專利名稱：一種α-淀粉酶抑制劑產(chǎn)生菌的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到一種a -淀粉酶抑制劑產(chǎn)生菌的篩選方法。
背景技術(shù)：
糖尿病是一種重大多發(fā)性疾病，在世界范圍內(nèi)普遍存在。由于生活方式的巨大轉(zhuǎn)變以及人們保健意識(shí)的不足，目前我國糖尿病患者已達(dá)9240萬人，其中男性5020萬人，女性4220萬人，超過印度，成為世界糖尿病患者最多的國家，發(fā)病率(9. 7%)僅次于美國(11%)，其中II型糖尿病患者占93. 7%。目前常用的治療II型糖尿病藥物有增加胰島素 敏感性的雙胍類一甲福明；促胰島素分泌的磺酰脲類一格列齊特(Gliclazide，商品名唐并康);a -糖苷酶抑制劑一阿卡波糖、米格列醇(Miglitol，商品名奧恬蘋)、伏格列波糖(Voglibose，商品名倍欣)。其中由于a-糖苷酶抑制劑具有作用溫和持久、毒副作用小甚至無毒的優(yōu)點(diǎn)，得到越來越多國內(nèi)外研究者的青睞。在中國，人們膳食結(jié)構(gòu)中以谷類為主，碳水化合物含量高，餐后血糖水平易升高，而糖苷酶抑制劑可以很好的緩解II型糖尿病患者的癥狀。因此，糖尿病患者對(duì)糖苷酶抑制劑類治療藥物有著巨大的需求。a-淀粉酶抑制劑作為這一類物質(zhì)的代表，備受關(guān)注。a -淀粉酶(a-amylase)為1，4_ a-D-匍聚糖水解酶,能夠水解淀粉、糖原以及相關(guān)多糖為寡糖片段。在消化、吸收過程中，食物中的碳水化合物先經(jīng)唾液a-淀粉酶、胰a -淀粉酶作用分解為寡糖，然后在小腸中經(jīng)a -葡萄糖苷酶分解為單糖，最后被小腸上皮細(xì)胞吸收進(jìn)入血液循環(huán)。a -淀粉酶抑制劑作為一種糖苷水解酶抑制劑，能有效抑制唾液a -淀粉酶和胰a -淀粉酶的活性，阻礙食物中碳水化合物的水解和消化，減少葡萄糖的產(chǎn)生和攝取，降低血糖和血脂含量水平。在臨床上淀粉酶抑制劑可有效預(yù)防與治療糖尿病和高脂血癥。既可單獨(dú)使用，也可以與其他降糖藥或降血脂藥聯(lián)合使用。臨床醫(yī)學(xué)上用于防治糖尿病、高血糖、高脂血等癥，如阿卡波糖已成為糖尿病治療的首選藥物。根據(jù)文獻(xiàn)和專利報(bào)道，a -淀粉酶抑制劑的篩選是以淀粉酶活性抑制為基礎(chǔ)，測(cè)定方法主要包括碘比色法(US3876766)和3，5-二硝基水楊酸(DNS)法(Bernfeld法)。其中碘顯色法屬半定量方法，靈敏度低。3，5-二硝基水楊酸法篩選a-淀粉酶抑制劑基于以下原理淀粉在胰a -淀粉酶作用下水解產(chǎn)生的還原基團(tuán)，將3，5- 二硝基水楊酸與還原為硝基氨基水楊酸，從而產(chǎn)生顏色變化。通過在波長(zhǎng)546nm處測(cè)定吸光度(Abs546)可以判斷上述反應(yīng)的進(jìn)行。由于a-淀粉酶抑制劑對(duì)淀粉水解有抑制作用，可使Abs546值下降，從而可以計(jì)算待測(cè)物對(duì)淀粉酶活性的抑制率。測(cè)定時(shí)，一般通過調(diào)整待測(cè)溶液及a-淀粉酶溶液的濃度或用量，使Abs546的值在0.4 0.7范圍內(nèi)為宜。但該反應(yīng)中可溶性淀粉與a -淀粉酶對(duì)測(cè)定系統(tǒng)本底Abs546值的影響接近0. 2，對(duì)測(cè)定區(qū)間0. 4-0. 7而言本底影響較大，而且難以測(cè)定抑制劑濃度與酶活的關(guān)系。同時(shí)該反應(yīng)顯色需經(jīng)沸水浴，無法實(shí)現(xiàn)在96孔板上進(jìn)行，不能利用酶標(biāo)儀等進(jìn)行高通量篩選。目前，還沒有高效、靈敏、快速的微生物源a-淀粉酶抑制劑篩選方法報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種快速、靈敏的a -淀粉酶抑制劑篩方法。為達(dá)到發(fā)明目的本發(fā)明采用以下技術(shù)方案a -淀粉酶抑制劑產(chǎn)生菌，即游動(dòng)放線菌Actinoplanes sp. ZJB-08196,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國武漢，武漢大學(xué)，保藏編號(hào)CCTCC NO :M209022，保藏日期2009年2月16日，所述a -淀粉酶抑制劑為阿卡波糖。本發(fā)明所述的a -淀粉酶抑制劑產(chǎn)生菌的篩選方法，其特征在于所述方法為
