專利名稱：一種生產酸性蛋白酶的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物發(fā)酵領域，特別是涉及采用固態(tài)發(fā)酵生產酸性蛋白酶的方法。
背景技術：
酸性蛋白酶是一種在酸性(PH=2. 5 4)條件下催化蛋白質，生成多肽和氨基酸的生物催化劑。適用于酸性條件下水解動物、植物蛋白質，被廣泛用于啤酒、果酒、酒精、飼料、皮革等工業(yè)。
目前，我國主要采用液體深層通風發(fā)酵，經硫酸鈉鹽析提取成工業(yè)級酸性蛋白酶產品。發(fā)酵酶活僅為6000 7000u/ml，酶的發(fā)酵水平低，生產原料品種需要較多，能源消耗高，成品酶的酶活保存率差，失活快。發(fā)明內容
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提出一種生產酸性蛋白酶的方法，以提高酶的發(fā)酵水平和/或成品酶的保存率。
基于上述目的，本發(fā)明提供的生產酸性蛋白酶的方法包括
I)滅菌在曲盤中配置固體培養(yǎng)基；然后用塑料薄膜覆蓋所述曲盤，并用橡膠圈將所述塑料薄膜捆扎于所述曲盤上；將曲盤置于高壓滅菌鍋內，進行滅菌；
2)接種滅菌后冷卻，當曲盤中的固體培養(yǎng)基冷卻至25 35°C時，移開所述塑料薄膜，在無菌條件下接入經過種母搖瓶培養(yǎng)和種子罐擴大培養(yǎng)的液體種母，并與所述固體培養(yǎng)基充分混合均勻；用塑料薄膜將所述曲盤再次覆蓋，并用橡膠圈將所述塑料薄膜捆扎于所述曲盤上；
3)發(fā)酵接種完成后，將所述曲盤放入培養(yǎng)室中進行發(fā)酵；
4)后提取當發(fā)酵酶活達到要求后，即培養(yǎng)時間為110 120小時，發(fā)酵酶活達 45000 50000u/ml，停止發(fā)酵，進入后提取，提取成不同規(guī)格的酶制劑產品。
可選地，在所述發(fā)酵步驟中，培養(yǎng)室的溫度為30±0. 5°C，在培養(yǎng)時間為O 60小時內，培養(yǎng)室內濕度為45 65% ;當菌絲繁殖至布滿整個培養(yǎng)基的表面時，移去所述塑料薄膜，并將曲盤內的物料耙松，同時將培養(yǎng)室的濕度提高至85 90%。
較佳地，耙松所述物料后，在30 60分鐘內將培養(yǎng)室的濕度提高至85 90%。
可選地，在所述后提取步驟中，停止發(fā)酵后，先將發(fā)酵成熟的固體酶放入浸泡罐中，加水浸泡，并開啟攪拌，利用攪拌的剪切作用將浸泡液中的固體酶分散、打碎后進行萃取，得到萃取清液，萃取2 3次；再用離心機將萃取清液進行固液分離，并收集離心液 ’最后將所述離心液分別經板框二次過濾、超濾濃縮、精制過濾、添加穩(wěn)定劑和防腐劑的步驟， 制得液體酸性蛋白酶。
可選地，所述液體酸性蛋白酶通過噴霧或沸騰干燥法制成固體酸性蛋白酶。
可選地，所述培養(yǎng)基中各種成分的重量體積比為碳源I 5%，營養(yǎng)鹽O.1 O. 5%,氮源 O. 15 O. 55%,麩皮 98. 75 95%。
較佳地，所述碳源選自葡萄糖、淀粉糖和麥芽蔗糖中的任意一種。
優(yōu)選地，所述營養(yǎng)鹽選自磷酸二氫鉀、硫酸銨、磷酸氫二鉀、氯化銨、氯化鈣和硫酸鎂中的任意兩種。
可選地，所述塑料薄膜選自聚乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯和聚丙乙烯中的任意一種。
