專利名稱：一種快速篩選微生物絮凝劑產(chǎn)生菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物絮凝劑產(chǎn)生菌的篩選，尤其適用于快速、高效微生物培養(yǎng)產(chǎn)生微生物絮凝劑的方法。
背景技術(shù)：
隨著水污染問題日益嚴(yán)重，水處理問題也變得越來越嚴(yán)峻，水處理的方法有吸附、化學(xué)氧化、電滲析、生化、離子交換等多種方法，其中絮凝法是一種較為有效且成本較低的預(yù)處理方法，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于污水處理、食品生產(chǎn)和工業(yè)發(fā)酵等諸多領(lǐng)域。絮凝劑分兩大類:一是以鋁鹽、鐵鹽及其共聚物為主的無機(jī)絮凝劑；二是以聚丙烯酰胺為主的合成高分子絮凝劑，該傳統(tǒng)的絮凝劑具有一定的腐蝕性和毒性，容易形成二次污染，對人體健康有很大的危害，并且絮凝效果受水質(zhì)水溫條件影響較大。生物絮凝劑可稱為第三代絮凝劑，是一種具有高效絮凝活性的微生物代謝產(chǎn)物或化學(xué)改性天然有機(jī)高分子絮凝劑，它是利用生物技術(shù)，通過微生物的發(fā)酵培養(yǎng)，從微生物代謝產(chǎn)物中提取、純化而獲得的新型水處理劑，其主要成分有蛋白質(zhì)、多糖、脂類、纖維素、DNA及有絮凝活性的菌體。生物絮凝劑不僅使用范圍廣、用量少、成本較低，能自行降解，對環(huán)境不產(chǎn)生二次污染，而且處理效果高，可使一些難處理的高濃度廢水得到絮凝。文獻(xiàn)檢索披露:①張志強(qiáng)篩選出的一種復(fù)合菌群I (BAFRT4+CYGS1)，在優(yōu)化培養(yǎng)基條件下，對靛藍(lán)印染廢水的COD去除率和脫色率分別達(dá)79.2%和87.6% ;②王曙光從土壤中篩選出的一株產(chǎn)氣桿菌能夠產(chǎn)生絮凝效果較好且性能穩(wěn)定的微生物絮凝劑；③陳月華等從活性污泥中分離得到的菌株的代謝產(chǎn)物能應(yīng)用于處理印染廢水中國的發(fā)明專利CN 101503709A提 供了一種利用地衣芽孢桿菌制備微生物絮凝劑的方法；⑤發(fā)明專利CN1616358A提供了一種以秸桿菌作為絮凝劑菌種，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)生絮凝劑的方法，但這些制備絮凝劑的方法都要經(jīng)過菌株的初篩、復(fù)篩、菌種的分離鑒定、菌株的發(fā)酵培養(yǎng)等常規(guī)步驟，其過程復(fù)雜，步驟繁瑣。盡管微生物絮凝劑的優(yōu)勢使其具有廣闊的遠(yuǎn)景，不少專家學(xué)者也開展了對生物絮凝劑的研究，但目前為止，微生物絮凝劑在實(shí)際中并未得到推廣應(yīng)用，其中繁瑣的培養(yǎng)篩選過程、較長的生長周期使實(shí)際生產(chǎn)的成本過高，是微生物絮凝劑難以推廣的主要原因。優(yōu)良的生產(chǎn)菌種通常是從不同環(huán)境樣品中分離、純化，再經(jīng)過絮凝實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步篩選后得到，這個(gè)過程工作量大，周期長，篩選目標(biāo)不確定，所以篩選效率低。本發(fā)明利用微生物間的相互代謝作用，通過微生物群落的富集和發(fā)酵培養(yǎng)，得到具有明顯絮凝效果的微生物群落，再針對該群落分離得到高效絮凝菌株，并通過優(yōu)化培養(yǎng)基成分，提高絮凝劑產(chǎn)量，所篩選微生物絮凝劑產(chǎn)生菌的周期短，效率高，針對性強(qiáng)，克服傳統(tǒng)微生物篩選復(fù)雜，步驟繁瑣的缺點(diǎn)，可降低生產(chǎn)成本，易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于:提供的快速篩選方法克服傳統(tǒng)微生物絮凝劑產(chǎn)生菌篩選方法復(fù)雜、周期長、效率低的不足，實(shí)現(xiàn)對樣品的快速、高效篩選。