一株芽孢桿菌及其在高溫發(fā)酵生產乙偶姻和2,3-丁二醇中的應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株芽孢桿菌及其在高溫發(fā)酵生產乙偶姻和2,3?丁二醇中的應用。該菌株為芽孢桿菌Bacillus sp.H15?1CGMCC No.12389，革蘭氏染色呈陽性，產芽孢，細胞形態(tài)為桿狀，可在40–60℃生長，50℃時增殖最快。利用本發(fā)明菌株，以脫胚玉米粉水解液為主要原料，采用機械攪拌通風發(fā)酵罐在50℃發(fā)酵68h可以產生50.8g/L的乙偶姻和32.1g/L的2,3?丁二醇。本發(fā)明提供的高溫發(fā)酵生產乙偶姻和2,3?丁二醇的方法具有原料成本低、發(fā)酵過程抗雜菌污染、節(jié)約冷卻水、操作粗放等優(yōu)點。CGMCC No. 1238920160425
【專利說明】
一株芽孢桿菌及其在高溫發(fā)酵生產乙偶姻和2,3-丁二醇中的應用
技術領域
[0001 ]本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一株芽孢桿菌及其應用。
【背景技術】
[0002]乙偶姻即3-羥基-2-丁酮，在食品、香料、化妝品、手性合成等領域有重要的用途(Xiao and Lu，2014)。2，3-丁二醇在化工合成、食品、燃料、防凍等領域有重要的用途(Jiet al.，2011)。乙偶姻和2，3_丁二醇可由可再生原料發(fā)酵生產，是重要的新興平臺化合物(Xu et al.，2012)。兩者是某些細菌中乙偶姻代謝途徑的產物，可以在細胞內通過2，3_丁二醇脫氫酶的作用相互轉化。乙偶姻和2，3_ 丁二醇在發(fā)酵產物中往往同時存在，但它們兩者沸點相差較大，可以通過蒸餾很容易地相互分離。
[0003]發(fā)酵法生產乙偶姻和2，3_丁二醇具有良好的市場前景，吸引了大量國內外開發(fā)研究人員，取得了一些研究進展。但迄今絕大多數(shù)發(fā)酵法生產乙偶姻和2，3_丁二醇的研究文獻報道都是采用中溫(30-40°C)發(fā)酵法(Xiao and Lu，2014)，為了防止發(fā)酵過程中污染雜菌，培養(yǎng)基要經過高溫蒸汽滅菌，這就必然涉及一系列滅菌設備，操作繁瑣、消耗大量的蒸汽和冷卻水，而且高溫滅菌容易引起大量的糖損失和產生很多影響正常發(fā)酵的有害化學物質。一般發(fā)酵過程是放熱的，所以中間過程也需要消耗冷卻水(Cripps et al.，2009)。雖然發(fā)酵過程中采取各種措施控制污染，但往往仍存在不同程度的倒灌率，有時甚至影響到正常生產運行(Skinner and Leathers, 2004) ο
[0004]研究者通常將溫度為45_65°C的發(fā)酵方法稱為高溫發(fā)酵法，近年來開始受到研究重視(Cripps et al.，2009)。一般情況下環(huán)境中的雜菌在45°C以上就很難生長或被殺死，因此高溫發(fā)酵可以較好地解決污染雜菌問題。較高的發(fā)酵溫度還可以加快反應速率、節(jié)約冷卻水、操作粗放，甚至可以免滅菌(Qin et al.，2009)。因此高溫發(fā)酵較中溫發(fā)酵而言具有獨到的優(yōu)勢，極具開發(fā)潛力。
[0005]迄今國內外高溫發(fā)酵生產乙偶姻和2，3_丁二醇的研究報道非常少，本發(fā)明人所在課題組曾采用一株Geobacillus菌高溫發(fā)酵生產這兩種產物(Xiao et al.,2012)，并獲授權中國發(fā)明專利I項(ZL 201210060900.6)，但該方法的發(fā)酵培養(yǎng)基采用葡萄糖、蛋白胨、酵母粉等原料，成本非常高，不適合低成本、大規(guī)模工業(yè)生產的需要。
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【發(fā)明內容】

