專利名稱：：酸性真菌蛋白酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：0002本發(fā)明涉及編碼被命名為NSP24家族蛋白酶、NSP25家族蛋白酶和PepA蛋白酶的酸性蛋白酶的多核苷酸；NSP24和NSP25家族蛋白酶多肽；包括所述蛋白酶的組合物以及它們的使用。
背景技術(shù)：
：0003蛋白酶是能夠切開肽鍵的酶。酸性蛋白酶(例如具有酸性最適pH的蛋白酶)是由大量不同的生物，包括哺乳動(dòng)物和微生物產(chǎn)生的。例如，微生物酸性蛋白酶是由細(xì)菌菌株諸如芽孢桿菌屬某種(Bacillussp.)的菌株(JP01240184)和真菌菌株諸如根霉屬某種(Rhizopussp.)(EP72978)、Schytalidiumsp.(JP48091273)、Sulpholobussp.、熱原體屬某種(Thermoplasmasp.)(WO/9010072)以及曲霉屬某種(Aspergillussp.)(JP50121486和EP82395)的菌株產(chǎn)生的。0004Berka等(Gene(1990)96313)公開了編碼來自泡盛曲霉(Aspergillusawamori)的天冬氨酸蛋白酶曲霉胃蛋白酶(aspergillopepsin)A的基因。對編碼來自米曲霉(Aspergillusoryzae)的天冬氨酸蛋白酶曲霉胃蛋白酶(aspergillopepsin)O的基因的克隆由Berka等(Gene(1993)125195-198)加以描述。對編碼來自米曲霉的酸性蛋白酶(PepA)的基因的克隆由Gomi等(Biosci.Biotech.Biochem.(1993)57(7)1095-1100)加以描述。0005蛋白酶，具體而言是酸性蛋白酶，被廣泛地應(yīng)用工業(yè)應(yīng)用中，例如用于制備食品和飼料、用于皮革工業(yè)(例如使皮革脫毛)、用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物、以及用于生產(chǎn)醇類諸如乙醇生產(chǎn)、酒類生產(chǎn)與釀造。0006對于許多不同的應(yīng)用，特別是在食品和飼料工業(yè)中，對蛋白酶仍然有著持續(xù)的需求。發(fā)明概述0007申請人已發(fā)現(xiàn)大量新型蛋白酶基因，其包括編碼NSP24蛋白酶(SEQIDNO2或SEQIDNO10)的新型nsp24基因；編碼NSP25蛋白酶(SEQIDNO9)的新型nsp25基因；和編碼新型PepA蛋白酶(SEQIDNO7)的新型pepA變體基因。0008因此，本發(fā)明的特征是NSP24蛋白酶、NSP25蛋白酶或PepA蛋白酶以及它們的變體的重組的或者基本上純的制劑。0009在本發(fā)明的一些方面，蛋白酶是NSP24家族蛋白酶多肽，其包括與SEQIDNO2或SEQIDNO10中的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列(下文圖6所示)。在一些實(shí)施方式中，NSP24家族蛋白酶多肽是由SEQIDNO8中的核酸編碼(下文圖5所示)，或者由具有與SEQIDNO8的核酸基本相同的核酸序列的核酸編碼。0010在本發(fā)明的其它方面，NSP24家族蛋白酶多肽與SEQIDNO10中的序列在氨基酸序列上具有多達(dá)10個(gè)殘基的差異。在一些實(shí)施方式中，NSP24家族蛋白酶多肽與SEQIDNO10中的序列在氨基酸序列上具有多達(dá)10％殘基的差異。在一些實(shí)施方式中，具有如此的差異，以至于NSP24家族蛋白酶多肽表現(xiàn)出NSP24蛋白酶的生物學(xué)活性，例如NSP24蛋白酶保留了天然存在的NSP24蛋白酶的生物學(xué)活性。0011在本發(fā)明進(jìn)一步的方面，NSP24家族蛋白酶多肽包括此處所述的NSP24蛋白酶序列以及其它的N-末端和/或C-末端氨基酸序列。