專利名稱：一種磷霉素產(chǎn)生菌株的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體為一種抗生素產(chǎn)生菌—磷霉素產(chǎn)生菌株的篩選方法。
背景技術(shù)：
磷霉素[(-)-順-(1R，2S)-1，2-環(huán)氧丙基磷酸，F(xiàn)OM]是一種廣譜抗生素。它具有獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗菌作用機(jī)制，與其他抗生素或抗菌藥之間不僅沒(méi)有交叉耐藥性，而且多數(shù)呈現(xiàn)協(xié)同作用。同時(shí)，因?yàn)榱酌顾剡€具有理化特性穩(wěn)定、安全低毒、無(wú)抗原性(無(wú)需試敏)等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛用于臨床治療，被國(guó)際醫(yī)學(xué)界和藥學(xué)界稱為二十一世紀(jì)的新抗生素。
FOM可以經(jīng)過(guò)微生物轉(zhuǎn)化作用獲得。傳統(tǒng)的磷霉素產(chǎn)生菌株篩選方法是采用振蕩培養(yǎng)方法篩選轉(zhuǎn)化菌株，即在振蕩培養(yǎng)后，把發(fā)酵液離心，獲取上清液作為特測(cè)定樣品，然后以生物鑒定盤鑒定上清液是否產(chǎn)生抑菌圈，從而判斷是否有抗生素存在。這種方法的缺點(diǎn)是當(dāng)發(fā)酵液中抗生素含量較低時(shí)，在生物鑒定盤上檢測(cè)不到抗生素(如磷霉素)的存在，從而導(dǎo)致篩選工作失敗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種靈敏、高效的磷霉素產(chǎn)生菌株的篩選方法，采用本發(fā)明可以提高單位體積發(fā)酵液中磷霉素的含量，從而提高鑒定的靈敏性。
本發(fā)明的技術(shù)方案是一種磷霉素產(chǎn)生菌株的篩選方法，首先，對(duì)搖床培養(yǎng)后的菌株發(fā)酵液進(jìn)行冷凍濃縮；然后，利用牛津杯在生物鑒定盤或平板上鑒定發(fā)酵液對(duì)敏感菌的抗性，以初步確定是否為抗生素產(chǎn)生菌；所述冷凍濃縮的步驟如下(1)冷卻劑的制備冷卻劑采用體積濃度4～10％的乙醇，將乙醇在-30℃～-10℃的冰箱里預(yù)冷30min～1小時(shí)，得到已結(jié)冰的乙醇-冰冷卻劑；(2)發(fā)酵液的預(yù)處理將發(fā)酵液放到冰箱冷凍室中，冷卻到0～10℃；(3)冷凍濃縮將已預(yù)冷卻到0～10℃的發(fā)酵液放置到乙醇-冰冷卻劑中，于真空度為10～20Pa、冷凍溫度為-30℃～-10℃下，冷凍15min～2小時(shí)，至干燥形成濃縮液為止。
所述的磷霉素產(chǎn)生菌株的篩選方法，在生物鑒定盤或平板的培養(yǎng)表面放置牛津杯，使牛津杯與培養(yǎng)基接觸無(wú)空隙，向牛津杯中加入濃縮液，置28～37℃培養(yǎng)20～36小時(shí)，觀察抑菌圈的有無(wú)及抑菌圈直徑的大??；從而，在生物鑒定盤或平板上鑒定發(fā)酵液對(duì)敏感菌的抗性，以初步確定是否為抗生素產(chǎn)生菌。
所述的磷霉素產(chǎn)生菌株的篩選方法，采用右旋磷霉素為底物培養(yǎng)待測(cè)菌株，利用大腸桿菌為生物鑒定的指示菌。
所述的磷霉素產(chǎn)生菌株的篩選方法，在初步確定是否為抗生素產(chǎn)生菌之后，再利用薄層層析進(jìn)一步來(lái)驗(yàn)證發(fā)酵液中是否存在磷霉素。
所述的磷霉素產(chǎn)生菌株的篩選方法，利用薄層層析分析磷霉素，展開(kāi)劑組分為正丁醇、乙酸、水，按體積比3∶1∶1混合，將展開(kāi)后的層析板風(fēng)干，置于生物鑒定盤或平板上，待浸潤(rùn)后取下，28～37℃培養(yǎng)16～24小時(shí)至生物鑒定盤或平板上產(chǎn)生抑菌圈；比較樣品與磷霉素標(biāo)準(zhǔn)品的Rf值，驗(yàn)證產(chǎn)生的抗生素是否為磷霉素。
所述的乙醇-冰冷卻劑中，冰為碎冰，冰粒直徑1mm～5mm。