[0015]針對上述目前研究和生產現(xiàn)狀的缺點與不足，本發(fā)明提供一株芽孢桿菌及其在高溫發(fā)酵生產乙偶姻和2，3_ 丁二醇中的應用方法。
[0016]本發(fā)明提供的芽孢桿菌Bacillussp.H15_l，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏編號為CGMCCN0.12389，保藏日期為2016年4月25日。
[0017]開發(fā)高溫發(fā)酵生產乙偶姻和2，3_丁二醇技術的關鍵之一就是篩選獲得嗜熱并且高產乙偶姻和2，3_丁二醇的菌株。本發(fā)明提供的菌株芽孢桿菌Bacillus Sp.H15_l革蘭氏染色呈陽性，產芽孢，細胞形態(tài)為桿狀;55°C條件下，采用Luria-Bertani固體培養(yǎng)基培養(yǎng)6小時，可得到直徑大小約為2-3mm、表面有褶皺的灰白色菌落。通過對本發(fā)明菌株的16SrDNA進行測序，并將本發(fā)明菌株的16S rDNA序列和EzTaxon數(shù)據(jù)庫中已收錄的細菌模式菌株的16S rDNA序列進行核苷酸序列同源性比對，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明菌株的16S rDNA序列與已知芽孢桿菌(Bacillus)屬的菌株的16S rDNA序列的同源性大于99%。本發(fā)明菌株的16S rDNA序列已提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中，登錄號為KX094416。本發(fā)明菌株芽孢桿菌Bacillus sp.H15-1可在40-60°C范圍內生長，50°C時增殖最快，表明此菌株為嗜熱菌株。
[0018]本發(fā)明提供的利用芽孢桿菌Bacillussp.H15_l高溫發(fā)酵生產乙偶姻和2，3_丁二醇的應用方法，其涉及的實施步驟如下:
[0019]第一步:活化菌株:將本發(fā)明提供的菌株芽孢桿菌Bacillussp.H15-1劃線接種到Lur ia-Bertani固體培養(yǎng)基上，置于55°C的恒溫箱中培養(yǎng)6h以上，至菌落生長豐滿。
[0020]所述Luria-Bertani固體培養(yǎng)基每升中含有:1g蛋白胨，5g酵母粉，1g氯化鈉，17g瓊脂粉。調培養(yǎng)基pH至7.0。
[0021]第二步:制備液體種子:用接種環(huán)挑取上述步驟獲得的菌落，接種到Luria-Bertani液體培養(yǎng)基中，50°C搖床培養(yǎng)10h。采用體積為250mL的擋板搖瓶，每個擋板搖瓶的裝液量為50mL;采用回旋式搖床，轉速設定在150rpm。
[0022]所述Luria-Bertani液體培養(yǎng)基每升中含有:1g蛋白胨，5g酵母粉，1g氯化鈉。調培養(yǎng)基pH至7.0。
[0023]第三步:發(fā)酵生產乙偶姻和2，3-丁二醇:將上述步驟獲得的液體種子按5%體積比接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，50°C發(fā)酵培養(yǎng)。用到的反應器為4.2L的機械攪拌通風發(fā)酵罐，發(fā)酵罐內徑為125mm，發(fā)酵罐內裝有2個六直葉攪拌槳。發(fā)酵罐內裝入2L發(fā)酵培養(yǎng)基，攪拌轉速設為600rpm，通風量為0.9vvm，pH在發(fā)酵一開始的48h內控制在6.6-7.1，發(fā)酵進行到48h以后pH控制在7.7-8.0。在發(fā)酵過程中取樣并用氣相色譜檢測產物，監(jiān)測發(fā)酵進程。
[0024]所述發(fā)酵培養(yǎng)基為在脫胚玉米粉水解液中加入1%的玉米漿粉、3g/L的KH2P04、0.3g/L的乙酸鈉、0.2g/L的CaCl2和0.lg/L的MgS〇4。