0012在本發(fā)明的其它方面，NSP24家族蛋白酶多肽包括來自SEQIDNO2或SEQIDNO10的氨基酸序列的全部或片段，在閱讀框中，其與其它氨基酸殘基融合，優(yōu)選地與由基因組DNA5′至編碼來自SEQIDNO1或SEQIDNO8的序列的基因組DNA所編碼的殘基融合。0013仍在本發(fā)明的其它方面，NSP24家族蛋白酶是重組體融合蛋白，其具有第一NSP24家族蛋白酶部分和第二多肽部分，例如具有與NSP24家族蛋白酶不相關(guān)的氨基酸序列的第二多肽部分。該第二多肽部分可以是DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域或者聚合酶活化結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的多肽包括那些由于多基因的存在、選擇性轉(zhuǎn)錄事件、選擇性RNA剪接事件以及選擇性翻譯和翻譯后事件所產(chǎn)生的多肽。該多肽可以在系統(tǒng)例如培養(yǎng)的細(xì)胞中表達(dá)，該系統(tǒng)產(chǎn)生與表達(dá)的NSP24蛋白酶在天然細(xì)胞中表達(dá)時(shí)基本上相同的翻譯后修飾，或者可以在這樣的系統(tǒng)中表達(dá)，該系統(tǒng)導(dǎo)致當(dāng)在天然細(xì)胞中表達(dá)時(shí)存在的翻譯后修飾的省略。0014仍在其它方面，本發(fā)明涉及酶組合物，其包括NSP24家族蛋白酶以及一種或多種其它組分，例如載體、稀釋劑或溶劑。所述其它組分可以是賦予該組合物體外用途、體內(nèi)用途、藥物用途或獸醫(yī)用途的組分。在本方面的一些實(shí)施方式中，酶組合物將包括其它酶類。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，其它酶將會(huì)是葡糖淀粉酶、α淀粉酶或它們的組合。0015仍在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了基本上純的核酸，其具有或包括編碼NSP24家族蛋白酶多肽的核苷酸序列，所述多肽包括與SEQIDNO2或SEQIDNO10的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。0016在一些方面，NSP24家族蛋白酶核酸將包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，例如可操縱地連接于NSP24家族蛋白酶基因序列的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子序列的至少其中之一，例如以使NSP24家族蛋白酶基因序列適合作為表達(dá)載體使用。0017仍在其它方面，編碼本發(fā)明的NSP24蛋白酶多肽(例如SEQIDNO2)的核酸在嚴(yán)格條件下與核酸探針雜交，該探針對應(yīng)于來自SEQIDNO8的至少12個(gè)連續(xù)的核苷酸，更優(yōu)選地對應(yīng)于來自SEQIDNO8的至少20個(gè)連續(xù)的核苷酸。0018本發(fā)明的另一方面提供了NSP24家族蛋白酶(例如NSP24)在各種工業(yè)設(shè)施方面的應(yīng)用。例如，NSP24家族蛋白酶可以被用于農(nóng)業(yè)廢料的酶促降解以生產(chǎn)醇類燃料和其它重要的工業(yè)化學(xué)品，用于生產(chǎn)動(dòng)物或人類食品，或者作為去污劑組合物的組分，用于皮革加工以及蛋白質(zhì)基的纖維加工(諸如毛料或絲綢)，用于生物量應(yīng)用，用于個(gè)人護(hù)理應(yīng)用(皮膚、頭發(fā)、口腔護(hù)理等)，用于藥物和保健護(hù)理應(yīng)用以及用于生產(chǎn)適用于以上應(yīng)用的新型肽。0019在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明涉及多核苷酸，其編碼具有SEQIDNO7的pepA變體蛋白酶L388M。在一些實(shí)施方式中，該多核苷酸具有SEQIDNO5的序列。0020仍在另一方面，本發(fā)明涉及NSP25家族蛋白酶。