一種產α-淀粉酶的菌株及其產生的酸性α-淀粉酶的制作方法
【技術領域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種產α-淀粉酶的菌株及其產生的酸性α-淀粉酶以及其酶學性質，屬于生物工程領域。
【背景技術】
[0002]α-淀粉酶可作用于淀粉的α-l，4糖苷鍵，能夠快速有效地分解淀粉，廣泛應用于紡織、發(fā)酵及制糖等諸多方面，在工業(yè)生產中占有極其重要的地位，是目前用途較廣泛的一種酶制劑。特別是微生物產α-淀粉酶已廣泛應用于食品、飲料、制藥、紡織等行業(yè)。
[0003]不同的α-淀粉酶來自不同的植物、動物、微生物。微生物由于其生物多樣性以及基因操作使得酶更易于積累，現(xiàn)在利用微生物發(fā)酵富集生產已經逐漸替代了傳統(tǒng)從復雜真核細胞中提取α_淀粉酶的方法，成為工業(yè)α_淀粉酶生產的重點。
[0004]目前，工業(yè)生產中α-淀粉酶主要來自芽孢桿菌與曲霉。高效菌種的獲得是微生物發(fā)酵α-淀粉酶的關鍵前提，大多從發(fā)酵廢液、海底火山口處、酒糟或富含淀粉的土樣中分離，誘變育種有助于進一步篩選高產菌株。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的正是基于上述現(xiàn)有技術狀況而提供一種自主分離并經物理誘變篩選培育而得到的產α-淀粉酶的菌株及其產生的酸性α-淀粉酶，并得到其酸性α-淀粉酶酶學性質。
[0006]本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的:
一種產α_淀粉酶的菌株，菌株的名稱為勒克氏菌屬(Leclercia sp.)的菌株Zl_2_l，該菌株2015年11月5日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，菌種保藏號為CGMCC N0.11587。
[0007]該Ζ1-2-1菌株為自主分離自土壤并經紫外誘變育種篩選而得到，該菌株16SrRNA基因序列已提交GenBank數據庫，登錄號為KU055632。
[0008]更具體的說，本發(fā)明對自然篩選出菌株Z1-2進行紫外誘變，在經十代傳代并測定酶活后，挑選出酶活較高且傳代穩(wěn)定菌株Z1-2-1，為62.70 U/mLo
[0009]本發(fā)明提供了菌株Z1-2-1的酸性α-淀粉酶熱穩(wěn)定性性質，所述酸性α-淀粉酶最適溫度在55°C，酶在40-50°C下相對較穩(wěn)定，在60°C放置60min后，仍有較高殘余酶活。
[0010]本發(fā)明提供了菌株Z1-2-1的酸性α-淀粉酶pH穩(wěn)定性性質，所述酸性α-淀粉酶在ΡΗ6.0時酶活性最高，ρΗ5.0-6.0間酶活性下降不大，該酶pH耐受范圍為3.4-6.4。
[0011 ]本發(fā)明提供了菌株Z1-2-1的酸性α-淀粉酶Ca2+對其的影響，Z1-2-1在Ca2+濃度為I mmol/L時酶活最高，為對照的124%，一定濃度的Ca2+對酶活有促進作用。5、10、15、20mmol/L Ca2+濃度對酶活有抑制作用，且隨濃度升高抑制作用越強。
[0012]本發(fā)明的有益效果:自采集的面粉廠土壤中篩選獲得一種產酸性α-淀粉酶的細菌菌株Zl-2-ULeclercia sp.Zl_2_l)，所產酸性α-淀粉酶酶活較高，使用pH范圍廣，具有良好的耐酸性和一定的耐高溫性。
[0013]【附圖說明】:
圖1:不同pH下酶的穩(wěn)定性。
[0014]圖2:Ca2+濃度對酶活的影響。
【具體實施方式】
[0015]本發(fā)明用下列實例來進一步說明本發(fā)明，但不限于下列實例。
[0016]實施例1
實驗室馴化土壤，制備菌懸液并以十倍梯度稀釋法涂布于篩選培養(yǎng)基。滴加碘液，記錄有透明圈的菌株。將初篩有透明圈的菌株，接種種子培養(yǎng)基，以10%的接種量轉至發(fā)酵培養(yǎng)基，相同條件培養(yǎng)24 h。發(fā)酵液離心，上清為粗酶液，測定酶活。菌種接種至種子培養(yǎng)基，生長至對數期，離心收集菌體，無菌生理鹽水洗滌兩次后重懸，稀釋至菌體含量18個/mL。置于紫外燈下30cm處，處理Os、30s、60s、90s、120s、150s、180s，將誘變完菌液，梯度稀釋，選擇合適的稀釋度涂布，避光培養(yǎng)，以未處理為對照計算致死率。
[0017]篩選培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl5，可溶性淀粉10，瓊脂粉15。使用前將pH調至5.0。