(I)待篩選菌株接種到平皿培養(yǎng)基上，2(T37°C (優(yōu)選28°C)培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落，挑選單菌落，接種至斜面培養(yǎng)基上，2(T37°C (優(yōu)選28°C)培養(yǎng)直到菌落長(zhǎng)成；所述平皿培養(yǎng)基或斜面培養(yǎng)基的組成為蔗糖5-30g/L，蛋白胨l_5g/L，酪氨酸0. 5-2g/L，K2HPO4 3H200. 5-2g/L, KCl 0. 5-2g/L, MgSO4 7H20 0. 5_2g/L，F(xiàn)eSO4 7H20 0. 1-lg/L，瓊脂 15_20g/L，溶劑為水，初始pH6. 0-7. 5 ；(2)挑選步驟(I)得到的菌落接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25 37°C (優(yōu)選280C )，搖床轉(zhuǎn)速15(T200rpm，培養(yǎng)I 7天，收集得到發(fā)酵液，取發(fā)酵液于400(Tl2000rpm離心，取上清液備用。所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為麥芽糖10-120g/L，葡萄糖10-50g/L，黃豆餅粉5-25g/L，碳酸鈣2-10g/L，甘油2-10g/L，谷氨酸鈉2-lOg/L，溶劑為水，初始pH6. 0-7. 5 ；(3)將步驟(2)獲得的上清液用水稀釋10-100倍，即為待測(cè)樣品，在96板孔內(nèi)分別加入唾液淀粉酶30 iil，所述唾液淀粉酶的濃度為0. lU/ml,每分鐘生成I微摩爾產(chǎn)物CNP所需要的酶量定義為1U，5mmol/12-氯-4-硝基苯-a -半乳糖-麥芽糖苷(Gal_G2_ a -CNP)40 yl，磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液90 ill (50mmol/l, pH6. 0)，40 待測(cè)樣品。對(duì)照組為所述唾液淀粉酶30 iil，所述唾液淀粉酶的濃度為0. lU/ml,5mmol 1^2-氯-4-硝基苯-a-半乳糖-麥芽糖苷40 yl，磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液130 u I (50mmol/l,pH6.0),用酶標(biāo)儀于405nm處檢測(cè)Abs4tl5,每5秒鐘讀一次數(shù)，直至Abs4tl5不再增加，通常需要讀數(shù)5min，將Abs4tl5相對(duì)于對(duì)照組降低30%以上的樣品孔標(biāo)記為陽性菌株，并保存陽性菌株。步驟(3)所得陽性菌株可按照步驟(2)進(jìn)行進(jìn)一步培養(yǎng)，并按照步驟(3)進(jìn)行復(fù)篩、驗(yàn)證。這是本領(lǐng)域人員公知的復(fù)篩驗(yàn)證方法。本發(fā)明方法相對(duì)于高效液相(HPLC)分析方法，可以節(jié)約大量的分析時(shí)間，以及可以節(jié)省HPLC中大量作為流動(dòng)相使用的色譜純有機(jī)試劑，這些試劑一般比較昂貴并且對(duì)人體有害。因此本方法可以直接用于產(chǎn)a-淀粉酶抑制劑誘變育種時(shí)高產(chǎn)突變株的篩選，也可以用于篩選土壤中產(chǎn)a-淀粉酶抑制劑的微生物，還可應(yīng)用于其它來源的淀粉酶抑制劑的篩選。本發(fā)明所述平皿培養(yǎng)基或斜面培養(yǎng)基按以下方法制得水中加入瓊脂條，邊加熱邊攪拌，直到完全溶解，然后加入蔗糖，蛋白胨，酪氨酸，K2HPO4 3H20, KCl, MgSO4 7H20，F(xiàn)eSO4 7H20,攪拌至完全溶解，配制得到終濃度為蔗糖5-30g/l，蛋白胨l_5g/l，酪氨酸0. 5-2g/l, K2HPO4 0. 5-2g/l, KCl 0. 5_2g/l，MgSO4 7H20 0. 5_2g/l，F(xiàn)eSO4 0. 1-lg/l，瓊脂15-20g/l的培養(yǎng)基，通常按照每支5ml的量倒入體積為20ml的試管中，121°C滅菌20min，擺放斜面，冷卻得到斜面培養(yǎng)基；同時(shí)，將滅過菌的培養(yǎng)基冷卻至60°C左右，在無菌條件下倒入已滅菌的平皿中，冷卻得到平皿培養(yǎng)基。