在一些實(shí)施方式中，NSP25家族蛋白酶將具有與SEQIDNO9至少85％的序列同一性。在其它實(shí)施方式中，NSP25家族蛋白酶將由與SEQIDNO4具有至少85％序列同一性的多核苷酸所編碼。仍在其它實(shí)施方式中，NSP25家族蛋白酶將是母體NSP25家族蛋白酶的生物學(xué)活性片段。0021圖1舉例說明了糖類的降解(DP+3)％w/v，使用了1)NSP24、2)可商業(yè)獲得的蛋白酶，GC106和3)DISTILLASE，其不包括蛋白酶(參見實(shí)施例5)。0022圖2描述了糖類的降解(DP2)％w/v，使用了NSP24、GC106和DISTILLASE。0023圖3舉例說明了葡萄糖的形成(DP1)，使用了NSP24、GC106和DISTILLASE。對于NSP24和GC106樣品，在40小時(shí)末剩余的葡萄糖量為0.2％w/v以下，而在48小時(shí)末為0.1％w/v以下。相反，對于DISTILLASE，在48小時(shí)末以％w/v測量的葡萄糖量稍大于1.0％w/v。0024圖4舉例說明了NSP24、GC106和DISTILLASE的乙醇生產(chǎn)(％v/v)。通過使用兩種蛋白酶樣品產(chǎn)生乙醇的速率和量基本相同。相反，DISTILLASE產(chǎn)生較少的乙醇且速度較慢。0025圖5A-D舉例說明了由里氏木霉(Trichodermalreesei)獲得的pTrex3g_NSP24cDNA克隆的核苷酸序列(SEQIDNO1)。NSP24基因序列加下劃線，推定的基因內(nèi)含子序列用黑體加以標(biāo)識(shí)。編碼該蛋白酶的核酸序列用SEQIDNO8的序列加以表示。0026圖6A-B舉例說明了來自里氏木霉的NSP24的預(yù)測的氨基酸序列(407個(gè)氨基酸)(SEQIDNO2)(圖6A)，以及NSP24核苷酸序列，其帶有用粗體字母標(biāo)識(shí)的推定內(nèi)含子(圖6B)(SEQIDNO8)。在圖6A中，信號肽為粗體，前原序列(preprosequence)為粗體加下劃線，而成熟的NSP24蛋白以KYGAPIS...開始并用SEQIDNO10表示。0027圖7舉例說明了pTrex3g_NSP24載體以及圖5核苷酸序列上的限制性酶切位點(diǎn)的位置。0028圖8舉例說明了pepA蛋白酶的核酸序列(SEQIDNO3)。推定的內(nèi)含子為粗體。0029圖9A-B舉例說明了編碼新型NSP25蛋白酶(399個(gè)氨基酸)(SEQIDNO9)的核酸序列(SEQIDNO4)。信號序列為粗體。0030圖10舉例說明了新型pepA蛋白酶變體(L388M)(SEQIDNO7)的核酸序列(SEQIDNO5)，其中圖中加下劃線的′A′是由圖8pepA中的′C′改變而成。0031圖11舉例說明了表達(dá)載體，pSL899_pepA。0032圖12A-E舉例說明了表達(dá)載體pSL899_pepA的核苷酸序列(SEQIDNO6)。XhoI切割位點(diǎn)用Λ表示，而XbaI位點(diǎn)用*表示。pepA的編碼序列以粗體表示。內(nèi)含子被加下劃線。0033圖13舉例說明了由SEQIDNO5編碼的蛋白的PepA變體L388M的氨基酸序列(SEQIDNO7)。發(fā)明詳述0034現(xiàn)在本發(fā)明將僅僅通過參考的方式使用下列定義和實(shí)施例來加以詳細(xì)描述。本文中所參考的全部專利和出版物，包括在此類專利和出版物中公開的全部序列，被明確并入本文作為參考。0035除非另作說明，本發(fā)明的實(shí)踐將使用常規(guī)的細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)基因生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA以及免疫學(xué)技術(shù)，其在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。此類技術(shù)在文獻(xiàn)中有所描述。