專利名稱：一種篩選淀粉酶產生菌的顯色方法
技術領域：
本發(fā)明涉及ー種微生物顯色方法，尤其是一種篩選淀粉酶產生菌的顯色方法。
背景技術：
淀粉酶已經成為エ業(yè)應用中最為重要的酶之一，并且大量的微生物可以產生高活性的淀粉酶，但是酶的大規(guī)模商業(yè)化生產仍然局限于幾種特定的真菌和細菌，從自然界中篩選新型的高活性目的淀粉酶產生微生物顯得尤為重要。利用淀粉平板透明圈法從自然環(huán)境中分離篩選淀粉酶生產菌，以淀粉指示劑進行初歩判斷，可以快速發(fā)現(xiàn)淀粉酶產生微生物，目前采用的淀粉顯色指示劑是碘液或者固體碘。碘液，組成成分是碘、碘化鉀和蒸餾水。碘液顯色劑需要自己配制并且保存時間短暫；使用時往往采用滴加到培養(yǎng)基上的方式，導致碘液分布不均勻，影響顯色的一致性，從而延長了部分區(qū)域的顯色時間，對菌落殺傷カ增強。 固體碘利用碘升華法顯色，省去了碘液顯色法配制溶液的過程，然而不同產酶菌株，對于升華碘的用量、耐受時間及顯色時間具有差異[唐嘉，陳朝銀，趙聲蘭，夏靜，張濤.一種初篩產胞外淀粉酶菌株的簡化方法.生物加工過程，2008，6 (I): 37-40],并且不同的培養(yǎng)皿的密封程度差異，也會影響熏蒸過程顯色效果。雖然淀粉酶產生菌篩選研究意義重大，但是淀粉酶活性初篩過程中的顯色劑有效期短暫、配制復雜、用量及顯色時間等問題制約了該領域的研究工作廣泛開展。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種采用絡合碘篩選淀粉酶產生菌的顯色方法，初步篩選產酶微生物，能方便、快捷地初步篩選產胞外淀粉酶菌株，可替代碘液顯色法和碘熏蒸法推廣使用。為解決上述技術問題，本發(fā)明所采用的技術方案是一種篩選淀粉酶產生菌的顯色方法，該方法包括以下步驟
1)從自然環(huán)境(土壤和水體)中采集樣本；
2)培養(yǎng)將步驟I)采集的樣本采用稀釋或快速劃線的方法，接種于含有淀粉酶產生菌篩選培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿里，培養(yǎng)3 — 4天；
3)顯色將絡合碘裝入30— 50毫升塑料噴瓶中，揭開培養(yǎng)皿上蓋，將絡合碘快速而均勻地噴霧到長出菌落的淀粉酶產生菌篩選培養(yǎng)基上，靜置2 — 4分鐘，觀察透明圈的形成，顯色時間不能太長(不超過4分鐘)，以免碘揮發(fā)影響觀察；
4)轉接將步驟3)產生透明圈的菌落立即轉接至新的淀粉酶產生菌篩選培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3-4天，重復步驟3)顯色，用透明圈直徑/菌落直徑的比值，計算產酶活性；
5)篩選將產酶活性高的的菌落劃線培養(yǎng)3— 4天，重復步驟3)檢測淀粉酶產生情況，篩選產酶活性高的菌落，得到淀粉酶產生菌。將步驟5)篩選得到的產酶活性高的淀粉酶產生菌，采用4°C試管斜面和-20°C甘油保存。步驟3)中，噴霧到淀粉酶產生菌篩選培養(yǎng)基的絡合碘體積為I 一 2毫升。步驟5)中，透明圈直徑/菌落直徑的比值大于I. 7的菌落，為產酶活性高的菌落。本發(fā)明提供的一種篩選淀粉酶產生菌的顯色方法，由于采用將絡合碘均勻噴霧的方式，初步篩選產酶微生物，具有顯色時間短、試劑保存期長、操作方便方便、顯色效果穩(wěn)定的優(yōu)勢，能方便、快捷地初步篩選產胞外淀粉酶菌株，可替代碘液顯色法和碘熏蒸法推廣使用。
具體實施例方式實施例一
一種篩選淀粉酶產生菌的顯色方法，該方法包括以下步驟
1)采集樣本從三峽大學南苑學生食堂附近采集土壤樣本(5克)，立即將樣本帶回實驗室;
2)培養(yǎng)
培養(yǎng)基組成(w/v):2% 可溶性淀粉，0.5% 蛋白胨，0.5% NaCl,0. 05% MgSO4 *7H20,0. 05%KH2PO4,1. 5% 瓊脂，pH 7. 0-7. 2 ；
將步驟I)采集的樣本混合均勻后，取約0. 5克快速劃線接種于淀粉酶產生菌篩選培養(yǎng)基上，于28°C培養(yǎng)4天；
3)顯色將1-2毫升絡合碘快速而均勻地噴霧于培養(yǎng)基上，靜置2分鐘后可見明顯的淀粉水解透明圈；
4)轉接將產生透明圈的菌落轉接到新的篩選培養(yǎng)基上，培養(yǎng)4天，重復步驟3)檢測淀粉酶產生情況，用透明圈直徑/菌落直徑的比值評價產酶活性；
5)篩選將透明圈直徑/菌落直徑的比值大于I.7的菌落再次劃線培養(yǎng)4天，重復步驟3)檢測淀粉酶產生情況，獲得透明圈直徑/菌落直徑的比值達2. 2的產淀粉酶的細菌。實施例ニ
一種篩選淀粉酶產生菌的顯色方法，該方法包括以下步驟
1)采集樣本從三峽大學欣苑學生食堂附近采集土壤樣本(4克)，立即將樣本帶回實驗室;
