用于檢測大腸桿菌o157:h7的顯色培養(yǎng)基的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公布了一種用于檢測大腸桿菌O157:H7的顯色培養(yǎng)基，培養(yǎng)基含有瓊脂、蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉，還含有山梨醇、肌醇、中性紅、β-半乳糖苷酶顯色底物Ⅰ5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖、β-半乳糖苷酶顯色底物Ⅱ鄰硝基苯-β-D-半乳糖苷、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷、牛膽鹽、亞碲酸鉀、頭孢克肟。本發(fā)明的顯色培養(yǎng)基用于檢測大腸桿菌O157:H7，檢測靈敏度高，特異性好，直接根據菌落顏色就可對菌株作出鑒別，目標菌落大腸桿菌O157:H7顏色不同于現(xiàn)有技術，為科研人員提供了更多選擇。
【專利說明】用于檢測大腸桿菌0157 :H7的顯色培養(yǎng)基

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種微生物檢測的培養(yǎng)基，尤其涉及一種用于檢測大腸桿菌0157:H7 的顯色培養(yǎng)基。

【背景技術】
[0002] 出血性大腸桿菌（enterohemorrhage E. Coli，EHEC)是大腸桿菌的一個亞型,EHEC 分為157、26、111血清型，主要致病菌株為0157:H7,可引起感染性腹瀉，因能引起人類的出 血性腸炎而得名。
[0003] 腸出血性大腸桿菌大腸桿菌0157:H7除不發(fā)酵或遲緩發(fā)酵山梨醇以及編碼的 β-葡萄糖醛酸苷酶無活性外，其它常見的特征與大腸埃希氏菌基本相似。傳統(tǒng)遲緩發(fā)酵山 梨醇-麥康凱（SMAC)培養(yǎng)基可作為對0157:Η7篩選的培養(yǎng)基。在SMAC培養(yǎng)基上，0157:Η7 菌落無色，而發(fā)酵菌株呈粉紅色，在梅里埃的顯色培養(yǎng)基上，0157:Η7菌落呈藍綠色，在科瑪 嘉的顯色培養(yǎng)基上，〇157:Η7菌落呈品紅色，在國內廠家生產的顯色培養(yǎng)基上，0157:Η7菌 落呈紫紅色。專利CN201110375648公布了一種能將阪崎腸桿菌和不發(fā)酵山梨醇但β-葡萄 糖醛酸苷酶陽性與區(qū)分的顯色培養(yǎng)基。相比PCR法、金標試紙法、乳膠凝集法、酶聯(lián)免疫吸 附法、DNA探針技術等快速檢測方法，以顯色培養(yǎng)基為基礎的特異性顯色生化鑒定技術能剛 好地與傳統(tǒng)方法接軌，同時能將檢測、計數(shù)和初步鑒別一次完成，大幅度提高檢的速度和準 確性，檢測成本較低，因此應用前景廣闊。在通過多種顯色培養(yǎng)基同時篩選菌種時，存在因 顯色相同或相近而導致實驗誤差，需要開發(fā)不同顯色方案的顯色培養(yǎng)基以滿足科研需求。


【發(fā)明內容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測大腸桿菌0157 :Η7的顯色培養(yǎng)基。
[0005] 本發(fā)明的所采用的技術方案為：
[0006] -種用于檢測大腸桿菌0157 :Η7的顯色培養(yǎng)基，每IOOOmL培養(yǎng)基含有：瓊脂 15-20g、蛋白胨5-15g、酵母提取物4-6g、氯化鈉5-10g，還含有山梨醇10-20g、肌醇4-7g、 中性紅0.005-0. 03g、β-半乳糖苷酶顯色底物I 0.05-0. 2g、β-半乳糖苷酶顯色底物 II l-3g、異丙基-β-D-硫代批喃半乳糖苷0. 05-0. 2g、牛膽鹽l-5g、亞締酸鉀l-5mg、頭孢 克月虧 0· Ol-O. 06mg。
[0007] 優(yōu)選的，β -半乳糖苷酶顯色底物I為5-溴-4-氯-3-吲哚-β -半乳糖。
[0008] 優(yōu)選的，5-溴-4-氯-3-吲哚-β -半乳糖在IOOOmL培養(yǎng)基中的含量為0· lg。
[0009] 優(yōu)選的，β -半乳糖苷酶顯色底物II為鄰硝基苯-β -D-半乳糖苷。