參見例如Sambrook、Fritsch和Maniatis編輯的MolecularCloningALaboratoryManual，第二版(ColdSpringHarborLaboratoryPress1989)；Ausubel等編輯的ShortProtocolsinMolecularBiology(5thEd.2002)；DNACloning，VolumesI和II(D.N.Glovered.，1985)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gaited.，1984)；Mullis等美國專利號4,683,195；NucleicAcidHybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；TranscriptionAndTranslation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；CultureOfAnimalCells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；ImmobilizedCellsAndEnzymes(IRLPress，1986)；B.Perbal，APractical-GuideToMolecularCloning(1984)；論文，MethodsInEnzymology(AcademicPress，Inc.，N.Y.)；GeneTransferVectorsForMammalianCells(J.H.Miller和M.P.Caloseds.，1987，ColdSpringHarborLaboratory)；MethodsInEnzymology，Vols.154和155(Wu等eds.)，ImmunochemicalMethodsInCellAndMolecularBiology(Mayer和Walker，eds.，AcademicPress，London，1987)；HandbookOfExperimentalImmunology，VolumesI-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell，eds.，1986)；ManipulatingtheMouseEmbryo，(ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.，1986)。同樣，有關(guān)蛋白酶的制備、表達(dá)、分離和使用的方法的信息可以通過閱讀美國專利號6,768,001而獲得，該專利在此以其整體并入本文作為參考。0036通過下列詳細(xì)說明并通過權(quán)利要求，本發(fā)明的其它特征和優(yōu)勢將是顯而易見的。盡管與本文所述相似或等同的任何方法和材料都可以被用于本發(fā)明的實(shí)踐或測試，但優(yōu)選的方法和材料還是被加以描述。0037除非在本文中另作定義，此處所用的所有科學(xué)技術(shù)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員所通常理解的相同的含義。Singleton等DICTIONARYOFMICROBIOLOGYANDMOLECULARBIOLOGY，2DED.，JohnWileyandSons，NewYork(1994)和Hale&Marham，THEHARPERCOLLINSDICTIONARYOFBIOLOGY，HarperPerennial，NY(1991)為技術(shù)人員提供了本發(fā)明中所使用的許多術(shù)語的通用字典。0038此處所提供的標(biāo)題并非是限定本發(fā)明的各個(gè)方面或?qū)嵤┓绞剑淇梢宰鳛楸菊f明書的參考以整體包含于其中。因此，以下即刻被定義的術(shù)語以整體作為本說明書的參考而被更充分地定義。0039數(shù)字范圍包括限定該范圍的數(shù)字。0040除非另作說明，核酸是按照5′至3′方向從左至右書寫；氨基酸序列是按照氨基至羧基方向從左至右書寫。