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的:一種快速篩選微生物絮凝劑產(chǎn)生菌的方法，按步驟實(shí)施:步驟I微生物的富集培養(yǎng):取活性污泥水于燒杯中，靜置沉淀lOmin，取上清液10ml，加入裝有IOOml滅菌的LB液體培養(yǎng)基或PDA液體培養(yǎng)基或高氏一號液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，在28_37°C，200rpm搖床中培養(yǎng)，富集菌液濃度為1.0CFU/ml ；其中PDA液體培養(yǎng)基:取新鮮土豆去皮，切成約2cm2的小塊，放入1500ml的燒杯中煮沸30min，然后用4層紗布過濾，取其濾液加葡萄糖20g，在用蒸餾水補(bǔ)足至1000ml，121°C滅菌25min,得成品；其中高氏一號液體培養(yǎng)基:取可溶性淀粉20g、KN03 lg、NaCl 0.5g、K 2HP04 3H200.5g、MgSO4 7H20 0.5g、FeSO4 7H20 0.0lg，放入 1000ml 蒸餾水中，用 NaOH 調(diào)節(jié) pH 7.6，溫度121 °C以下，滅菌25min，得到；其中LB液體培養(yǎng)基:取蛋白胨10g、酵母浸粉5g、NaCl 5g，放入1000ml蒸餾水中，用NaOH調(diào)節(jié)pH 7.0，121°C下滅菌25min，得成品；步驟2優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)液的制備:將可溶性淀粉 28-32g、K2HP04 4_6g、KH2P04 1.5-2.5g、酵母膏 3_5g、KN030.8-1.2g、NaCl 0.4-0.6g、MgSO4 7H20 0.4-0.6g、FeSO4 0.008-0.013g 依次放入 950_1050ml 蒸餾水的容器中，用NaOH調(diào)節(jié)pH為7.5-8.5、溫度110_115°C下滅菌25_30min，得成品；步驟3微生物的發(fā)酵培養(yǎng):將步驟I富集培養(yǎng)液按1-2:100的接種量接入步驟2優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)液中培養(yǎng)，溫度25-30°C、時(shí)間30-40h、搖床轉(zhuǎn)速100-200rpm;培養(yǎng)液離心后取上清2ml，加入IOOml廢水，測定絮凝率；其絮凝劑主要成分是多糖，是菌種生長過程中的代謝分泌物；步驟4菌種的分離純化:選高絮凝效果的發(fā)酵液用無菌水稀釋，制成不同梯度的稀釋菌液，取0.1ml各梯度的稀釋菌液涂布在LB固體培養(yǎng)基、PDA固體培養(yǎng)基和高氏一號固體培養(yǎng)基上，在28-37°C靜置培養(yǎng)，待長出單菌落后，挑取單菌落再經(jīng)28-37°C、200rpm搖床培養(yǎng)，濃度達(dá)到1.0CFU/ml后按1.5:100的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)液，25-30°C，150rpm搖床培養(yǎng)30-40h測定其絮凝率，結(jié)果得產(chǎn)生絮凝劑的菌株，絮凝率達(dá)80-90% ；步驟5絮凝率的測定方法:稱取4g高嶺土溶于IOOOml蒸餾水中配置成4g/L的高嶺土懸浮液，稱取IgCaC I溶于IOOml蒸餾水中配置成1%的溶液；取IOOml高嶺土懸浮液于250ml燒杯中，用NaOH調(diào)節(jié)pH7.0，加入2ml I %的CaCl溶液和2ml的發(fā)酵培養(yǎng)液，先快速攪拌2min再緩慢攪拌3min，靜置IOmin后取上清液，用分光光度計(jì)在550nm處測定其吸光度，以加入發(fā)酵培養(yǎng)基的高嶺土懸浮液做對照試驗(yàn)，絮凝率計(jì)算公式:絮凝率=(A-B) /AX 100% ;其中A為對照上清液在550nm處的吸光度；B為加入發(fā)酵液的樣品上清液在550nm處的吸光度。本發(fā)明的機(jī)理與作用:微生物產(chǎn)生的絮凝劑主要成分為糖蛋白、多糖、蛋白質(zhì)、纖維素和DNA等，是一種在微生物培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，可以由一種或多種微生物培養(yǎng)得到，其產(chǎn)量和絮凝效果不但受絮凝劑產(chǎn)生菌培養(yǎng)條件的影響，還與絮凝劑分離提純的方法有關(guān)，本發(fā)明利用微生物間的相互代謝作用，通過微生物群落的富集和發(fā)酵培養(yǎng)，得到具有明顯絮凝效果的微生物群落，再針對該群落分離得到高效絮凝菌株，并通過優(yōu)化培養(yǎng)基成分，初始PH值、溫度、培養(yǎng)時(shí)間和轉(zhuǎn)速給出絮凝劑產(chǎn)生菌的最佳培養(yǎng)條件和提純方法，縮短培養(yǎng)周期，提高絮凝劑產(chǎn)量。