異源多糖在植物中的產生的制作方法
【專利說明】異源多糖在植物中的產生
[0001] 概述
[0002] 本發(fā)明提供了在植物中產生細菌芙膜糖、細菌膜糖和/或細菌或病毒免疫原性糖 的方法。還提供了包含細菌芙膜糖、細菌膜糖和/或細菌或病毒免疫原性糖的植物、植物部 分、植物細胞、植物提取物、植物組織或愈傷組織和植物產物；W及包含細菌芙膜糖、細菌膜 糖和/或細菌或病毒免疫原性糖的植物、植物部分、植物細胞、植物提取物、植物組織或愈 傷組織和植物產物例如作為疫苗的用途。本發(fā)明還提供了在植物中產生的細菌芙膜糖、細 困胺糖和/或細困或病毒免疫原性糖。
[000引背景
[0004] 使用重組和非重組技術操作植物W改進如花發(fā)育、種子發(fā)育、耐旱性、改進的養(yǎng) 分吸收及改進的或改良的種子內容物的各種各樣的特性已被知曉許多年。植物還已被 用于產生最初源自生物體諸如細菌或真菌的產物。例如，已在植物中進行了聚鏈燒酸醋 (polya化anoates)，諸如聚徑基下酸醋（P皿）或聚徑基戊酸醋（PHV)的產生（參見，例如W0 92/19747)〇
[0005] 轉基因植物已被公認作為用于產生蛋白的有價值的表達系統(tǒng)。該想法首先于1990 年在PCT/US89/03799中討論，其報道了煙草植物中變形鏈球菌（Str巧tococ州Smutans) 表面蛋白抗原A(SpaA)的表面蛋白的表達。盡管沒有報道運個研究更進一步的詳細內容， 其為進一步的發(fā)展鋪平了道路，所述進一步的發(fā)展包括乙型肝炎病毒表面抗原化bsAg)和 腸毒素諸如大腸桿菌巧.coli)熱不穩(wěn)定腸毒素B亞基化TB)的表達。
[0006] 植物還被用于產生糖。例如，W096/01904描述了通過用能夠將薦糖轉化為寡糖的 酶轉化植物細胞，在植物細胞中產生寡糖。與此相似，W096/06173描述了遺傳操作植物W 增加儲存的碳水化合物，諸如薦糖、果糖和葡聚糖（glucan)的量。該方法包括用催化葡聚 糖（glucan)形成的細菌酶[P]-D-葡糖基轉移酶轉化植物。W000/9729描述了通過用一種 或更多種產生幾下質的酶轉化植物，在植物中產生幾下質。
[0007] 本領域已描述了細菌酶在植物中的應用，但運限于產生細菌碳水化合物諸如葡聚 糖（dextran)。W0 96/06173描述了產生表達鏈球菌糖基化蛋光素酶W催化產生可溶性葡 聚糖（glucan)諸如葡聚糖（dextran)的遺傳修飾的植物。W02006/063862描述了在質體中 表達來自細菌（腸膜明串珠菌化.mesenterides))的葡聚糖薦糖酶W通過在植物細胞中提 供葡聚糖（dextran)來改變淀粉產生。
[0008] 還改造植物W改變天然多糖諸如淀粉的產生。在某些情況下，運已通過操作植物 多糖途徑來實現(xiàn)。W003/026389公開了通過改變植物中的多糖合成途徑來操作植物多糖的 方法。具體地，該方法將多糖從植物中的一個生物合成途徑重新變更為植物中的另一個， W改變植物細胞、組織或器官中的多糖組成。因此，所產生的多糖是天然植物多糖。此外， US6639126示出了，通過修飾普魯蘭酶（pullunase)改造例如淀粉的物理特性。
[0009] 存在由非植物生物體產生的許多在商業(yè)上和醫(yī)學上重要的多糖。例如，致病菌 通常產生稠的、粘液芙膜多糖。運樣的多糖已從初始生物體分離并用作疫苗。由于包封 多糖的細菌是全世界的發(fā)病率和死亡率的主要原因（例如，肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae)是全世界多于50%的侵入性疾病的原因），且接種疫苗是僅有的預防性方法， 成功接種疫苗的方案是非常重要的。
[0010] 多糖疫苗是昂貴的，并且運阻止其在發(fā)展中國家使用。增加國家引入疫苗，諸如多 糖疫苗的可能性的因素是其制造該疫苗本身的能力。
[0011] 存在超過90種不同血清型的肺炎鏈球菌，各自具有不同的多糖包衣。當前的 疫苗包括特定地理區(qū)域的多達23種最主要的血清型，致使其在其他區(qū)域不太有效。在 其中它們是有效的區(qū)域中，免疫已導致出現(xiàn)了在疫苗中沒有的血清型。因此，肺炎球菌 (pneumococcal)疫苗需要定期重制，W提供最大的保護。