0041應(yīng)當(dāng)注意，如本說明書和所附權(quán)利要求中所用的，單數(shù)形式“一(a)”、“一(an)”和“該(the)”，除非將其內(nèi)容另作清楚的描述，包括復(fù)數(shù)參考。因此，例如，提及含“(一種)化合物(acompound)”的組合物時(shí)，則包括了兩種或更多種化合物的混合物。同樣應(yīng)當(dāng)注意的是，術(shù)語″或(or)″，除非將其內(nèi)容另作清楚的描述，一般用作包括“和/或(and/or)”的含義。定義0042“蛋白酶”表示來源于微生物，例如真菌、細(xì)菌，或者來自植物或動(dòng)物的蛋白或者蛋白的多肽結(jié)構(gòu)域或者多肽，其具有在蛋白質(zhì)骨架的一個(gè)或多個(gè)不同位置催化切開肽鍵的能力(例如E.C.3.4)。0043“酸性蛋白酶”指在酸性條件下具有水解蛋白的能力的蛋白酶。0044如此處所用，“NSP24家族蛋白酶”表示以其天然或野生型形式存在時(shí)具有蛋白酶活性的酶(例如圖6的蛋白)；與SEQIDNO2或SEQIDNO10的氨基酸序列具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％和至少99％序列同一性的蛋白酶蛋白；SEQIDNO2或SEQIDNO10的氨基酸序列的衍生物，以及蛋白酶序列的生物學(xué)活性片段。0045如此處所用，“衍生物”表示來源于前體或母體蛋白(例如天然蛋白)的蛋白質(zhì)，是通過在C-末端和N-末端之一或者兩者上加入一個(gè)和多個(gè)氨基酸，在氨基酸序列中的一個(gè)或大量不同位點(diǎn)置換一個(gè)或多個(gè)氨基酸，在該蛋白的單個(gè)或兩個(gè)末端或者在該氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸，或者在該氨基酸序列中的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸而獲得的。0046如此處所用，“天然序列NSP24”或“野生型NSP24序列”包括與來源于自然的NSP24家族蛋白酶具有相同氨基酸序列的多肽。0047“生物學(xué)活性片段”(例如具有SEQIDNO10序列的NSP24家族蛋白酶的生物學(xué)活性片段)表示NSP24家族蛋白酶或NSP25家族蛋白酶，其具有蛋白酶活性，但所包含的序列少于NSP24家族蛋白酶或NSP25家族蛋白酶的前體或母體的全序列。0048如此處所用，術(shù)語“分離的”或“純化的”指由于將蛋白酶從與其天然相關(guān)的一種或多種或所有天然存在的組分中分離出來而改變其天然狀態(tài)的蛋白酶。0049“PepA”指酸性蛋白酶，具有與SEQIDNO7至少95％的序列同一性。0050“L388M”指變體PepA，其具有SEQIDNO7序列。0051如此處所用，“NSP25家族蛋白酶”表示與SEQIDNO9具有至少85％序列同一性的蛋白酶及其生物學(xué)活性片段。0052“與NSP24家族蛋白酶不相關(guān)的”表示具有一種氨基酸序列，其與SEQIDNO10的NSP24蛋白酶具有30％以下的同源性、20％以下的同源性或者10％以下的同源性。0053術(shù)語“肽”、“蛋白質(zhì)”和“多肽”在本文中可以被互換使用。0054如此處所用，有關(guān)鑒定的氨基酸或核苷酸序列的“序列同一性百分比(％)”被定義為與感興趣序列(例如NSP24家族蛋白酶序列)的氨基酸殘基或核苷酸相一致的候選序列的氨基酸殘基或核苷酸的百分比，這是經(jīng)序列比對之后獲得，且如有必要，引入空位，以便獲得最大百分比的序列同一性，而不考慮作為部分序列同一性的任何保守取代。0055如此處所用，術(shù)語“α淀粉酶(例如E.C.類3.2.1.1)”指催化α-1，4-糖苷鍵水解的酶。此類酶也被描述為實(shí)現(xiàn)含有1，4-α-連接D-葡萄糖單位的多糖中1，4-α-D-糖苷鍵的外切或內(nèi)切水解的酶。用于描述這些酶的另一個(gè)術(shù)語是“糖原酶”。示例性的酶包括α-1，4-葡聚糖-4-葡聚糖水化酶葡聚糖水解酶。