[0025]所述脫胚玉米粉水解液制備過程為:將80-100目的脫胚玉米粉加入到水中，配制成濃度為30 %的懸液，并按每克干重脫胚玉米粉加入3U的α-淀粉酶，用飽和Na2CO3溶液調節(jié)pH至7.0，加熱至75-80°C，并在75_80°C保持20min;然后降低溫度至65_70°C，再按每克干重脫胚玉米粉加入7U的α-淀粉酶，并在65-70°C保持Ih;然后降低溫度至58-60°C，用鹽酸溶液調節(jié)PH至4.5，再按每克干重脫胚玉米粉加入200U的γ -淀粉酶，并在58_60°C保持Ih。整個脫胚玉米粉水解液制備過程保持快速攪拌，以防止局部過熱。
[0026]所述玉米漿粉為工業(yè)上采用亞硫酸浸泡法制造玉米淀粉時得到的副產物“玉米楽”再經噴霧干燥制得的副產品，為發(fā)酵工業(yè)中常用的一種培養(yǎng)基原料。
[0027]利用本發(fā)明所述芽孢桿菌Bacillussp.H15_l，采用上述廉價的發(fā)酵培養(yǎng)基和生產方法，50°C發(fā)酵68h可以產生50.8g/L的乙偶姻和32.lg/L的2，3-丁二醇，高于多數(shù)文獻報道，極具實際應用潛力。
【附圖說明】
[0028]附圖是芽孢桿菌Bacillus sp.H15_lCGMCC N0.12389生產乙偶姻和2，3-丁二醇的過程曲線。
【具體實施方式】
[0029]實施例1:菌株富集篩選與分離純化
[0030]1.1環(huán)境樣品采集
[0031]從山東省青島市膠州灣海灘、唐島灣公園等地方采集樣品。
[0032]1.2菌株初篩
[0033]將上述樣品分別加入到無菌水中，快速攪拌并自然沉降lOmin，然后取上清液適當稀釋后涂布到Lur ia-Bertani固體培養(yǎng)基上，在60°C培養(yǎng)24h。挑取單菌落，經多次劃線分離純化得到多個純的菌株。
[0034]1.3菌株復篩
[0035]將上述實驗得到的純的菌株，分別接種到復篩培養(yǎng)基中，在55°C搖瓶培養(yǎng)24h后，用氣相色譜檢測產物。所述復篩培養(yǎng)基每升中含有:1g蛋白胨，5g酵母粉，1g氯化鈉，40g葡萄糖。調培養(yǎng)基pH至7.0。
[0036]經過復篩，發(fā)現(xiàn)來源于膠州灣海灘上一段生銹的鋼絲繩樣品的I株細菌乙偶姻和2，3_丁二醇產量較高，將此菌株命名為H15-1，即為本發(fā)明菌株。將得到的目的菌株采用斜面?zhèn)鞔?、低溫甘油法、低溫真空干燥法等常?guī)方法保存?zhèn)溆谩?br>[0037]實施例2:菌株鑒定與保藏
[0038]將實施例1得到的菌株H15-1進行檢驗，其革蘭氏染色呈陽性，產芽孢，細胞形態(tài)為桿狀;55°C條件下，采用Luria-Bertani固體培養(yǎng)基培養(yǎng)6小時，可得到直徑大小約為2_3mm、表面有褶皺的灰白色菌落。本發(fā)明菌株H15-1可在40-60°C范圍內生長，50°C時增殖最快，表明此菌株為嗜熱菌株。
[0039]通過對本發(fā)明菌株的16S rDNA進行測序，并將本發(fā)明菌株的16S rDNA序列和EzTaxon數(shù)據(jù)庫中已收錄的細菌模式菌株的16S rDNA序列進行核苷酸序列同源性比對，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明菌株的16S rDNA序列與已知芽孢桿菌(Bacillus)屬的菌株的16S rDNA序列的同源性大于99 %，因此將該菌株鑒定為芽孢桿菌(Baci I Ius)屬。
[0040]2016年4月25日將本發(fā)明菌株芽孢桿菌Bacillus sp.H15-1保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.12389。
[0041 ] 實施例3:利用芽孢桿菌Bacillus sp.H15_l高溫發(fā)酵生產乙偶姻和2，3_丁二醇的應用方法
[0042]具體實施步驟如下:
[0043]3.1活化菌株