所述培養(yǎng)后的菌株發(fā)酵液，經(jīng)過(guò)離心收集上清液，將上清液置于攪拌器上攪拌均勻后，再對(duì)其進(jìn)行冷凍濃縮。
所述的磷霉素產(chǎn)生菌株的篩選方法，冷凍濃縮后的濃縮液濃度為原來(lái)的2～10倍。
本發(fā)明的有益效果是1.本發(fā)明篩以右旋磷霉素為底物，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上接種待測(cè)菌株，保持適合的溫度和濕度，培養(yǎng)一定時(shí)間，挑取單菌落獲得純培養(yǎng)。然后對(duì)純培養(yǎng)進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)復(fù)篩，取發(fā)酵液離心后，把上清液冷凍濃縮，然后利用牛津杯在生物鑒定盤或平板上鑒定其對(duì)敏感菌的抗性，以初步確定是否為抗生素產(chǎn)生菌(如磷霉素產(chǎn)生菌株)。該方法的關(guān)鍵是控制冷凍濃縮條件，增加單位體積發(fā)酵液中抗生素(如磷霉素)的含量，提高鑒定靈敏度和效率。
2.本發(fā)明采用的冷凍濃縮方法現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于果汁、啤酒、咖啡、牛奶、中草藥等的制作過(guò)程中。本發(fā)明將磷霉素生物轉(zhuǎn)化菌株發(fā)酵液冷凍濃縮的方法應(yīng)用于篩選過(guò)程中，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，冷凍濃縮法也可以用于抗生素產(chǎn)生菌的篩選過(guò)程，從而成為一種靈敏、高效的抗生素產(chǎn)生菌篩選新技術(shù)，靈敏度和鑒定效率都有大幅度的提高。
3.本發(fā)明培養(yǎng)后的菌株發(fā)酵液，經(jīng)過(guò)離心收集上清液，將上清液置于攪拌器上攪拌均勻后，再對(duì)其進(jìn)行冷凍濃縮，得到均一的濃縮液，從而提高濃縮效率。
4.本發(fā)明具有不使抗生素失活、操作簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于增加單位體積發(fā)酵液中磷霉素的濃度和提高磷霉素轉(zhuǎn)化菌株的鑒定效率非常適用。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的具體操作步驟如下1.指示菌培養(yǎng)與懸液的配制指示菌為大腸桿菌(E.coli)，中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所保藏。
按重量百分?jǐn)?shù)計(jì)，指示菌培養(yǎng)基組成牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，瓊脂2％，余量為自來(lái)水。加熱溶解后，調(diào)pH 7.0～7.2。裝入茄型瓶90mL，121℃濕熱滅菌(本發(fā)明濕熱滅菌可采用蒸氣等)20min后，擺斜面?zhèn)溆谩?br> 指示菌培養(yǎng)37℃培養(yǎng)24小時(shí)，菌苔呈半透明至白色。
指示菌懸液的制備把100mL滅菌的生理鹽水倒入茄型瓶中，用接種環(huán)刮洗菌苔，再將刮洗液倒入滅菌的空錐瓶中，測(cè)定吸光度(O.D.值)為0.54～0.57。
2.磷霉素生物轉(zhuǎn)化菌株的初篩與復(fù)篩以右旋磷霉素為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基的組成按重量百分?jǐn)?shù)計(jì)，右旋磷霉素0.5％，(NH4)2SO40.5％，NaCl 0.2％，KCl 0.1％，MgSO4·7H2O 0.01％，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01％，KH2PO40.05％，瓊脂2％，余量為自來(lái)水，pH 7.5。121℃濕熱滅菌20min。
肉湯斜面培養(yǎng)基組成按重量百分?jǐn)?shù)計(jì)，牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.2％，瓊脂2％，pH 7.5，余量為自來(lái)水。121℃濕熱滅菌20min。