0056如此處所用，術(shù)語“葡糖淀粉酶”指葡糖淀粉酶類的酶(例如E.C.3.2.1.3，葡糖淀粉酶，1，4-α-D-葡聚糖葡萄糖水化酶)。這些酶為外切作用酶，其從直鏈淀粉和支鏈淀粉分子的非還原性末端釋放出葡糖基殘基。盡管速度大大低于α-1，4鍵，但此酶也水解α-1，6鍵和α-1，3鍵。0057術(shù)語“啟動(dòng)子”表示一種調(diào)控序列，其涉及結(jié)合RNA聚合酶以啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄。0058如此處所用，“異源啟動(dòng)子”是與基因或純化的核酸非天然相關(guān)的啟動(dòng)子。0059如此處所用，多肽的“純化的制劑”或“基本上純的制劑”表示多肽已被從細(xì)胞、與其天然存在的其它蛋白質(zhì)、脂類或核酸分離出來。0060如此處所用，在植物或動(dòng)物細(xì)胞的情況下，“純化的細(xì)胞制品”指細(xì)胞的體外制品，而非整個(gè)完整的植物或動(dòng)物。在培養(yǎng)細(xì)胞或微生物細(xì)胞的情況下，其由至少10％且更優(yōu)選地50％的受試細(xì)胞的制品組成。0061“基本上純的核酸”，例如基本上純的DNA，是這樣的核酸，該核酸是以下的一種或者兩者其與序列例如編碼序列的之一或兩者并非緊密相鄰，其在所述核酸的來源生物中天然存在的基因組中與所述序列是緊密相鄰的(例如5′末端的序列和3′末端的序列)；或者其基本不含在所述核酸的來源生物中存在的核酸序列。該術(shù)語包括，例如重組DNA，其被整合入載體，例如整合入自我復(fù)制的質(zhì)?；虿《荆蛘哒先朐松锘蛘婧松锏幕蚪MDNA，或者其以獨(dú)立于其它DNA序列的單獨(dú)分子(例如通過PCR或限制性內(nèi)切核酸酶處理而產(chǎn)生的cDNA或基因組DNA片段)存在。基本上純的DNA還包括重組DNA，其為編碼其它NSP24蛋白酶序列的雜合基因的一部分。0062如此處所用，“同源的”指兩種多肽分子之間或者兩種核酸分子之間的序列相似性。當(dāng)兩條比較序列中的位置都被相同的堿基或氨基酸單體亞基占據(jù)時(shí)，例如，若兩DNA分子中每個(gè)分子的一個(gè)位置都被腺嘌呤所占據(jù)，那么所述分子在該位置上就是同源的。兩序列間的同源性百分比，是兩序列所共有的匹配位置或同源位置數(shù)除以所比較的位置數(shù)再乘以100的函數(shù)。例如，如果兩序列中10個(gè)位置中的6個(gè)位置匹配或同源，那么兩序列則為60％同源。通過舉例的方式，DNA序列ATTGCC和TATGGC具有50％的同源性。一般地，在兩序列比對時(shí)進(jìn)行比較以提供最大同源性。0063如此處所用，術(shù)語“載體”指被設(shè)計(jì)為將核酸導(dǎo)入一種或多種細(xì)胞類型的多核苷酸序列。載體包括克隆載體、表達(dá)載體、穿梭載體、質(zhì)粒、噬菌粒、盒以及類似載體。0064如此處所用，“表達(dá)載體”表示一種DNA構(gòu)建物，其包含被可操縱地連接于合適的調(diào)控序列的DNA序列，所述調(diào)控序列能夠影響該DNA在合適宿主中的表達(dá)。0065術(shù)語“表達(dá)”表示根據(jù)基因的核酸序列產(chǎn)生多肽的過程。0066如此處所用，術(shù)語“可操縱地連接”表示將調(diào)控區(qū)諸如啟動(dòng)子、終止子、分泌信號或增強(qiáng)子區(qū)結(jié)合于(attachedto)或連接于(linkedto)結(jié)構(gòu)基因并控制該基因的表達(dá)。0067如此處所用，“來源于”微生物的物質(zhì)(例如多核苷酸或蛋白質(zhì))表示該物質(zhì)對于該微生物而言是天然的。0068如此處所用，“微生物”指細(xì)菌、真菌、病毒、原生動(dòng)物以及其它的微生物或微觀生物(microscopicorganisms)。0069如此處所用，“宿主菌株”或“宿主細(xì)胞”表示一種適合于表達(dá)載體的宿主，且包括所述細(xì)胞的后代，其中所述表達(dá)載體包括根據(jù)本發(fā)明的DNA。