所述平皿培養(yǎng)基或斜面培養(yǎng)基的組成優(yōu)選為蔗糖25 30g/l，蛋白胨2g/l，酪氨酸 lg/1, K2HPO4 3H20 0. 5 lg/1，KCl 0. 5g/l, MgSO4 7H20 0. 5g/l, FeSO4 7H20 0. lg/1,瓊脂20g/l，溶劑為水，初始pH7. 0。所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成優(yōu)選為麥芽糖40_80g/L，葡萄糖20_40g/L，黃豆餅粉10-15g/L，碳酸鈣5g/L，甘油5g/L，谷氨酸鈉5g/L，溶劑為水，初始pH7. O。更進(jìn)一步，本發(fā)明所述的a -淀粉酶抑制劑產(chǎn)生菌的篩選方法按以下步驟進(jìn)行(I)將待篩選菌株接種到平皿培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落，挑選單菌落，接種至斜面培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)直到菌落長(zhǎng)成；所述平皿培養(yǎng)基或斜面培養(yǎng)基的組成為蔗糖 25 30g/l，蛋白胨 2g/l，酪氨酸 lg/1，K2HPO4 3H20 0. 5 lg/1，KCl 0. 5g/l，MgSO4 7H200. 5g/l，F(xiàn)eSO4 7H20 0. lg/1，瓊脂 20g/l，溶劑為水，初始 pH7. 0 ； (2)挑選步驟(I)得到的菌落接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28°C，搖床轉(zhuǎn)速15(T200rpm，培養(yǎng)7天，得到發(fā)酵液，取發(fā)酵液于10000 12000rpm離心，取上清液備用；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為麥芽糖40-80g/L，葡萄糖20-40g/L，黃豆餅粉10_15g/L，碳酸鈣5g/L，甘油5g/L，谷氨酸鈉5g/L，溶劑為水，初始pH7. 0 ；(3)將步驟(2)獲得的上清液用水稀釋25-100倍，即為待測(cè)樣品，在96板孔內(nèi)分別加入唾液淀粉酶30 u 1，所述唾液淀粉酶的濃度為0. lU/ml,每I分鐘生成I微摩爾產(chǎn)物CNP所需要的酶量定義為lU，5mmol/l的2-氯-4-硝基苯-a -半乳糖-麥芽糖苷40 yl，pH6. 0、50mmol/l磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液90 iU，40 待測(cè)樣品；對(duì)照組為所述唾液淀粉酶30 iil，所述唾液淀粉酶的濃度為0. lU/ml, 5mmol/12-氯-4-硝基苯-a -半乳糖-麥芽糖苷40 ii I, pH6. 0>50mmol/l磷酸氫二鈉-朽1檬酸緩沖液130 U I,用酶標(biāo)儀于405nm處檢測(cè)Abs4tl5,每5秒讀一次數(shù)，直至Abs4tl5不再增加，將Abs4tl5相對(duì)于對(duì)照組降低30%以上的樣品孔標(biāo)記為陽性菌株，并保存陽性菌株。本發(fā)明以上步驟中所用的唾液淀粉酶購自美國Lee BioSolutions公司。a-淀粉酶的濃度為0. lU/ml，其中，每I分鐘生成I微摩爾產(chǎn)物CNP所需要的酶量定義為IU。本發(fā)明所用的底物2-氯-4-硝基苯-a -半乳糖-麥芽糖苷(Gal_G2_ a -CNP)，購自日本T0Y0B0公司，使用時(shí)用水配成5mmol/l標(biāo)準(zhǔn)液,避光,冷藏。由于本底物見光易分解，故保存在棕色瓶中，最多存放兩周。若405nm處吸光值大于0. 05則需重新配制。所用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液按照常用方法配制，濃度50mM，pH 6. O。之所以選pH 6. 0是由于經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在該條件下，酶表現(xiàn)出最大活力，并且發(fā)現(xiàn)該酶表現(xiàn)出良好的酸堿耐受(PH4. 0-8. 0)和溫度耐受。本發(fā)明的原理為底物2-氯-4-硝基苯-a -半乳糖-麥芽糖苷(Gal_G2_ a -CNP)在a -淀粉酶的作用下會(huì)生成2-氯-4-硝基苯酚(CNP)，該產(chǎn)物在405nm處有特征吸收峰，其濃度可以通過酶標(biāo)儀在405nm處測(cè)定得到。