[0012] 本發(fā)明的目的在于克服或改善與現(xiàn)有技術相關的一些或全部問題。
[0013] 因此，在第一方面，本發(fā)明提供了在宿主植物細胞中產生i)細菌芙膜糖、ii)細菌 膜糖和/或iii)細菌或病毒免疫原性糖的方法，所述方法包括：
[0014] 1)提供植物細胞；
[0015] 2)向植物細胞中引入異源蛋白或核巧酸序列，所述異源蛋白或核巧酸序列使所述 細菌或病毒的糖能夠在植物細胞中合成；
[0016] 3)在合成所述細菌或病毒的糖的合適條件下維持宿主植物細胞擬及任選地
[0017] 4)從宿主植物細胞收獲細菌或病毒的糖。
[0018] 本發(fā)明優(yōu)選地使用細菌或病毒的酶首次使能夠在植物細胞中合成i)細菌芙膜 糖、ii)細菌膜糖和/或iii)細菌或病毒免疫原性糖。通常，運包括將異源（即不是植物 細胞天然的）糖合成步驟引入植物細胞。本發(fā)明的方法可包括將合成細菌芙膜糖、細菌膜 糖和/或細菌或病毒免疫原性糖的天然途徑與天然植物糖生物合成途徑比較，W確定在宿 主植物細胞中使細菌或病毒的糖能夠由宿主植物細胞產生需要的任何反應步驟。任選地， 該比較可用于確定在天然植物糖生物合成途徑中的任何步驟，所述步驟對于產生細菌或病 毒的糖是不必要的，或所述步驟可能阻止或減少細菌或病毒的糖的產生（例如通過競爭）。 因此，通過在宿主植物細胞中提供異源蛋白或核巧酸序列，所述異源蛋白或核巧酸序列能 夠提供使細菌或病毒的糖生物合成途徑能夠在宿主植物細胞中合成的反應步驟，宿主植物 細胞可被利用用于產生i)細菌芙膜糖、ii)細菌膜糖和/或iii)細菌或病毒免疫原性糖。 優(yōu)選地，修飾的植物途徑能夠使用天然植物底物?？商娲?，可使用異源底物。
[0019] 本發(fā)明可具有產生疫苗的特別應用。轉基因植物提供了對穩(wěn)定的疫苗，特別是在 第=世界國家中的穩(wěn)定的疫苗的成本和局部可用性的問題的解決方案，在所述第=世界國 家中發(fā)現(xiàn)了疫苗可預防疾病的最大負擔，而且所述第=世界國家經(jīng)濟最不能夠承擔成本。 在植物中大規(guī)模地產生糖疫苗的能力引入了可降低生產成本的規(guī)模經(jīng)濟。使用微生物作為 疫苗生產系統(tǒng)需要昂貴的發(fā)酵設備和高水平的質量控制，W防止污染W(wǎng)及包含代表健康和 安全風險的致病生物體。相比之下，使用植物用于疫苗生產是相對低成本的解決方案，開放 本地生產的可能性。在可食用植物中生產疫苗可通過除去對下游處理的需求而進一步降低 成本?？墒秤玫霓D基因植物還通過提供免除對針的需要的系統(tǒng)提供了遞送疫苗的改進的工 具。運不僅對接受者可更容易接受，而且它可減少醫(yī)護人員暴露于血液污染的銳器。
[0020] 植物生產系統(tǒng)是藥品和食品的傳統(tǒng)來源，使用植物生產系統(tǒng)的另外的優(yōu)勢設及安 全性和下游處理成本。可食用植物的細胞不攜帶人類病原體或污染物諸如致熱原和內毒 素，并因此可避免大量的純化程序。
[0021] 最后，與更昂貴的微生物發(fā)酵系統(tǒng)相比，基于植物生產微生物多糖的預測的財務 效益可增加細菌多糖的廣闊工業(yè)用途。
[0022] 由本發(fā)明產生的細菌芙膜或膜糖可W是免疫原性糖。
[0023] 第一方面的方法還可包括：
[0024] (i)確定i)細菌芙膜糖、ii)細菌膜糖和/或iii)細菌或病毒免疫原性糖的分子 結構和/或闡明其天然的細菌或病毒的糖生物合成途徑；
[0025] (ii)將步驟i)中確定的分子結構和/或天然細菌或病毒的糖生物合成途徑與宿 主植物細胞的天然植物糖的分子結構和/或天然植物糖生物合成途徑比較，W確定使細菌 或病毒的糖能夠在宿主植物細胞中產生所需要的任何反應步驟；
[0026] (iii)確定可提供步驟ii)中確定的使細菌或病毒的糖能夠在宿主植物細胞中產 生的反應步驟的蛋白或核巧酸序列。
[0027] 本發(fā)明的方法還可包括下調天然植物糖生物合成途徑或反應步驟，W使i)細菌 芙膜糖、ii)細菌膜糖和/或iii)細菌或病毒免疫原性糖能夠在宿主植物細胞中產生。運 樣的反應步驟可W是與選擇的生物合成途徑競爭或與其反應步驟競爭（例如競爭底物）的 反應步驟，并因此其下調可改進用于產生細菌或病毒的糖的天然植物糖生物合成途徑的利 用。