本發(fā)明的有益效果:對微生物培養(yǎng)的溫度、時(shí)間、轉(zhuǎn)速及發(fā)酵培養(yǎng)基成分進(jìn)行了優(yōu)化，得到的菌株絮凝效果更好，絮凝率達(dá)80%以上；微生物產(chǎn)生的絮凝劑成分經(jīng)鑒定為多糖，無毒，在自然條件下可自行降解；該方法操作簡單、快速，可實(shí)現(xiàn)大量樣品的篩選，應(yīng)用范圍廣，彰顯技術(shù)進(jìn)步。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明實(shí)施例1絮凝活性細(xì)菌的篩選:取污水處理廠活性污泥，經(jīng)沉淀后取上清IOml加入裝有100ml LB液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，37°C，200rpm搖床培養(yǎng)48h至菌液濃度為1.0CFU/ml，按照1.5:100的接種量接入優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)液中，30°C，150rpm搖床培養(yǎng)30h，培養(yǎng)液離心后取上清2ml，加入IOOml石化廢水中，測定絮凝率；經(jīng)鑒定，絮凝劑成分主要是多糖，是菌種生長過程中的代謝分泌物。測得的具有高絮凝效果的發(fā)酵液用無菌水稀釋，制成不同梯度的稀釋菌液，取
0.1ml各梯度的稀釋液涂布到LB固體培養(yǎng)基上，37°C靜置培養(yǎng)24h后挑取單菌落進(jìn)行劃線分離直至菌落形態(tài)一致，單菌落再經(jīng)過37°C，200rpm搖床培養(yǎng)48h，濃度達(dá)到1.0CFU/ml后按1.5:100的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)液，30°C，150rpm搖床培養(yǎng)30h測定其絮凝率，結(jié)果得到2株產(chǎn)生絮凝劑的菌株，絮凝率達(dá)81.2%。所用LB液體培養(yǎng)基由蛋白胨10g，酵母浸粉5g，NaCl 5g放入1000ml蒸餾水中，用NaOH調(diào)節(jié)pH 7.0，121°C下滅菌25min得到，所用優(yōu)化發(fā)酵液培養(yǎng)基由可溶性淀粉30g, K2HPO4 5g, KH2PO4 2g,酵母膏 4g, KNO3 lg, NaCl 0.5g, MgSO4 7H20 0.5g, FeSO40.0lg放入1000ml蒸餾水中，用NaOH調(diào)節(jié)pH 7.5，溫度115°C下滅菌30min得到。絮凝率的測定方法:稱取4g高嶺土溶于IOOOml蒸餾水中配置成4g/L的高嶺土懸浮液，稱取Ig CaCl溶于IOOml蒸餾水中配置成1%的溶液；取IOOml高嶺土懸浮液于250ml燒杯中，用NaOH調(diào)節(jié)pH7.0，加入2ml 1%的CaCl溶液和2ml的發(fā)酵培養(yǎng)液，先快速攪拌2min再緩慢攪拌3min，靜置IOmin后取上清液，用分光光度計(jì)在550nm處測定其吸光度，以加入發(fā)酵培養(yǎng)基的高嶺土懸浮液做對照試驗(yàn)，絮凝率計(jì)算公式:絮凝率=(A-B)/AX 100%A為對照上清液在550nm處的吸光度B為加入發(fā)酵液的樣品上清液在550nm處的吸光度實(shí)施例2
絮凝活性酵母菌的篩選:取新鮮土豆去皮，切成約2cm2的小塊，放入1500ml的燒杯中煮沸30min,然后用4層紗布過濾,取其濾液加葡萄糖20g,在用蒸懼水補(bǔ)足至1000ml,自然pH，121°C滅菌25min得到PDA液體培養(yǎng)基。取污水處理廠活性污泥，經(jīng)沉淀后取上清IOml加入裝有100ml PDA液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，28°C，200rpm搖床培養(yǎng)72h至菌液濃度為1.0CFU/ml，按照1.5:100的接種量接入優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)液中，26°C，150rpm搖床培養(yǎng)35h，培養(yǎng)液離心后取上清2ml，加入IOOml烏石化廢水中，測定絮凝率，經(jīng)鑒定，絮凝劑成分主要是多糖，是菌種生長過程中的代謝分泌物。測得的具有高絮凝效果的發(fā)酵液用無菌水稀釋，制成不同梯度的稀釋菌液，取