從上面所述可以看出，本發(fā)明提供的生產酸性蛋白酶的方法通過塑料薄膜覆蓋曲盤、用橡膠圈將所述塑料薄膜捆扎于所述曲盤上，在滅菌過程中，能防止培養(yǎng)基中水分的蒸發(fā)、以及營養(yǎng)物質的流失，有利于微生物的繁殖、提高單位酶活力；在滅菌、接種、發(fā)酵等的轉移過程中，使培養(yǎng)基不受外界微生物入浸和感染，給酸性蛋白酶固體發(fā)酵創(chuàng)造了一個良好的發(fā)酵環(huán)境；在發(fā)酵的前期，通過塑料薄膜保持曲盤內的濕度，這期間培養(yǎng)室不需要增加濕度，節(jié)約了能源，降低了生產成本，更重要的是保持培養(yǎng)室空氣干燥和清潔，防止感染雜菌；發(fā)酵前期結束時，菌絲已進入旺盛期繁殖到整個培養(yǎng)料表面并伸展至培養(yǎng)基內，有較好的抗雜菌能力，同時進入產酶高峰期，此時及時去掉覆蓋的塑料薄膜，耙松曲料，提高微生物的吸氧量，促進產酶及酶活力單位的積累，快速完成發(fā)酵，防止雜菌感染，提高產品質量。
具體實施方式

為使本發(fā)明的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚明白，以下結合具體實施例，對本發(fā)明進一步詳細說明。
作為本發(fā)明的一個實施例，所述生產蛋白酶的方法包括以下步驟
I)種母搖瓶培養(yǎng)將菌種接種于約500 IOOOml的液體培養(yǎng)基內，在溫度約 30±1°C、轉速約250 280r/min的條件下培養(yǎng)約24 28小時。
2)種子罐擴大培養(yǎng)將培養(yǎng)成熟的搖瓶種母移接至約500 1000L的種子罐內， 在溫度約30±1°C、轉速約250 280r/min的條件下培養(yǎng)約24 30小時。
3)滅菌在約700X500X50的曲盤中配置固體培養(yǎng)基約800 lOOOg，并將培養(yǎng)基撫平；然后用塑料薄膜覆蓋所述曲盤，并用橡膠圈將所述塑料薄膜捆扎于所述曲盤上； 將曲盤置于高壓滅菌鍋內，在約O. 08 O. 12Mpa、約110 130°C條件下保持滅菌約30 50min,進行滅菌；
4)接種滅菌后冷卻，當曲盤中的固體培養(yǎng)基冷卻至約25 35°C時，移開所述塑料薄膜，在無菌條件下接入上述經過種母搖瓶培養(yǎng)和種子罐擴大培養(yǎng)的液體種母，并與所述固體培養(yǎng)基充分混合均勻；用塑料薄膜將所述曲盤再次覆蓋，并用橡膠圈將所述塑料薄膜捆扎于所述曲盤上；
5)發(fā)酵接種完成后，將所述曲盤放入約30±0. 5°C的培養(yǎng)室中進行發(fā)酵；在發(fā)酵的前期(即O 60小時)，培養(yǎng)室不加濕，通過塑料薄膜保持曲盤內的濕度，供微生物繁殖；發(fā)酵前期結束時，菌絲已進入旺盛期，當菌絲繁殖至布滿整個培養(yǎng)基的表面并伸展至培養(yǎng)基內時，有較好的抗雜菌能力，同時進入產酶高峰期，此時及時移去所述塑料薄膜，并將曲盤內的物料耙松，提高微生物的吸氧量，促進產酶及酶活力單位的積累，快速完成發(fā)酵， 防止被雜菌感染，提高產品質量；同時，在約30 60分鐘內將培養(yǎng)室的濕度提高至85 90% ；