2)培養(yǎng)
培養(yǎng)基組成(w/v) 1. 5% 可溶性淀粉，0. 5% 蛋白胨，0. 5% NaCl,0. 05% MgSO4 IW2Q,
0.05% KH2PO4,1. 5% 瓊脂，pH 7. 0-7. 2 ；
將步驟I)采集的樣本梯度稀釋后，涂布于淀粉酶產生菌篩選培養(yǎng)基上，于38°C培養(yǎng)3
天;
3)顯色將1-2毫升絡合碘快速而均勻地噴霧于培養(yǎng)基上，靜置3分鐘后可見明顯的淀粉水解透明圈；
4)轉接將產生透明圈的菌落轉接到新的篩選培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3天，重復步驟3)檢測淀粉酶產生情況，用透明圈直徑/菌落直徑的比值評價產酶活性；
5)篩選將透明圈直徑/菌落直徑的比值大于I.7的菌落再次劃線培養(yǎng)3天，重復步驟3)檢測淀粉酶產生情況，獲得透明圈直徑/菌落直徑的比值達1.9的產淀粉酶的細菌。
實施例三
一種篩選淀粉酶產生菌的顯色方法，該方法包括以下步驟
1)采集樣本從三峽大學東苑學生食堂附近采集水樣(5毫升)，立即將樣本帶回實驗
室；
2)培養(yǎng)
培養(yǎng)基組成(w/v):可溶性淀粉 2. 5%，蛋白胨 0. 5%，NaCl 0. 5%，MgSO4 7H20 0. 05%,KH2PO4 0. 05%,瓊脂 I. 5%, pH 6. 0-7. 0 ；
將步驟I)采集的樣本劃線接種于淀粉酶產生菌篩選培養(yǎng)基上，于30°C培養(yǎng)4天；
3)顯色將1-2毫升絡合碘快速而均勻地噴霧于培養(yǎng)基上，靜置4分鐘后可見明顯的 淀粉水解透明圈；
4)轉接將產生透明圈的菌落轉接到新的篩選培養(yǎng)基上，培養(yǎng)4天，重復步驟3)檢測淀粉酶產生情況，用透明圈直徑/菌落直徑的比值評價產酶活性；
5)篩選將透明圈直徑/菌落直徑的比值大于I.7的菌落再次劃線培養(yǎng)4天，重復步驟3)檢測淀粉酶產生情況，獲得透明圈直徑/菌落直徑的比值達2. 3的產淀粉酶的細菌。
權利要求
1.一種篩選淀粉酶產生菌的顯色方法，其特征在于該方法包括以下步驟 1)從自然環(huán)境中采集樣本； 2)培養(yǎng)將步驟I)采集的樣本接種于含有淀粉酶產生菌篩選培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿里，培養(yǎng)3 — 4 天； 3)顯色揭開培養(yǎng)皿上蓋，將絡合碘快速而均勻地噴霧到長出菌落的淀粉酶產生菌篩選培養(yǎng)基上，靜置2 — 4分鐘，觀察透明圈的形成； 4)轉接將步驟3)產生透明圈的菌落立即轉接至新的淀粉酶產生菌篩選培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3-4天，重復步驟3)，用透明圈直徑/菌落直徑的比值，計算產酶活性； 5)篩選將產酶活性高的的菌落劃線培養(yǎng)3— 4天，重復步驟3)檢測淀粉酶產生情況，篩選產酶活性高的菌落，得到淀粉酶產生菌。
2.根據權利要求I所述的ー種篩選淀粉酶產生菌的顯色方法，其特征在于步驟I)中，從自然環(huán)境的土壌和水體中采集樣品。
3.根據權利要求I所述的ー種篩選淀粉酶產生菌的顯色方法，其特征在于步驟3)中，噴霧到淀粉酶產生菌篩選培養(yǎng)基的絡合碘體積為I 一 2毫升。
4.根據權利要求I所述的ー種篩選淀粉酶產生菌的顯色方法，其特征在于步驟5)中，透明圈直徑/菌落直徑的比值大于I. 7的菌落，為產酶活性高的菌落。
全文摘要
一種篩選淀粉酶產生菌的顯色方法，該方法包括以下步驟1)從自然環(huán)境中采集樣本；2)培養(yǎng)樣本接種于含有淀粉酶產生菌篩選培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿里，培養(yǎng)3－4天；3)顯色揭開培養(yǎng)皿上蓋，將絡合碘快速而均勻地噴霧到長出菌落的淀粉酶產生菌篩選培養(yǎng)基上，靜置2－4分鐘，觀察透明圈的形成；4)轉接將步驟3)產生透明圈的菌落立即轉接至新的淀粉酶產生菌篩選培養(yǎng)基上；5)篩選篩選產酶活性高的菌落，得到淀粉酶產生菌。本發(fā)明提供的一種篩選淀粉酶產生菌的顯色方法，采用絡合碘噴霧的方式初步篩選產酶微生物，能方便、快捷地初步篩選產胞外淀粉酶菌株,替代碘液顯色法和碘熏蒸法推廣使用。
文檔編號C12N1/00GK102827770SQ20121029624
公開日2012年12月19日 申請日期2012年8月20日 優(yōu)先權日2012年8月20日
發(fā)明者陳芳清, 陳國華, 江玲 申請人:三峽大學