提高凝結(jié)芽孢桿菌出芽率及l(fā)-乳酸產(chǎn)量的發(fā)酵方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于飼料微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種提高凝結(jié)芽孢桿菌出芽率 及L-乳酸產(chǎn)量的發(fā)酵方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 微生態(tài)制劑是近年來國內(nèi)外迅速崛起的新型益生菌飼料添加劑，具有調(diào)節(jié)腸道功 能、維持腸道菌群平衡、促進(jìn)生長和提高機(jī)體免疫力等作用，且能夠減少服用抗生素帶來的 耐藥性，對畜產(chǎn)品無毒無害，促進(jìn)綠色飼料的最佳解決方案之一，已被廣泛應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖 業(yè)中。乳酸菌和芽孢桿菌目前在動(dòng)物營養(yǎng)中研究及應(yīng)用越來越多，乳酸菌具有抑制有害菌、 維持腸道菌群平衡及可定植等優(yōu)點(diǎn)，但抗逆性差，不耐熱，給菌種的加工、保藏都帶來了一 定的挑戰(zhàn)，芽孢桿菌由于芽孢的生成，具有抗逆性強(qiáng)、耐高溫及易儲存等特點(diǎn)，而產(chǎn)乳酸的 凝結(jié)芽孢桿菌同時(shí)具備兩者的優(yōu)點(diǎn)，具有廣泛的開發(fā)及應(yīng)用價(jià)值。
[0003] 凝結(jié)芽孢桿菌(Baci 1 lus coagulans)又稱乳酸芽孢桿菌，細(xì)胞桿狀，革蘭氏染色 陽性，形成內(nèi)生孢子，兼性厭氧，最適生長溫度40_50°C，同型發(fā)酵產(chǎn)生乳酸。凝結(jié)芽孢桿菌 具有一般乳酸菌維持腸道微生態(tài)平衡，提高免疫及促進(jìn)動(dòng)物消化等作用，還具有耐高溫、耐 酸耐膽鹽等高抗逆性，市場前景十分廣闊。
[0004] 凝結(jié)芽孢桿菌在有氧條件下發(fā)酵產(chǎn)芽孢，發(fā)酵過程中代謝出很少量的L-乳酸;在 厭氧靜止條件下培養(yǎng)凝結(jié)芽孢桿菌能夠產(chǎn)出純度較高L-乳酸。乳酸是一種綠色健康食物， 它能夠降低消化道PH，使腸道處于酸性環(huán)境，抑制病原菌生長，對腸道健康起到積極的作 用，哺乳動(dòng)物和人類只含有L-乳酸脫氫酶，因此只能代謝利用L-乳酸。
[0005] 目前關(guān)于凝結(jié)芽孢桿菌的培養(yǎng)發(fā)酵研究主要集中在提高生物量、出芽率及發(fā)酵方 法等的研究，但是在相同條件下獲得有更高含量L-乳酸的發(fā)酵產(chǎn)物同樣具有重要的現(xiàn)實(shí)意 義，現(xiàn)有技術(shù)中幾乎沒有相關(guān)研究報(bào)道。本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題為通過調(diào)整培養(yǎng)基成 分及發(fā)酵方法，在獲得高生物量的凝結(jié)芽孢桿菌的同時(shí)，得到更多的L-乳酸，增強(qiáng)益生菌的 應(yīng)用效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種提高凝結(jié)芽孢桿菌出芽率及L-乳酸產(chǎn)量的發(fā)酵方法。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供采用上述方法制備的飼用活菌制劑。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種提高凝結(jié)芽孢桿菌出芽率及L-乳酸產(chǎn)量的發(fā) 酵方法，其是通過向培養(yǎng)至對數(shù)期的發(fā)酵液中添加益生元的方式實(shí)現(xiàn)凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵。
[0009] 本發(fā)明涉及的益生元包括葡萄糖、低聚木糖、低聚異麥芽糖和低聚果糖，各種益生 元的添加量為葡萄糖5-8%、低聚木糖0.5-1 %、低聚異麥芽糖0.5-1 %、低聚果糖0.5-1 %。
[0010] 凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵時(shí)所用發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：豆柏粉1-5%、麩皮1-3%、酵母粉 0.5-2%、糖蜜2-5%、MgS〇4 · 7H2〇 0·卜0.2%、MnS〇4 · H2O 0.01-0.05%、Ca⑶30.2-0.4%、 K2HPO4O · 2-0 · 4%。優(yōu)選地，發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:豆柏粉1 %、麩皮1 · 5%、酵母粉0 · 5%、糖蜜 3%、MgS〇4*7H20 0.1%、MnS〇4*H20 0.01%、CaC030.4%、K2HP〇4〇.2%。
[0011] 本發(fā)明中涉及到的百分號"，若未特別說明，是指質(zhì)量百分比；但溶液的百分 比，除另有規(guī)定外，是指100mL溶液中含有溶質(zhì)的克數(shù)。
[0012] 前述的方法，包括以下步驟：
[0013] 1)菌種活化；