[0010] 優(yōu)選的，鄰硝基苯-β -D-半乳糖苷在IOOOmL培養(yǎng)基中的含量為2g。
[0011] 優(yōu)選的，山梨醇在IOOOmL培養(yǎng)基中的含量為15g，肌醇在IOOOmL培養(yǎng)基中的含量 為5g，中性紅在IOOOmL培養(yǎng)基中的含量為0. Olg。
[0012] 優(yōu)選的，每IOOOmL培養(yǎng)基含有瓊脂15g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉5g， 山梨醇15g、肌醇5g、中性紅0. Olg、β -半乳糖苷酶顯色底物I 0. lg、β -半乳糖苷酶顯色 底物II 2g、異丙基-β -D-硫代批喃半乳糖苷0. lg、牛膽鹽I. 5g、亞締酸鉀2mg、頭孢克月虧 0. 04mg〇
[0013] 本發(fā)明在培養(yǎng)基中添加了山梨醇和中性紅，除大腸桿菌0157 :H7外的大腸菌群發(fā) 酵山梨醇產酸，在pH指示劑中性紅作用下顯示出紅色色澤，而大腸桿菌0157 :H7不利用山 梨醇而呈現(xiàn)無色菌落。
[0014] 本發(fā)明在培養(yǎng)基中添加了 β -半乳糖苷酶顯色底物I和β -半乳糖苷酶顯色底物 II，大腸菌群在β -半乳糖苷酶作用下分解底物，游離出顯色劑，使菌落呈現(xiàn)出顯色劑的色 澤。
[0015] 膽鹽可抑制樣品中大部分的革蘭氏陽性球菌，包括牛膽鹽、豬膽鹽、三號膽鹽、去 氧膽酸鈉和混合膽鹽。本發(fā)明在培養(yǎng)基中添加了膽鹽。
[0016] 本發(fā)明在培養(yǎng)基中添加了，可抑制樣品中部分的革蘭氏陰性桿菌如大腸菌群以及 容易擴散生長的變型桿菌的抗生素亞碲酸鉀和頭孢克肟。
[0017] 本發(fā)明的有益效果是：
[0018] 本發(fā)明的顯色培養(yǎng)基為大腸桿菌0157 :Η7的檢測提供了一種新的顯色方案，為科 研工作者在進行多種顯色培養(yǎng)基同時篩選菌種時提供更多選色方案，避免因目標菌落顯色 相同或相近導致的非系統(tǒng)誤差。
[0019] 本發(fā)明的顯色培養(yǎng)基能快速、準確、簡便地從大腸菌群中鑒別出大腸桿菌0157 : Η7。

【具體實施方式】
[0020] -種用于檢測大腸桿菌0157 :Η7的顯色培養(yǎng)基，每IOOOmL培養(yǎng)基含有：瓊脂 15-20g、蛋白胨5-15g、酵母提取物4-6g、氯化鈉5-10g，其特征在于，還含有山梨醇10-20g、 肌醇4-7g、中性紅0. 005-0. 03g、β -半乳糖苷酶顯色底物I 0. 05-0. 2g、β -半乳糖苷酶 顯色底物II l_3g、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷0. 05-0. 2g、牛膽鹽l-5g、亞碲酸鉀 l-5mg、頭孢克肟(λ 01-0. 06mg。
[0021] 優(yōu)選的，β -半乳糖苷酶顯色底物I為5-溴-4-氯-3-吲哚-β -半乳糖。
[0022] 優(yōu)選的，5-溴-4-氯-3-吲哚-β -半乳糖在IOOOmL培養(yǎng)基中的含量為0. lg。
[0023] 優(yōu)選的，β -半乳糖苷酶顯色底物II為鄰硝基苯-β -D-半乳糖苷。
[0024] 優(yōu)選的，鄰硝基苯-β -D-半乳糖苷在IOOOmL培養(yǎng)基中的含量為2g。
[0025] 優(yōu)選的，一種用于檢測大腸桿菌0157 :H7的顯色培養(yǎng)基，每IOOOmL培養(yǎng)基含有瓊 脂15g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉5g，山梨醇15g、肌醇5g、中性紅0. Olg、β -半乳 糖苷酶顯色底物I 5-溴-4-氯-3-吲哚-β -半乳糖0. lg、β -半乳糖苷酶顯色底物II鄰 硝基苯-β -D-半乳糖苷2g、異丙基-β -D-硫代批喃半乳糖苷0. lg、牛膽鹽I. 5g、亞締酸鉀 2mg、頭孢克廂0. 04mg。
[0026] 本發(fā)明的顯色培養(yǎng)基用于檢測大腸桿菌0157 :H7的方法，包括如下步驟：