初篩培養(yǎng)基的組成按重量百分比數(shù)計(jì)，右旋磷霉素0.5％，蛋白胨0.1％，NaCl 0.5％，(NH4)2SO40.5％，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01％，瓊脂2％，余量為自來(lái)水，pH7.5。121℃濕熱滅菌20min。
復(fù)篩培養(yǎng)基的組成按重量百分比數(shù)計(jì)，右旋磷霉素0.5％，蛋白胨0.1％，NaCl 0.5％，(NH4)2SO40.5，余量為自來(lái)水，pH 7.5。121℃濕熱滅菌20min。
取1.0g土樣，加至100mL選擇培養(yǎng)基中，30℃搖床振蕩培養(yǎng)2周。將選擇培養(yǎng)基融化后，于直徑為90mm的培養(yǎng)皿中倒入25mL，靜置凝固。將上述土壤懸液系列稀釋到10-3、10-4、10-5，取各稀釋度土壤懸液0.1mL涂布于選擇培養(yǎng)基平板，30℃培養(yǎng)2～4天。挑取單菌落分別點(diǎn)種于不含碳源的對(duì)照平板和選擇培養(yǎng)基平板，再經(jīng)30℃培養(yǎng)2～4天，挑取僅在選擇培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)的菌落，接種到肉湯斜面培養(yǎng)基。
將斜面菌種挑取兩環(huán)接入到裝有30mL初篩培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于30℃，180轉(zhuǎn)/分搖床振蕩培養(yǎng)24小時(shí)后，以體積比1％接菌量接種到復(fù)篩培養(yǎng)基中，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)3～5天。然后，發(fā)酵液12000轉(zhuǎn)/分離心5min，收集上清液。
3.磷霉素生物轉(zhuǎn)化菌株發(fā)酵液的冷凍濃縮冷卻劑的制備乙醇(體積濃度4％)在-20℃的冰箱里預(yù)冷30min～1小時(shí)，形成結(jié)冰的乙醇-冰冷卻劑，冰應(yīng)為碎冰，冰粒直徑1mm～2mm，有利于在短時(shí)間內(nèi)形成均一的冷卻劑。
磷霉素轉(zhuǎn)化菌株發(fā)酵液的冷凍濃縮將搖床培養(yǎng)后的20mL上清液，置于50mL燒杯中，在轉(zhuǎn)速400轉(zhuǎn)/分的攪拌器上攪拌10min，然后將得到的發(fā)酵液放到冰箱冷凍室中，冷卻到6℃。將已預(yù)冷卻到6℃的發(fā)酵液裝進(jìn)容器后，放置到已結(jié)冰的乙醇-冰冷卻劑中，于真空度為10～20Pa、冷凍溫度為-20℃下冷凍濃縮15min～2小時(shí)，至干燥形成濃縮液為止，濃縮比2∶1～10∶1。
4.磷霉素生物轉(zhuǎn)化菌株的篩選生物鑒定培養(yǎng)基及其平板的制備按重量百分?jǐn)?shù)計(jì)，培養(yǎng)基I成分牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，瓊脂2％，余量為自來(lái)水，pH 7.0～7.2；培養(yǎng)基II成分牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，葡萄糖1％，瓊脂1.5％，余量為自來(lái)水，pH 7.0～7.2。培養(yǎng)基I、培養(yǎng)基II均在121℃滅菌20min。
將20mL融化的培養(yǎng)基I倒入直徑為90mm的培養(yǎng)皿中制成下層平板；再將4mL融化的培養(yǎng)基II冷卻至55℃，加入指示菌懸液1mL，迅速混勻后倒入培養(yǎng)皿，制成上層平板。待冷卻凝固后，于每個(gè)平板的培養(yǎng)表面放置6個(gè)消毒牛津杯(內(nèi)徑6mm、外徑8mm、高10mm)，使牛津杯在半徑為2.8cm的圓面上成60度角的間距。輕輕加壓，使牛津杯與培養(yǎng)基接觸無(wú)空隙。然后，向牛津杯中加入濃縮液1mL，置30℃培養(yǎng)20～36小時(shí)，至產(chǎn)生明顯的敏感菌菌落，觀察抑菌圈的有無(wú)及抑菌圈直徑的大小。通過(guò)鑒定其對(duì)敏感菌的抗性，可以初步確定是否為抗生素產(chǎn)生菌。