6)后提取當發(fā)酵酶活達到要求后，S卩120 130小時，發(fā)酵酶活達40000 50000u/g，這時停止發(fā)酵，進入后提取。具體為將發(fā)酵成熟的固體酶放入浸泡罐中，加水浸泡，并開啟攪拌，利用攪拌的剪切作用將浸泡液中的固體酶分散、打碎后進行萃取，得到萃取清液，萃取2 3次；再用離心機將萃取清液進行固液分離，并收集離心液；最后將所述離心液分別經板框二次過濾、超濾濃縮、精制過濾、添加穩(wěn)定劑和防腐劑等步驟，制得液體酸性蛋白酶。
可選地，所述液體酸性蛋白酶通過噴霧或沸騰干燥法制成固體酸性蛋白酶。
可選地，所述固體培養(yǎng)基中各種成分的重量體積比為碳源I 5%，營養(yǎng)鹽O.1 O. 5%，氮源O. 15 O. 55%，麩皮98. 75 95%。所述液體培養(yǎng)基中各種成分的重量體積比為 碳源I 5%，營養(yǎng)鹽O.1 O. 5%，氮源O. 15 O. 55%，其余為水。
可選地，所述培養(yǎng)基中為碳源選自葡萄糖、淀粉糖和麥芽蔗糖中的任意一種。
所述培養(yǎng)基中營養(yǎng)鹽選自磷酸二氫鉀、硫酸銨、磷酸氫二鉀、氯化銨、氯化鈣和硫酸鎂中的任意兩種。
可選地，所述塑料薄膜選自聚乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯和聚丙乙烯中的任意一種。
需要指出的是，所述培養(yǎng)基各組分的“重量體積比 ”是指培養(yǎng)基中的物料重量與培養(yǎng)基體積的比值。
由此可見，本發(fā)明提供的生產酸性蛋白酶的方法通過塑料薄膜覆蓋曲盤、用橡膠圈將所述塑料薄膜捆扎于所述曲盤上，在滅菌過程中，能防止培養(yǎng)基中水分的蒸發(fā)、以及營養(yǎng)物質的流失，有利于微生物的繁殖、提高單位酶活力；在滅菌、接種、發(fā)酵等的轉移過程中，使培養(yǎng)基不受外界微生物入浸和感染，給酸性蛋白酶固體發(fā)酵創(chuàng)造了一個良好的發(fā)酵環(huán)境；在發(fā)酵的前期，通過塑料薄膜保持曲盤內的濕度，這期間培養(yǎng)室不需要增加濕度，節(jié)約了能源，降低了生產成本，更重要的是保持培養(yǎng)室空氣干燥和清潔，防止感染雜菌；發(fā)酵前期結束時，菌絲已進入旺盛期繁殖到整個培養(yǎng)料表面并伸展至培養(yǎng)基內，有較好的抗雜菌能力，同時進入產酶高峰期，此時及時去掉覆蓋的塑料薄膜，耙松曲料，提高微生物的吸氧量，促進產酶及酶活力單位的積累，快速完成發(fā)酵，防止雜菌感染，提高產品質量。
所屬領域的普通技術人員應當理解以上所述僅為本發(fā)明的具體實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內，所做的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種生產酸性蛋白酶的方法，其特征在于，所述方法包括1)滅菌在曲盤中配置固體培養(yǎng)基；然后用塑料薄膜覆蓋所述曲盤，并用橡膠圈將所述塑料薄膜捆扎于所述曲盤上；將曲盤置于高壓滅菌鍋內，進行滅菌；2)接種滅菌后冷卻，當曲盤中的固體培養(yǎng)基冷卻至25 35°C時，移開所述塑料薄膜， 在無菌條件下接入經過種母搖瓶培養(yǎng)和種子罐擴大培養(yǎng)的液體種母，并與所述固體培養(yǎng)基充分混合均勻；用塑料薄膜將所述曲盤再次覆蓋，并用橡膠圈將所述塑料薄膜捆扎于所述曲盤上；3)發(fā)酵接種完成后，將所述曲盤放入培養(yǎng)室中進行發(fā)酵；4)后提取當發(fā)酵酶活達到要求后，即培養(yǎng)時間為110 120小時，發(fā)酵酶活達 45000 50000u/ml，停止發(fā)酵，進入后提取，提取成不同規(guī)格的酶制劑產品。