[0027] (1)制備顯色平板：每IOOOmL去離子水中加入上述顯色培養(yǎng)基除β -半乳糖苷酶 顯色底物II鄰硝基苯-β -D-半乳糖苷、亞碲酸鉀、頭孢克肟外的原料，攪拌，加熱煮沸至完 全溶解，待冷至約50°C，加入過濾除菌的鄰硝基苯-β-D-半乳糖苷、亞碲酸鉀、頭孢克肟， 混勻，倒平板，備用；
[0028] (2)接種培養(yǎng)：將樣品或含樣品的增菌液接種到顯色平板上，37°C培養(yǎng)22?26h ;
[0029] (3)結果分析：若顯色平板上出現(xiàn)光滑、略突起、直徑1?3mm、邊緣整齊的外黃心 綠或黃綠色的菌落，說明該樣品存在大腸桿菌0157 :H7,其它腸道菌或被抑制或為顯示紅 色。
[0030] 下面結合具體的實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限如此。
[0031] 5-溴-4-氯-3-吲哚-β -半乳糖苷購買自Sigma公司。
[0032] 實施例1
[0033] -種用于檢測大腸桿菌0157 :Η7的顯色培養(yǎng)基，每IOOOmL培養(yǎng)基含有瓊脂15g、 蛋白胨l〇g、酵母提取物5g、氯化鈉5g，山梨醇15g、肌醇5g、中性紅0. Olg、β -半乳糖苷酶 顯色底物I 5-溴-4-氯-3-吲哚-β -半乳糖0. 15g、β -半乳糖苷酶顯色底物II鄰硝基 苯-β -D-半乳糖苷lg、異丙基-β -D-硫代批喃半乳糖苷0. lg、牛膽鹽I. 5g、亞締酸鉀2mg、 頭孢克肟〇. 〇4mg。
[0034] 實施例2
[0035] -種用于檢測大腸桿菌0157 :H7的顯色培養(yǎng)基，每IOOOmL培養(yǎng)基含有瓊脂15g、 蛋白胨l〇g、酵母提取物5g、氯化鈉5g，山梨醇15g、肌醇5g、中性紅0. Olg、β -半乳糖苷 酶顯色底物I 5-溴-4-氯-3-吲哚-β -半乳糖0. 2g、β -半乳糖苷酶顯色底物II鄰硝基 苯-β -D-半乳糖苷lg、異丙基-β -D-硫代批喃半乳糖苷0. lg、牛膽鹽I. 5g、亞締酸鉀2mg、 頭孢克肟〇. 〇4mg。
[0036] 實施例3
[0037] -種用于檢測大腸桿菌0157 :H7的顯色培養(yǎng)基，每IOOOmL培養(yǎng)基含有瓊脂15g、 蛋白胨l〇g、酵母提取物5g、氯化鈉5g，山梨醇15g、肌醇5g、中性紅0. Olg、β -半乳糖苷酶 顯色底物I 5-溴-4-氯-3-吲哚-β -半乳糖0. 05g、β -半乳糖苷酶顯色底物II鄰硝基 苯-β -D-半乳糖苷3g、異丙基-β -D-硫代批喃半乳糖苷0. lg、牛膽鹽I. 5g、亞締酸鉀2mg、 頭孢克肟〇. 〇4mg。
[0038] 實施例4
[0039] -種用于檢測大腸桿菌0157 :H7的顯色培養(yǎng)基，每IOOOmL培養(yǎng)基含有瓊脂15g、 蛋白胨l〇g、酵母提取物5g、氯化鈉5g，山梨醇15g、肌醇5g、中性紅0. 01g、β -半乳糖苷酶 顯色底物I 5-溴-4-氯-3-吲哚-β -半乳糖0. 05g、β -半乳糖苷酶顯色底物II鄰硝基 苯-β -D-半乳糖苷2. 5g、異丙基-β -D-硫代批喃半乳糖苷0. lg、牛膽鹽I. 5g、亞締酸鉀 2mg、頭孢克廂0. 04mg。
[0040] 實施例5
[0041] -種用于檢測大腸桿菌0157 :H7的顯色培養(yǎng)基，每IOOOmL培養(yǎng)基含有瓊脂15g、 蛋白胨l〇g、酵母提取物5g、氯化鈉5g，山梨醇15g、肌醇5g、中性紅0. 01g、β -半乳糖苷 酶顯色底物I 5-溴-4-氯-3-吲哚-β -半乳糖0. lg、β -半乳糖苷酶顯色底物II鄰硝基 苯-β -D-半乳糖苷2g、異丙基-β -D-硫代批喃半乳糖苷0. lg、牛膽鹽I. 5g、亞締酸鉀2mg、 頭孢克肟〇. 〇4mg。
[0042] 實施例6