如果待篩選的樣品中有a -淀粉酶抑制劑存在，可以相應(yīng)的抑制a -淀粉酶的活力，水解反應(yīng)被抑制，導(dǎo)致生成的CNP產(chǎn)量降低，通過與對(duì)照組對(duì)比，可以確定樣品中是否存在a-淀粉酶抑制劑，以及其含量的相對(duì)高低。正是基于本原理，發(fā)明了此快速、高通量的篩選方法。實(shí)踐表明，該模型在篩選a-淀粉酶抑制劑產(chǎn)生菌的試驗(yàn)中效果良好。通過這個(gè)模型，篩選得到了產(chǎn)a-淀粉酶抑制劑的菌株。本發(fā)明的有益效果為操作簡(jiǎn)單、快速，結(jié)果可靠，可同時(shí)篩選大量樣品，包括微生物發(fā)酵液、以及其它來源的淀粉酶抑制劑，實(shí)現(xiàn)高通量篩選，減少勞動(dòng)量。反應(yīng)式如下式所示
權(quán)利要求
1.一種a-淀粉酶抑制劑產(chǎn)生菌的篩選方法，其特征在于所述方法為 (1)將待篩選菌株接種到平皿培養(yǎng)基上，20-37°C培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落，挑選單菌落，接種至斜面培養(yǎng)基上，20-37°C 培養(yǎng)直到菌落長(zhǎng)成；所述平皿培養(yǎng)基或斜面培養(yǎng)基的組成為蔗糖 5-30g/l，蛋白胨 l_5g/l，酪氨酸 0. 5-2g/l，K2HPO4. 3H20 0. 5_2g/l，KCl 0. 5_2g/l，MgSO4.7H20 0. 5-2g/l，F(xiàn)eSO4. 7H20 0. 1-lg/l，瓊脂 15_20g/l，溶劑為水，初始 pH 6. 0-7. 5 ； (2)挑選步驟(I)得到的菌落接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25-37°C，搖床轉(zhuǎn)速150-200rpm,培養(yǎng)I 7天，得到發(fā)酵液，取發(fā)酵液于4000-12000rpm離心，取上清液備用；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為麥芽糖10-120g/l，葡萄糖10-50g/l，黃豆餅粉5-25g/l，碳酸鈣2-10g/l，甘油2-10g/l，谷氨酸鈉2-10g/l，溶劑為水，初始pH6. 0-7. 5 ； (3)將步驟(2)獲得的上清液用水稀釋10-100倍，即為待測(cè)樣品，在96板孔內(nèi)分別加入唾液淀粉酶30gl，所述唾液淀粉酶的濃度為0. lU/ml，每I分鐘生成I微摩爾產(chǎn)物CNP所需要的酶量定義為lU，5mmol/l的2-氯-4-硝基苯-a -半乳糖-麥芽糖苷40gl，pH6. O、50mmol L—1磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液90 iU，40 待測(cè)樣品；對(duì)照組為所述唾液淀粉酶30 ii 1，所述唾液淀粉酶的濃度為0. lU/ml,5mmol/12-氯-4-硝基苯-a -半乳糖-麥芽糖苷40 ii I, pH6. 0>50mmol L 1磷酸氫二鈉-朽1檬酸緩沖液130 U I,用酶標(biāo)儀于405nm處檢測(cè)Abs4tl5,每5秒讀一次數(shù)，直至Abs4tl5不再增加，將Abs4tl5相對(duì)于對(duì)照組降低30%以上的樣品孔標(biāo)記為陽性菌株，并保存陽性菌株。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述平皿培養(yǎng)基或斜面培養(yǎng)基按以下方法制得水中加入瓊脂條，邊加熱邊攪拌，直到完全溶解，然后加入蔗糖，蛋白胨，酪氨酸，K2HPO4 3H20, KCl, MgSO4 7H20, FeSO4 7H20,并攪拌至完全溶解，配制得到終濃度為蔗糖 5-30g/l,蛋白胨 l_5g/l，酪氨酸 0. 5-2g/l，K2HPO4 3H20 0. 5_2g/l，KCl 0. 5_2g/l，MgSO4 7H20 0. 5-2g/l，F(xiàn)eSO4AH2O 0. 1-lg/l,瓊脂 15_20g/l 的溶液，調(diào)節(jié) pH 6. 0-7. 5，121°C滅菌20min，冷卻到60°C，在無菌條件下，倒入無菌的試管中，擺放斜面，冷卻得到斜面培養(yǎng)基；在無菌條件下倒入無菌的平皿中，冷卻得到平皿培養(yǎng)基。