[0044]將本發(fā)明提供的菌株芽孢桿菌Baci I Ius sp.Hl5_1劃線接種到Luria-Bertani固體培養(yǎng)基上，置于55°C的恒溫箱中培養(yǎng)6h以上，至菌落生長豐滿。
[0(Μ5] 所述Luria-Bertani固體培養(yǎng)基每升中含有:1g蛋白胨，5g酵母粉，1g氯化鈉，17g瓊脂粉。調培養(yǎng)基pH至7.0。
[0046]3.2制備液體種子
[0047]用接種環(huán)挑取上述步驟獲得的菌落，接種到Luria-Bertani液體培養(yǎng)基中，50°C搖床培養(yǎng)10h。采用體積為250mL的擋板搖瓶，裝液量為50mL;采用回旋式搖床，轉速設定在150rpmo
[0048]所述Luria-Bertani液體培養(yǎng)基每升中含有:1g蛋白胨，5g酵母粉，1g氯化鈉。調培養(yǎng)基pH至7.0。
[0049]3.3發(fā)酵生產乙偶姻和2，3-丁二醇
[0050]將上述步驟獲得的液體種子按5%體積比接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，50°C發(fā)酵培養(yǎng)。用到的反應器為4.2L的機械攪拌通風發(fā)酵罐，發(fā)酵罐內徑為125mm，發(fā)酵罐內裝有2個六直葉攪拌槳。發(fā)酵罐內裝入2L發(fā)酵培養(yǎng)基，攪拌轉速設為600rpm，通風量為0.9vvm，pH在發(fā)酵一開始的48h內控制在6.6-7.1，發(fā)酵進行到48h以后時pH控制在7.7-8.0。在發(fā)酵過程中取樣并用氣相色譜檢測產物，在68h可以檢測到樣品中含有50.8g/L的乙偶姻和32.lg/L的2，3-丁二醇，此時即可以停止發(fā)酵，收獲產物。
[0051 ]所述發(fā)酵培養(yǎng)基為在脫胚玉米粉水解液中加入1%的玉米漿粉、3g/L的KH2P04、0.3g/L的乙酸鈉、0.2g/L的CaCl2和0.lg/L的MgSO4。
[0052]所述脫胚玉米粉水解液制備過程為:將80-100目的脫胚玉米粉加入到水中，配制成濃度為30%的懸液，并按每克干重脫胚玉米粉加入3U的α-淀粉酶，用飽和Na2CO3溶液調節(jié)pH至7.0，加熱至75-80°C，并在75_80°C保持20min;然后降低溫度至65_70°C，再按每克干重脫胚玉米粉加入7U的α-淀粉酶，并在65-70°C保持Ih;然后降低溫度至58-60°C，用鹽酸溶液調節(jié)pH至4.5，再按每克干重脫胚玉米粉加入2001]的丫-淀粉酶，并在58-601保持111。整個脫胚玉米粉水解液制備過程保持快速攪拌，以防止局部過熱。
[0053]所述玉米漿粉為工業(yè)上采用亞硫酸浸泡法制造玉米淀粉時得到的副產物“玉米楽”再經噴霧干燥制得的副產品，為發(fā)酵工業(yè)中常用的一種培養(yǎng)基原料。
【主權項】
1.芽孢桿菌BaciI Ius sp.Hl5_1，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC N0.12389。2.—種利用權利要求1所述的芽孢桿菌Bacillussp.H15_l CGMCC N0.12389在高溫發(fā)酵生產乙偶姻和2，3-丁二醇中的應用。3.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于:利用所述芽孢桿菌BaciIIussp.H15-1CGMCC N0.12389高溫發(fā)酵生產乙偶姻和2，3-丁二醇時的發(fā)酵溫度為50°C。
【文檔編號】C12P7/26GK105820988SQ201610402441
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年6月8日
【發(fā)明人】肖梓軍, 顧如林, 侯孝元, 呂新, 趙靜宜
【申請人】中國石油大學(華東)