0.1ml各梯度的稀釋液涂布到PDA固體培養(yǎng)基上，28°C靜置培養(yǎng)48h后挑取單菌落進(jìn)行劃線分離直至菌落形態(tài)一致，單菌落再經(jīng)過28°C，200rpm搖床培養(yǎng)72h，濃度達(dá)到1.0CFU/ml后按1.5:100的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)液，26°C，150rpm搖床培養(yǎng)35h測定其絮凝率，結(jié)果得到I株產(chǎn)生絮凝劑的菌株，絮凝率達(dá)89%。實(shí)施例3絮凝活性放線菌的篩選:取污水處理廠活性污泥，經(jīng)沉淀后取上清IOml加入裝有IOOml高氏一號液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，28°C，200rpm搖床培養(yǎng)6d至菌液濃度為
1.0CFU/ml，按照1.5:100的接種量接入優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)液中，28°C，150rpm搖床培養(yǎng)40h，培養(yǎng)液離心后取上清2ml，加入IOOml烏石化廢水中，測定絮凝率；經(jīng)鑒定，絮凝劑成分主要是多糖，是菌種生長過程中的代謝分泌物。測得的具有高絮凝效果的發(fā)酵液用無菌水稀釋，制成不同梯度的稀釋菌液，取0.1ml各梯度的稀釋液涂布到PDA固體培養(yǎng)基上，28°C靜置培養(yǎng)6d后挑取單菌落進(jìn)行劃線分離直至菌落形態(tài)一致，單菌落再經(jīng)過28°C，200rpm搖床培養(yǎng)5d，濃度達(dá)到1.0CFU/ml后按1.5:100的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)液，28°C，150rpm搖床培養(yǎng)40h測定其絮凝率，結(jié)果得到I株產(chǎn)生絮凝劑的菌株，絮凝率達(dá)87.9%。所用高氏一號液體培 養(yǎng)基由可溶性淀粉20g，KNO3 lg, NaCl 0.5g, K2HPO4 3H20
0.5g, MgSO4 7H20 0.5g, FeSO4 7H20 0.0lg 放入 1000ml 蒸餾水中，用 NaOH 調(diào)節(jié) pH 7.6，溫度121 °C以下，滅菌25min得到。本方法選用的原料:可溶性淀粉廠家為天津市化學(xué)試劑三廠；K2HP04廠家為天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠；kh2po4廠家為天津永晟精細(xì)化工有限公司；酵母膏廠家為北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；K2HP04 *3H20廠家為廣州市潤展化工有限公司；MgS04 *7H20廠家為天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；FeS04 7H20廠家為西安化學(xué)試劑廠；高嶺土的廠家為山西大同金源高嶺土有限責(zé)任公司；所用搖床型號為HZQ-Z。
權(quán)利要求
1.一種快速篩選微生物絮凝劑產(chǎn)生菌的方法，其特征在于:按步驟實(shí)施: 步驟I微生物的富集培養(yǎng): 取活性污泥水于燒杯中，靜置沉淀lOmin，取上清液IOml，加入裝有IOOml滅菌的LB液體培養(yǎng)基或PDA液體培養(yǎng)基或高氏一號液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，在28_37°C，200rpm搖床中培養(yǎng)，富集菌液濃度為1.0CFU/ml ； 其中PDA液體培養(yǎng)基:取新鮮土豆去皮，切成約2cm2的小塊，放入1500ml的燒杯中煮沸30min，然后用4層紗布過濾，取其濾液加葡萄糖20g，在用蒸餾水補(bǔ)足至1000ml，121°C滅菌25min,得成品； 其中高氏一號液體培養(yǎng)基:取可溶性淀粉20g、KNO3 lg、NaCl 0.5g、K2HPO4 3H200.5g、MgSO4 *7H20 0.5g、FeSO4 *7H20 0.0lg，放入 1000ml 蒸餾水中，用 NaOH 調(diào)節(jié) pH 