5.磷霉素轉(zhuǎn)化菌株的鑒定上述產(chǎn)生抑菌圈且抑菌圈直徑較大(直徑0.2～2mm)的，可能為磷霉素轉(zhuǎn)化效率較高的菌株，并利用薄層層析進(jìn)一步來(lái)驗(yàn)證發(fā)酵液中是否存在左旋磷霉素。薄層層析方法具體如下展開(kāi)劑為正丁醇、乙酸、水按體積比3∶1∶1混合，將展開(kāi)后的層析板風(fēng)干，置于上述20×30cm的生物鑒定平板上，待浸潤(rùn)后取下，37℃培養(yǎng)16小時(shí)至生物鑒定盤上或平板上產(chǎn)生抑菌圈，含有磷霉素部分產(chǎn)生抑菌圈。由抑菌圈位置計(jì)算相對(duì)遷移率即Rf值(比移值)，定性分析發(fā)酵液中是否存在左旋磷霉素。
實(shí)施例將本實(shí)驗(yàn)室采集的土樣，取1g加至100mL選擇培養(yǎng)基中，30℃搖床振蕩培養(yǎng)2周。將選擇培養(yǎng)基融化后，于直徑為90mm的培養(yǎng)皿中倒入25mL，靜置凝固。將上述土壤懸液系列稀釋到10-3、10-4、10-5，取各稀釋度土壤隱液0.1mL涂布于選擇培養(yǎng)基平板，30℃培養(yǎng)3天。挑取單菌落分別點(diǎn)種于不含碳源的對(duì)照平板和選擇培養(yǎng)基平板，再經(jīng)30℃培養(yǎng)3天，挑取僅在選擇培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)的菌落，接種到肉湯斜面培養(yǎng)基。
將斜面菌種挑取兩環(huán)接入到裝有30mL初篩培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于30℃，180轉(zhuǎn)/分搖床振蕩培養(yǎng)24小時(shí)后，以體積比1％接菌量接種到復(fù)篩培養(yǎng)基中，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)4天。然后，發(fā)酵液12000轉(zhuǎn)/分離心5min，收集上清液。
取搖床培養(yǎng)后收集的上清液20mL，置于50mL燒杯中，在轉(zhuǎn)速400轉(zhuǎn)/分的攪拌器上攪拌10min，然后將得到的發(fā)酵液放到冰箱冷凍室中，冷卻到6℃。將已預(yù)冷卻到6℃的發(fā)酵液放置到已結(jié)冰的乙醇-冰冷卻劑中，于真空度為15Pa、冷凍溫度為-20℃下，冷凍15min，至干燥形成濃縮液，終濃度為原來(lái)的7倍。
將1mL濃縮液加入到內(nèi)徑6mm、外徑8mm、高10mm的消毒牛津杯中，牛津杯置于含有雙層培養(yǎng)基的平板上，下層培養(yǎng)基為生物鑒定培養(yǎng)基I，上層培養(yǎng)基為含有指示菌懸液的生物鑒定培養(yǎng)基II，每個(gè)平板上放6個(gè)牛津杯，且使牛津杯在半徑為2.8cm的圓面上成60度角的間距。30℃培養(yǎng)24小時(shí)，觀察抑菌圈的有無(wú)及抑菌圈直徑的大小。對(duì)照不加冷凍濃縮液，其中有8株具有明顯的抑菌圈。
利用薄層層析分析磷霉素，展開(kāi)劑為正丁醇、乙酸、水按體積比3∶1∶1混合，將展開(kāi)后的層析板風(fēng)干，置于20×30cm的生物鑒定平板上，待浸潤(rùn)后取下，37℃培養(yǎng)16小時(shí)。含有磷霉素的部分產(chǎn)生抑菌圈。比較樣品與磷霉素標(biāo)準(zhǔn)品的Rf，樣品的Rf值為3.52，標(biāo)準(zhǔn)品的Rf值為3.53，驗(yàn)證產(chǎn)生的抗生素為磷霉素。
權(quán)利要求