[0043] 將 E. coli 0157:H7NCTC12900、E. coli 0157:H7882364、E. coli 0157:H7ATCC43895、E. coli 0157:H7ATCC43888、E. coli ATCC35218、E. coli ATCC8739、 E.coli CMCC(B)44102、E.coli CMCC(B)44103、E.coli 8099、E.coli ATCC25922、 E. sakazakii ATCC51329、C. freundii ATCC8090、E. aerogenes CMCC(B)45103、S. arizona CMCC(B)47001、P. vulgaris CMCC(B)49027等15種標準菌株分別制成適當濃度的標準菌懸 液（濃度為108?109cfu/mL)，分別劃線接種到用實施例5顯色培養(yǎng)基制成的平板上，37°C 培養(yǎng)18?24h。特異性實驗結果見表1。
[0044] 由實驗結果可知，4株E. coil 0157:H7均顯示黃綠色，為陽性菌株。對于非目標 菌，菌落顏色可與目標菌E. coil 0157:H7相區(qū)分；雜菌受抑制。以上實驗結果本發(fā)明的用 于檢測大腸桿菌E. coil 0157 :H7的顯色培養(yǎng)基具有較高的特異性。
[0045] 表1大腸桿菌E. coli 0157: H7顯色培養(yǎng)基的特異性顯色試驗結果

【權利要求】
1. 一種用于檢測大腸桿菌0157 :H7的顯色培養(yǎng)基，每lOOOmL培養(yǎng)基含有瓊脂15-20g、 蛋白胨5-15g、酵母提取物4-6g、氯化鈉5-10g，其特征在于，還含有山梨醇10-20g、肌醇 4_7g、中性紅0. 005-0. 03g、0 -半乳糖苷酶顯色底物I 0. 05-0. 2g、0 -半乳糖苷酶顯色底 物II l_3g、異丙基-D-硫代批喃半乳糖苷0. 05-0. 2g、牛膽鹽l-5g、亞締酸鉀l-5mg、頭 孢克肟 〇? 01-0. 〇6mg。
2. 根據權利要求1所述的用于檢測大腸桿菌0157 :H7的顯色培養(yǎng)基，其特征在于， 3 -半乳糖苷酶顯色底物I為5-溴-4-氯-3-吲哚-0 -半乳糖。
3. 根據權利要求2所述的用于檢測大腸桿菌0157 :H7的顯色培養(yǎng)基，其特征在于， 5_溴-4-氯-3-吲哚-P -半乳糖在lOOOmL培養(yǎng)基中的含量為0. lg。
4. 根據權利要求1所述的用于檢測大腸桿菌0157 :H7的顯色培養(yǎng)基，其特征在于， 3 -半乳糖苷酶顯色底物II為鄰硝基苯-0 -D-半乳糖苷。
5. 根據權利要求4所述的用于檢測大腸桿菌0157 :H7的顯色培養(yǎng)基，其特征在于，鄰 硝基苯-D-半乳糖苷在1000mL培養(yǎng)基中的含量為2g。
6. 根據權利要求1-5任意一項所述的用于檢測大腸桿菌0157 :H7的顯色培養(yǎng)基，其特 征在于，山梨醇在l〇〇〇mL培養(yǎng)基中的含量為15g，肌醇在1000mL培養(yǎng)基中的含量為5g，中 性紅在1000mL培養(yǎng)基中的含量為0. 01g。
7. 根據權利要求6所述的用于檢測大腸桿菌0157 :H7的顯色培養(yǎng)基，其特征在于， 每1000mL培養(yǎng)基含有瓊脂15g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉5g，山梨醇15g、肌醇 5g、中性紅O.Olg、￠-半乳糖苷酶顯色底物I 0. lg、￠-半乳糖苷酶顯色底物Il2g、異丙 基-0 -D-硫代批喃半乳糖苷0. lg、牛膽鹽1. 5g、亞締酸鉀2mg、頭孢克月虧0. 04mg。
8. 根據權利要求6所述的用于檢測大腸桿菌0157 :H7的顯色培養(yǎng)基，其特征在于， 每1000mL培養(yǎng)基含有瓊脂15g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉5g，山梨醇15g、肌醇 5g、中性紅O.Olg、￠-半乳糖苷酶顯色底物I 0. lg、￠-半乳糖苷酶顯色底物Il2g、異丙 基-0 -D-硫代批喃半乳糖苷0. lg、牛膽鹽1. 5g、亞締酸鉀2mg、頭孢克月虧0. 04mg。
【文檔編號】C12Q1/04GK104388521SQ201410681697
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年11月24日 優(yōu)先權日:2014年11月24日
【發(fā)明者】金京勛 申請人:蘇州嘉禧蘿生物科技有限公司