響。在圖1中，橫坐標(biāo)為不同蛋白酶（中 性蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、復(fù)合蛋白酶和胰蛋白酶），縱坐標(biāo)為羥脯 氨酸含量。
[0015] 圖2顯示了不同酶量對(duì)鱷魚(yú)骨膠水解的影響。其中，橫坐標(biāo)為不同酶量（0.8%、 1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%)，縱坐標(biāo)為羥脯氨酸含量。
[0016] 圖3顯示了不同時(shí)間對(duì)鱷魚(yú)骨膠水解的影響。其中，橫坐標(biāo)為不同酶解時(shí)間（lh、 2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h)，縱坐標(biāo)為羥脯氨酸含量。
[0017] 圖4顯示了本申請(qǐng)的鱷魚(yú)骨膠原蛋白肽粉的全波長(zhǎng)掃描結(jié)果。其中，橫坐標(biāo)為波 長(zhǎng)，縱坐標(biāo)為吸光度值。
[0018] 圖5是本申請(qǐng)的鱷魚(yú)骨膠原蛋白肽粉的抗氧化活性檢測(cè)，顯示了本申請(qǐng)的不同濃 度的鱷魚(yú)骨膠原蛋白肽粉對(duì)DPPH和0H的清除率及相對(duì)總還原力的影響。
[0019] 圖6顯示了本申請(qǐng)的鱷魚(yú)骨膠原蛋白肽粉對(duì)小鼠線粒體腫脹的影響。橫坐標(biāo)為不 同的時(shí)間（〇111；[11、5111；[11、10111；[11、15111；[11、20111；[11、25111；[11)，縱坐標(biāo)為吸光度值0052()111]1。
[0020] 圖7是DNA瓊脂糖凝膠電泳圖，顯示了本申請(qǐng)的鱷魚(yú)骨膠原蛋白肽粉在體外對(duì)由羥 自由基引發(fā)的DNA損傷的保護(hù)作用。其中，泳道1:無(wú)損傷對(duì)照組，泳道2:損傷對(duì)照組，泳道3: 0.5mg/mL的鱷魚(yú)骨膠原蛋白肽粉組，泳道4:1.Omg/mL鱷魚(yú)骨膠原蛋白肽粉組。
[0021] 圖8顯示了本申請(qǐng)的鱷魚(yú)骨膠原蛋白肽粉對(duì)蘑菇酪氨酸酶活性的影響。橫坐標(biāo)為 不同濃度的鱷魚(yú)骨膠原蛋白肽粉(0、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4、0.511^/1^)，縱坐標(biāo)為酪 氨酸酶的相對(duì)活性。
[0022]圖9顯示了本申請(qǐng)的鱷魚(yú)骨膠原蛋白肽粉對(duì)小鼠B16黑色素瘤細(xì)胞增殖的影響。橫 坐標(biāo)為不同濃度的鱷魚(yú)骨膠原蛋白肽粉處理組(濃度分別為12.5、25、50、100、200、400、800 yg/mL)，縱坐標(biāo)為細(xì)胞相對(duì)增殖率。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面將以實(shí)施例的方式對(duì)本申請(qǐng)作進(jìn)一步的詳細(xì)描述，以使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠 實(shí)踐本申請(qǐng)。應(yīng)當(dāng)理解，可以采用其他實(shí)施方式，并且可以做出適當(dāng)?shù)母淖兌黄x本申請(qǐng) 的精神或范圍。為了避免對(duì)于使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)嵺`本申請(qǐng)來(lái)說(shuō)不必要的細(xì)節(jié)，說(shuō)明 書(shū)可能省略了對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)已知的某些信息。因此，以下詳細(xì)描述不應(yīng)以限制 性的意義來(lái)理解，且本發(fā)明的范圍僅由所附權(quán)利要求界定。
[0024]以下的實(shí)施例便于更好地理解本申請(qǐng)，但并不用來(lái)限制本申請(qǐng)的范圍。
[0025]下述實(shí)施例中所使用的各原料，除特別指出的以外，均可由市售獲得。
[0026]實(shí)施例1
[0027] 不同蛋白酶對(duì)鱷魚(yú)骨膠水解的影響
[0028]取新鮮鱷魚(yú)骨，去掉多余的肉、脂肪，清洗，剁成小塊后，加入適量蒸餾水，鱷魚(yú)骨 的重量與加入水的體積比例為1:3，在高壓鍋(GI54，Zealway，美國(guó)）內(nèi)煮(壓力約0.4MPa) 30 分鐘后，冷卻，濃縮至溶液的總體積的50 %，得鱷魚(yú)骨膠。取6份等量鱷魚(yú)骨膠，分別放入6個(gè) 燒杯中，在各燒杯中分別加入基于骨膠重量的1%的中性蛋白酶(枯草芽孢桿菌來(lái)源的中性 蛋白酶，棗莊市杰諾生物酶有限公司）、酸性蛋白酶(黑曲霉來(lái)源的酸性蛋白酶，棗莊市杰諾 生物酶有限公司）、堿性蛋白酶(地衣芽孢桿菌來(lái)源的堿性蛋白酶，棗莊市杰諾生物酶有限 公司）、木瓜蛋白酶(上海生工）、復(fù)合蛋白酶(CN復(fù)合蛋白酶，無(wú)錫杰仁生物科技