[0018]種子培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨5，可溶性淀粉 1j(NH4)2SO4 2.5,KH2PO4 3, CaCl2
0.2，卩!1調至5.0。
[0019]發(fā)酵培養(yǎng)基:同于上述種子培養(yǎng)基。
[0020]酶活測定方法為DNS法。
[0021 ]酶活定義:60°C、pH6.0條件下，I mL酶液每分鐘水解淀粉產生I mg麥芽糖的酶量為一個酶活力單位，單位為U/mL。
[0022]酶活公式:待測酶活(U/mL)=D*(R-Ro)/10/0.5，其中D:稀釋倍數，Ro:對照麥芽糖量，R:酶液反應1min后麥芽糖量，10:反應1min,0.5:0.5 mL酶液。
[0023]篩選出產酸性α-淀粉酶的菌株中，Z1-2菌株的透明圈/菌落直徑比最大，D/d為5，選其作為實驗菌株。
[0024]Z1-2經紫外誘變，以酶活提高最大的菌株Z1-2-1為實驗菌株，誘變后酶活達62.70U/mL。經十代傳代培養(yǎng)測定酶活，其傳代較穩(wěn)定，酶活基本保持不變。
[0025]實施例2
熱穩(wěn)定性:37°C、200 r/min培養(yǎng)12 h的發(fā)酵液上清作為粗酶，設置40、50、55、60、65、70、80和90°C溫度條件測定酶活以確定酶反應最適溫度。
[0026]酶液在40、50、60、70、80、90°C水浴鍋中保溫60 min，每隔15 min取I mL酶液迅速放在冰上冷卻，然后測定酶活性，判斷酶的熱穩(wěn)定性，該酶在40-50°C下相對較穩(wěn)定，在60°C放置60min后，仍有較高酶活。
[0027]pH穩(wěn)定性:37°C、200 r/min培養(yǎng)12 h的發(fā)酵液上清作為粗酶，將酶反應體系pH值設為3.0、3.4、4.0、4.4、5.0、5.4、6.0、6.4。酶活性最高的反應體系pH即為酶的最適作用pH值。該酶pH6.0時酶活最高，pH4.4-6.4條件下均保持80%以上的相對酶活。
[0028]將粗酶液放在上述不同pH值的緩沖液中，55°C保溫30min，然后測定酶活性，從而判斷酶對PH的穩(wěn)定性，測定結果見圖1。
[0029]Ca2+對酶活的影響:37°C、200 r/min培養(yǎng)12 h的發(fā)酵液上清作為粗酶，在酶反應體系分別添加1、5、10、15、20 mmol/L Ca2+，測定酶活，確定Ca2+對酶活的影響，測定結果見圖2。
【主權項】
1.一種產α-淀粉酶的菌株，其特征在于:菌株的名稱為勒克氏菌屬(Leclerciasp.)Z1-2-1，該菌株2015年11月5日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC N0.11587。2.根據權利要求1所述的產α-淀粉酶的菌株，其特征在于:該菌株為自主分離自土壤并經紫外誘變育種篩選而得到，該菌株16S rRNA基因序列已提交GenBank數據庫，登錄號為KU055632o3.—種利用權1-2所述菌株發(fā)酵制備的酸性α-淀粉酶，其特征在于:所述酸性α-淀粉酶耐受pH范圍3.4-6.4，pH6.0、溫度55°C時酶活最高，于80°C下仍有酶活，在Ca2+ I mmol/L時酶活最高，為未加Ca2+的124%，一定濃度的Ca2+對酶活有促進作用。
【專利摘要】一種產α-淀粉酶的菌株及其產生的酸性α-淀粉酶，其特征在于：該菌株的名稱為勒克氏菌屬（<i>Leclercia？</i>sp.）菌株Z1-2-1，于2015年11月5日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為？CGMCC？No.？11587。該菌株為自主分離自土壤并經紫外誘變育種篩選而得到。利用該Z1-2-1菌株發(fā)酵制備的酸性α-淀粉酶，耐受pH范圍3.4-6.4，最適作用pH6.0，最適作用溫度55℃，于80℃下仍有酶活，在Ca2+？1？mmol/L時酶活最高，為未加Ca2+的124%，一定濃度的Ca2+對酶活有促進作用。CGMCC No. 1158720151105
【IPC分類】C12R1/01, C12N9/26, C12N1/20
【公開號】CN105524873
【申請?zhí)枴緾N201610071794
【發(fā)明人】屈建航, 尹伊, 李海峰, 王金水, 胡元森, 翟丹丹, 賈峰, 張帥兵, 屈凌波
【申請人】河南工業(yè)大學
【公開日】2016年4月27日
【申請日】2016年2月2日