1.一種磷霉素產(chǎn)生菌株的篩選方法，其特征是首先，對(duì)搖床培養(yǎng)后的菌株發(fā)酵液進(jìn)行冷凍濃縮；然后，利用牛津杯在生物鑒定盤或平板上鑒定發(fā)酵液對(duì)敏感菌的抗性，以初步確定是否為抗生素產(chǎn)生菌；所述冷凍濃縮的步驟如下(1)冷卻劑的制備冷卻劑采用體積濃度4～10％的乙醇，將乙醇在-30℃～-10℃的冰箱里預(yù)冷30min～1小時(shí)，得到已結(jié)冰的乙醇-冰冷卻劑；(2)發(fā)酵液的預(yù)處理將發(fā)酵液放到冰箱冷凍室中，冷卻到0～10℃；(3)冷凍濃縮將已預(yù)冷卻到0～10℃的發(fā)酵液放置到乙醇-冰冷卻劑中，于真空度為10～20Pa、冷凍溫度為-30℃～-10℃下，冷凍15min～2小時(shí)，至干燥形成濃縮液為止。
2.按照權(quán)利要求1所述的磷霉素產(chǎn)生菌株的篩選方法，其特征是在生物鑒定盤或平板的培養(yǎng)表面放置牛津杯，使牛津杯與培養(yǎng)基接觸無(wú)空隙，向牛津杯中加入濃縮液，置28～37℃培養(yǎng)20～36小時(shí)，觀察抑菌圈的有無(wú)及抑菌圈直徑的大??；從而，在生物鑒定盤或平板上鑒定發(fā)酵液對(duì)敏感菌的抗性，以初步確定是否為抗生素產(chǎn)生菌。
3.按照權(quán)利要求1所述的磷霉素產(chǎn)生菌株的篩選方法，其特征是采用右旋磷霉素為底物培養(yǎng)待測(cè)菌株，利用大腸桿菌為生物鑒定的指示菌。
4.按照權(quán)利要求1所述的磷霉素產(chǎn)生菌株的篩選方法，其特征是在初步確定是否為抗生素產(chǎn)生菌之后，再利用薄層層析進(jìn)一步來(lái)驗(yàn)證發(fā)酵液中是否存在磷霉素。
5.按照權(quán)利要求4所述的磷霉素產(chǎn)生菌株的篩選方法，其特征是利用薄層層析分析磷霉素，展開(kāi)劑組分為正丁醇、乙酸、水，按體積比3∶1∶1混合，將展開(kāi)后的層析板風(fēng)干，置于生物鑒定盤或平板上，待浸潤(rùn)后取下，28～37℃培養(yǎng)16～24小時(shí)至生物鑒定盤或平板上產(chǎn)生抑菌圈；比較樣品與磷霉素標(biāo)準(zhǔn)品的Rf值，驗(yàn)證產(chǎn)生的抗生素是否為磷霉素。
6.按照權(quán)利要求1所述的磷霉素產(chǎn)生菌株的篩選方法，其特征是所述的乙醇-冰冷卻劑中，冰為碎冰，冰粒直徑1mm～5mm。
7.按照權(quán)利要求1所述的磷霉素產(chǎn)生菌株的篩選方法，其特征是所述培養(yǎng)后的菌株發(fā)酵液，經(jīng)過(guò)離心收集上清液，將上清液置于攪拌器上攪拌均勻后，再對(duì)其進(jìn)行冷凍濃縮。
8.按照權(quán)利要求1所述的磷霉素產(chǎn)生菌株的篩選方法，其特征是冷凍濃縮后的濃縮液濃度為原來(lái)的2～10倍。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體為一種磷霉素產(chǎn)生菌株的篩選方法，將磷霉素生物轉(zhuǎn)化菌株發(fā)酵液冷凍濃縮的方法應(yīng)用于篩選過(guò)程中，冷凍濃縮是將預(yù)冷卻到0～10℃的菌株發(fā)酵液放置到－30℃～－10℃的乙醇－冰冷卻劑中，于真空度為10～20Pa、冷凍溫度為－30℃～－10℃下，冷凍15min～2小時(shí)，至干燥形成濃縮液。本發(fā)明以右旋磷霉素為底物培養(yǎng)待鑒定菌株，以大腸桿菌作為生物鑒定的指示菌，在把發(fā)酵液進(jìn)行冷凍濃縮后，利用牛津杯在生物鑒定盤(或平板)上鑒定發(fā)酵液可否產(chǎn)生抑菌圈，從而達(dá)到篩選磷霉素生物轉(zhuǎn)化菌株的目的。本發(fā)明具有不使抗生素失活、操作簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于增加單位體積發(fā)酵液中磷霉素的濃度和提高磷霉素轉(zhuǎn)化菌株的鑒定靈敏度和效率非常適用。
文檔編號(hào)G01N30/00GK1974786SQ20061013474
公開(kāi)日2007年6月6日 申請(qǐng)日期2006年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月13日
發(fā)明者周麗沙, 徐慧, 李佰廣, 張穎, 李慧, 任瑞霞, 張忠澤 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所