[0014] 2)將活化菌種接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)；
[0015] 3)待菌種生長至對數(shù)期，添加益生元，繼續(xù)發(fā)酵12-30小時(shí)。
[0016]其中，步驟1)進(jìn)行三級種子活化培養(yǎng)，活化培養(yǎng)基組成為：蛋白胨1 %、酵母粉 0 · 5 %、葡萄糖0 · 6 %、Κ2ΗΡ〇4〇 · 1 % ;活化培養(yǎng)條件為:40-50°C、pH值7 · 0，180-220rpm搖床培 養(yǎng)24h;三級種子活化培養(yǎng)的接種量均為5v/v%。
[0017]步驟2)具體為：將活化菌種按10v/v%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，40-50°C 180-220rpm發(fā)酵培養(yǎng)36-48小時(shí)。
[0018] 步驟3)具體為:待菌種發(fā)酵至18-24小時(shí)，添加益生元，繼續(xù)在40-50°C180-220rpm 的條件下培養(yǎng)至發(fā)酵結(jié)束。細(xì)菌生長到對數(shù)期時(shí)，菌含量幾乎達(dá)到最高，活力最大，對外界 的影響因素也最敏感，此時(shí)添加益生元可促進(jìn)L乳酸的產(chǎn)生。
[0019] 優(yōu)選地，前述方法包括以下步驟：
[0020] 1)進(jìn)行三級種子活化培養(yǎng)，活化培養(yǎng)基組成為:蛋白胨1%、酵母粉0.5%、葡萄糖 0.6%、K2HP〇4〇. 1 % ;活化培養(yǎng)條件為:43°C、pH值7.0，200rpm搖床培養(yǎng)24h;三級種子活化培 養(yǎng)的接種量均為5v/v% ;
[0021] 2)將活化菌種按ΙΟv/v%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，50°C200rpm發(fā)酵培養(yǎng)36-48小時(shí)；
[0022] 3)待菌種發(fā)酵至18-20小時(shí)，添加益生元，繼續(xù)在50°C200rpm的條件下發(fā)酵至36小 時(shí)。
[0023] 本發(fā)明還提供按照上述方法制備獲得的飼用活菌制劑。所述飼用活菌制劑中凝結(jié) 芽孢桿菌的活菌數(shù)在4.8\109(^11/1^以上，芽孢率在90%以上，且乳酸含量不低于30.5 8/ L〇
[0024] 本發(fā)明提供的發(fā)酵方法其最顯著的優(yōu)點(diǎn)是通過調(diào)整培養(yǎng)基成分及添加方式，實(shí)現(xiàn) 凝結(jié)芽孢桿菌的良好生長，提高凝結(jié)芽孢桿菌出芽率并且顯著的提高了 L-乳酸含量，提高 了產(chǎn)品的質(zhì)量和穩(wěn)定性，同時(shí)在培養(yǎng)基中添加了益生元成分，使用該培養(yǎng)基培養(yǎng)的凝結(jié)芽 孢桿菌制劑可增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫力。使用本發(fā)明方法制備獲得的飼用活菌制劑，凝結(jié)芽孢 桿菌的活菌數(shù)可達(dá)到4.8 X 109cfu/mL以上，芽孢率達(dá)90 %以上，乳酸含量不低于30.5g/L， 出芽率提高了 1 〇 %左右，乳酸含量提高了 2倍以上。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例 中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0026] 實(shí)施例1提高凝結(jié)芽孢桿菌出芽率及L-乳酸產(chǎn)量的發(fā)酵方法
[0027] (1)以凝結(jié)芽孢桿菌為發(fā)酵菌種，經(jīng)三級種子活化后接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
[0028] (2)活化培養(yǎng)基的組分包括:蛋白胨1 %、酵母粉0.5%、葡萄糖0.6%、磷酸氫二鉀 0·1%〇
[0029] (3)活化培養(yǎng)條件均為：搖床培養(yǎng)、ΡΗ值7.0、溫度為43°C、培養(yǎng)時(shí)間24h。三級種子 活化培養(yǎng)的接種量均為5v/v%。
[0030] (4)將活化好的凝結(jié)芽孢桿菌以ΙΟv/v%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，發(fā)酵 體積為300L。
[0031] (5)發(fā)酵培養(yǎng)基的組分包括:豆柏粉1%、麩皮3%、酵母粉0.5%、糖蜜5%、MgS04 · 7H20 0.1%、MnS〇4*H20 0.05%、CaC030.2%、K2HP〇4〇.4%。
[0032] (6)在菌種培養(yǎng)至對數(shù)生長期，即在菌種培養(yǎng)至18h，在上述發(fā)酵培養(yǎng)液添加能促 進(jìn)L-乳酸生成的益生元，所述益生元的添加量為:葡萄糖5%、低聚木糖0.5%、低聚異麥芽 糖0.5%、低聚果糖0.5%。
[0033] (7)在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，攪拌轉(zhuǎn)速設(shè)定為200rpm，培養(yǎng)溫度50°C，發(fā)酵至36h