2.根據(jù)權利要求1所述的生產酸性蛋白酶的方法，其特征在于，在所述發(fā)酵步驟中，培養(yǎng)室的溫度為30±0. 5°C，在培養(yǎng)時間為O 60小時內，培養(yǎng)室內濕度為45 65% ;當菌絲繁殖至布滿整個培養(yǎng)基的表面時，移去所述塑料薄膜，并將曲盤內的物料耙松，同時將培養(yǎng)室的濕度提高至85 90%。
3.根據(jù)權利要求2所述的生產酸性蛋白酶的方法，其特征在于，耙松所述物料后，在 30 60分鐘內將培養(yǎng)室的濕度提高至85 90%。
4.根據(jù)權利要求1所述的生產酸性蛋白酶的方法，其特征在于，在所述后提取步驟中， 停止發(fā)酵后，先將發(fā)酵成熟的固體酶放入浸泡罐中，加水浸泡，并開啟攪拌，利用攪拌的剪切作用將浸泡液中的固體酶分散、打碎后進行萃取，得到萃取清液，萃取2 3次；再用離心機將萃取清液進行固液分離，并收集離心液；最后將所述離心液分別經板框二次過濾、超濾濃縮、精制過濾、添加穩(wěn)定劑和防腐劑的步驟，制得液體酸性蛋白酶。
5.根據(jù)權利要求4所述的生產酸性蛋白酶的方法，其特征在于，所述液體酸性蛋白酶通過噴霧或沸騰干燥法制成固體酸性蛋白酶。
6.根據(jù)權利要求1所述的生產酸性蛋白酶的方法，其特征在于，所述固體培養(yǎng)基中各種成分的重量體積比為碳源I 5%，營養(yǎng)鹽O.1 O. 5%，氮源O. 15 O. 55%，麩皮98. 75 95%。
7.根據(jù)權利要求6所述的生產酸性蛋白酶的方法，其特征在于，所述碳源選自葡萄糖、 淀粉糖和麥芽蔗糖中的任意一種。
8.根據(jù)權利要求6所述的生產酸性蛋白酶的方法，其特征在于，所述營養(yǎng)鹽選自磷酸二氫鉀、硫酸銨、磷酸氫二鉀、氯化銨、氯化鈣和硫酸鎂中的任意兩種。
9.根據(jù)權利要求1所述的生產酸性蛋白酶的方法，其特征在于，所述塑料薄膜選自聚乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯和聚丙乙烯中的任意一種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生產酸性蛋白酶的方法，所述方法通過用塑料薄膜將曲盤覆蓋，并用橡膠圈將所述塑料薄膜捆扎于所述曲盤上，在滅菌過程中，能防止培養(yǎng)基中水分的蒸發(fā)、以及營養(yǎng)物質的流失，有利于微生物的繁殖、提高單位酶活力；在滅菌、接種、發(fā)酵等的轉移過程中，使培養(yǎng)基不受外界微生物入浸和感染；在發(fā)酵的前期，通過塑料薄膜保持曲盤內的濕度，節(jié)約了能源，降低了生產成本；發(fā)酵前期結束時，菌絲已進入旺盛期繁殖到整個培養(yǎng)料表面并伸展至培養(yǎng)基內，有較好的抗雜菌能力，同時進入產酶高峰期，此時及時去掉覆蓋的塑料薄膜，耙松曲料，提高微生物的吸氧量，促進產酶及酶活力單位的積累，防止雜菌感染，提高產品質量。
文檔編號C12N9/50GK102994485SQ201210566838
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月24日 優(yōu)先權日2012年12月24日
發(fā)明者李洪兵, 朱永明, 胡永明, 毛強, 王小玲 申請人:湖南鴻鷹生物科技有限公司