7.6，溫度121 °C以下，滅菌25min，得到； 其中LB液體培養(yǎng)基:取蛋白胨10g、酵母浸粉5g、NaCl 5g，放入1000ml蒸餾水中，用NaOH調(diào)節(jié)pH 7.0，121°C下滅菌25min，得成品； 步驟2優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)液的制備:將可溶性淀粉 28-32g、K2HP04 4-6 g,KH2PO4 1.5-2.5g、酵母膏 3_5g、KN03 0.8-1.2g、NaCl 0.4-0.6g、MgSO4 *7H20 0.4-0.6g、FeSO4 0.008-0.013g 依次放入 950_1050ml 蒸餾水的容器中，用NaOH調(diào)節(jié)pH為7.5-8.5、溫度110_115°C下滅菌25_30min，得成品； 步驟3微生物的發(fā)酵培養(yǎng): 將步驟I富集培養(yǎng)液按1-2:100的接種量接入步驟2優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)液中培養(yǎng)，溫度25-30°C、時(shí)間30-40h、 搖床轉(zhuǎn)速100-200rpm;培養(yǎng)液離心后取上清2ml，加入IOOml廢水，測定絮凝率；其絮凝劑主要成分是多糖，是菌種生長過程中的代謝分泌物； 步驟4菌種的分離純化: 選高絮凝效果的發(fā)酵液用無菌水稀釋，制成不同梯度的稀釋菌液，取0.1ml各梯度的稀釋菌液涂布在LB固體培養(yǎng)基、PDA固體培養(yǎng)基和高氏一號固體培養(yǎng)基上，在28-37°C靜置培養(yǎng)，待長出單菌落后，挑取單菌落再經(jīng)28-37°C、200rpm搖床培養(yǎng)，濃度達(dá)到1.0 CFU/ml后按1.5:100的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)液，25-30°C，150rpm搖床培養(yǎng)30_40h測定其絮凝率，結(jié)果得產(chǎn)生絮凝劑的菌株，絮凝率達(dá)80-90% ； 步驟5絮凝率的測定方法:稱取4g高嶺土溶于IOOOml蒸餾水中配置成4g/L的高嶺土懸浮液，稱取Ig CaCl溶于IOOml蒸餾水中配置成1%的溶液；取IOOml高嶺土懸浮液于250ml燒杯中，用NaOH調(diào)節(jié)pH7.0，加入2ml 1%的CaCl溶液和2ml的發(fā)酵培養(yǎng)液，先快速攪拌2min再緩慢攪拌3min，靜置IOmin后取上清液，用分光光度計(jì)在550nm處測定其吸光度，以加入發(fā)酵培養(yǎng)基的高嶺土懸浮液做對照試驗(yàn)，絮凝率計(jì)算公式:絮凝率=(A-B) /AX 100% ;其中A為對照上清液在550nm處的吸光度；B為加入發(fā)酵液的樣品上清液在550nm處的吸光度。
全文摘要
本發(fā)明提供的一種快速篩選微生物絮凝劑產(chǎn)生菌的方法，包括微生物的富集培養(yǎng)，取活性污泥水于燒杯中，靜置沉淀10min，取上清液10ml，加入裝有100ml滅菌的LB液體培養(yǎng)基或PDA液體培養(yǎng)基或高氏一號液體培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，在28-37℃，200rpm搖床中培養(yǎng)，富集菌液濃度為1.0CFU/ml；優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)液的制備，將可溶性淀粉28-32g、K2HPO4 4-6g、KH2PO41.5-2.5g、酵母膏3-5g、KNO30.8-1.2g、NaCl0.4-0.6g、MgSO4·7H2O0.4-0.6g、FeSO40.008-0.013g依次放入950-1050ml蒸餾水的容器中，用NaOH調(diào)節(jié)pH7.5-8.5、溫度110-115℃下滅菌25-30min，即得；還包括微生物的發(fā)酵培養(yǎng)，菌種的分離純化，絮凝率的測定。
文檔編號C12N1/02GK103173378SQ201210567049
公開日2013年6月26日 申請日期2012年12月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月24日
發(fā)明者韋超英, 曾凡付, 王剛, 潘洪濤, 唐倩倩, 侯榮 申請人:新疆德藍(lán)股份有限公司