3.如權(quán)利要求I所述的a-淀粉酶抑制劑產(chǎn)生菌的篩選方法，其特征在于所述方法為 (1)將待篩選菌株接種到平皿培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)至長(zhǎng)出單菌落，挑選單菌落，接種至斜面培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)直到菌落長(zhǎng)成；所述平皿培養(yǎng)基或斜面培養(yǎng)基的組成為蔗糖·25 30g/l，蛋白胨 2g/l，酪氨酸 lg/1，K2HPO4 3H20 0. 5-lg/l，KCl 0. 5g/l，MgSO4 7H20·0. 5g/l，F(xiàn)eSO4 7H20 0. lg/1，瓊脂 20g/l，溶劑為水，初始 pH7. 0 ； (2)挑選步驟(I)得到的菌落接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28°C，搖床轉(zhuǎn)速·150 200rpm，培養(yǎng)7天，得到發(fā)酵液，取發(fā)酵液于10000 12000rpm離心，取上清液備用；所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為麥芽糖40-80g/L，葡萄糖20-40g/L，黃豆餅粉10_15g/L，碳酸鈣·5g/L，甘油5g/L，谷氨酸鈉5g/L，溶劑為水，初始pH 7. 0 ； (3)將步驟(2)獲得的上清液用水稀釋25-100倍，即為待測(cè)樣品，在96板孔內(nèi)分別加入唾液淀粉酶30gl，所述唾液淀粉酶的濃度為0. lU/ml，每I分鐘生成I微摩爾產(chǎn)物CNP所需要的酶量定義為1U，5 mmol/1的2-氯-4-硝基苯-a -半乳糖-麥芽糖苷40 yl，pH6. O、·50mmol/l磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液90 iU，40 yl待測(cè)樣品；對(duì)照組為所述唾液淀粉酶·30 u 1，所述唾液淀粉酶的濃度為0. lU/ml, 5mmol/12-氯-4-硝基苯-a -半乳糖-麥芽糖苷40 Ii I, pH6. 0>50mmol/l磷酸氫二鈉-朽1檬酸緩沖液130 U I,用酶標(biāo)儀于405nm處檢測(cè)Abs405,每5秒讀一次數(shù)，直至Abs4tl5不再增加，將Abs4tl5相對(duì)于對(duì)照組降低30%以上的樣品 孔標(biāo)記為陽性菌株，并保存陽性菌株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種α-淀粉酶抑制劑產(chǎn)生菌的篩選方法，所述方法為待篩選菌株依次接種到平皿培養(yǎng)基、斜面培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，收集得到發(fā)酵液，取發(fā)酵液離心，取上清液用水稀釋10-100倍，即為待測(cè)樣品，在96板孔內(nèi)分別加入0.1U/ml的唾液淀粉酶30 μl， 5 mmol/l 的Gal-G2-α-CNP 40 μl，磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液90 μl(50 mmol/l，pH 6.0)，40 μl待測(cè)樣品。對(duì)照組為用等體積的緩沖溶液代替待測(cè)樣品。用酶標(biāo)儀于405 nm處檢測(cè)Abs405，每5秒鐘讀一次數(shù)，直至Abs405不再增加。將Abs405相對(duì)于對(duì)照組降低30%以上的樣品孔標(biāo)記為陽性菌株，并保存陽性菌株。本發(fā)明提供的篩選方法簡(jiǎn)單有效，可以在短時(shí)間內(nèi)篩選大量樣品，靈敏度高，提高了檢測(cè)效率。
文檔編號(hào)C12Q1/40GK102864207SQ20121022428
公開日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2010年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月25日
發(fā)明者鄭裕國, 王遠(yuǎn)山, 馮志華, 薛亞平, 王亞軍, 沈寅初 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)