[0028] 天然植物糖生物合成途徑可W是在植物細胞中天然發(fā)現(xiàn)的產生糖的天然植物糖 生物合成途徑。因此，該途徑可W是宿主植物細胞中天然進行，即沒有人為干預的途徑?？?選地，該途徑可W是在宿主植物細胞類型，例如在植物的祖先中已被預先修飾的途徑。當植 物細胞糖生物合成途徑已在例如細胞或植物的祖先中被預先修飾時，所述途徑（和糖）在 本文中可稱為是宿主植物細胞天然的。天然反應步驟是天然途徑的一部分。
[0029] 如本文限定的用于合成細菌或病毒的糖的天然途徑，是在細菌細胞或病毒感染的 細胞中天然產生運樣的細菌或病毒的糖的途徑。因此，雖然途徑的步驟可發(fā)生在植物細胞 中，通常導致產生細菌或病毒的糖的一個或更多個反應步驟將不是植物細胞天然的。因此， 途徑是除了選擇的宿主植物細胞W外的細胞天然的（即天然存在的）。途徑可W是例如在 祖先細胞中已被預先修飾的途徑。當細菌或病毒的糖生物合成途徑已在例如細胞的祖先中 被預先修飾時，途徑（和糖）在本文中稱為是細胞天然的。最優(yōu)選地，細菌糖生物合成途徑 是細菌起源的，并且更優(yōu)選地是鏈球菌起源的。最優(yōu)選地，細菌糖生物合成途徑是肺炎鏈球 菌天然的。
[0030] 待由宿主植物細胞產生的細菌芙膜糖、細菌膜糖和/或細菌或病毒免疫原性糖不 是宿主植物細胞天然的，即在自然中，所述糖不由選擇的宿主植物細胞產生，或不存在于選 擇的宿主植物細胞中。因此，它稱為對宿主植物細胞是異源的。
[0031] 病毒意指它在病毒顆?；蛴刹《靖腥镜募毎邪l(fā)現(xiàn)，盡管當未被病毒感染時，所 述病毒可W不是細胞天然的。當糖是病毒天然的時，其優(yōu)選地源自病毒衣殼。通常，其可W 是動物致病性的病毒，如本文定義的，并且可排除植物病毒。因此，病毒可W是并非植物細 胞天然的病毒，并因此，病毒的糖對植物細胞將是異源的。它可由病毒感染的細胞使用宿主 細胞機器產生。
[0032] 免疫原性細菌或病毒的糖是能夠引發(fā)哺乳動物，優(yōu)選地人的免疫應答的糖。細菌 免疫原性糖可W是肺炎球菌的。最優(yōu)選地，糖是肺炎鏈球菌天然的。
[0033] 在第二方面，本發(fā)明提供了遺傳修飾的植物細胞，所述遺傳修飾的植物細胞能夠 產生i)細菌芙膜糖、ii)細菌膜糖和/或iii)細菌或病毒免疫原性糖，其中植物細胞包含 使細菌或病毒的糖能夠在宿主植物細胞中產生的異源蛋白和/或核巧酸序列。
[0034] 在一個實施方案中，遺傳修飾的植物細胞包含i)細菌芙膜糖、ii)細菌膜糖和/或 iii)細菌或病毒免疫原性糖。
[0035] 在第=方面，本發(fā)明提供了植物、植物部分或植物提取物、植物組織或愈傷組織， 所述植物、植物部分或植物提取物、植物組織或愈傷組織包含能夠產生i)細菌芙膜糖、ii) 細菌膜糖和/或iii)細菌或病毒免疫原性糖的遺傳修飾的植物細胞，其中植物細胞包含使 細菌或病毒的糖能夠在植物細胞中產生的異源蛋白和/或核巧酸序列。異源蛋白和/或核 巧酸序列可如本文所述。
[0036] 在一個實施方案中，植物、植物部分或植物提取物、植物組織或愈傷組織可包含 遺傳修飾的植物細胞，所述遺傳修飾的植物細胞包含i)細菌芙膜糖、ii)細菌膜糖和/或 iii)細菌或病毒免疫原性糖。還提供了一種可食用的疫苗，所述可食用的疫苗由包含遺傳 修飾的植物細胞的植物、植物部分或植物提取物組成，所述遺傳修飾的植物細胞包含i)細 菌芙膜糖、ii)細菌膜糖和/或iii)細菌或病毒免疫原性糖。
[0037] 在第四方面，提供了一種植物產物，所述植物產物包含i)細菌芙膜糖、ii)細菌膜 糖和/或iii)細菌或病毒免疫原性糖。優(yōu)選地，植物產物源自如本文定義的植物細胞、植 物、植物組織、植物提取物或愈傷組織。
[0038] 在第五方面，提供了細菌芙膜糖、細菌膜糖和/或細菌或病毒免疫原性糖，所述細 菌芙膜糖、細菌膜糖和/或細菌或病毒免疫原性糖通過本發(fā)明的方法獲得。糖可從植物細 胞中提取。它可被分離?？蓪⑻羌兓?，使得它基本上不含植物材料。
[0039] 在第六方面，本發(fā)明提供了基于糖的產品，所述基于糖的產品包含根據(jù)本發(fā)明的 植物細胞、植物、植物部分、植物提取物、植物組織、或愈傷組織、或提取的或純化的糖。優(yōu)選