0070術(shù)語“絲狀真菌”指所有絲狀形式的真菌亞門(Eumycotina)生物(參見Alexopoulos，C.J.(1962)，INTRODUCTORYMYCOLOGY，Wiley，NewYorkandAINSWORTHANDBlSBYDICTIONARYOFTHEFUNGI，9thEd.(2001)Kirk等，EdS.，CABInternationalUniversityPress，CambridgeUK)。這些真菌是通過帶有細(xì)胞壁的營養(yǎng)菌絲體來加以表征的，其細(xì)胞壁包括幾丁質(zhì)、纖維素和其它復(fù)雜多糖。本發(fā)明的絲狀真菌在形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和遺傳學(xué)上不同于酵母菌。絲狀真菌的營養(yǎng)生長是通過菌絲的延伸進(jìn)行的，碳的分解代謝是專性好氧的。0071如此處所用，術(shù)語“木霉屬”或“木霉屬某種”指以前或目前被分類為木霉屬的任何真菌屬。0072如此處所用，術(shù)語“四重缺失(quad-delete)”或“四重缺失的(quad-deleted)”宿主細(xì)胞指由木霉屬宿主菌株細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞和原生質(zhì)體，其缺少至少兩個(gè)編碼功能性內(nèi)切葡聚糖酶(endoglucanases)的基因和至少兩個(gè)編碼功能性纖維二糖水解酶(cellobiohydrolases)的基因。0073如此處所用，術(shù)語“培養(yǎng)”指使微生物細(xì)胞群落在適當(dāng)條件下在液體或固體培養(yǎng)基中生長。在一種實(shí)施方式中，培養(yǎng)指將淀粉底物諸如包含顆粒淀粉的底物經(jīng)發(fā)酵生物轉(zhuǎn)化為終產(chǎn)物(一般在容器或反應(yīng)器中進(jìn)行)。發(fā)酵是通過微生物將有機(jī)物質(zhì)酶促厭氧降解以產(chǎn)生較簡單的有機(jī)化合物。當(dāng)發(fā)酵過程在厭氧條件下進(jìn)行時(shí)，并非意欲將該術(shù)語僅僅限定在嚴(yán)格的厭氧條件，因?yàn)榘l(fā)酵也在氧存在下進(jìn)行。0074如此處所用，術(shù)語“接觸”指將各種酶(一種或多種)放置于足夠接近各種底物之處，以使所述酶(一種或多種)能夠?qū)⒃摰孜镛D(zhuǎn)變成為終產(chǎn)物。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到酶與各種底物的混合溶液可以實(shí)現(xiàn)接觸。0075在關(guān)于將核酸序列中插入細(xì)胞的上下文中，術(shù)語“導(dǎo)入的”表示“轉(zhuǎn)染”、或“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”，且包括涉及將核酸序列整合入真核或原核細(xì)胞，其中該核酸序列可以被整合入該細(xì)胞的基因組(例如染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)中，轉(zhuǎn)變成自主復(fù)制元或者是被瞬時(shí)表達(dá)(例如，轉(zhuǎn)染的mRNA)。0076如此處所用，有關(guān)細(xì)胞所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化的”、“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的”和“轉(zhuǎn)基因的”表示該細(xì)胞含有非天然的(例如異源的)核酸序列，該核酸序列或者整合入其基因組或者作為染色體外質(zhì)粒被保持多代。0077如此處所用，有關(guān)多肽或多核苷酸的術(shù)語“異源的”指在宿主細(xì)胞中并非天然存在的多肽或多核苷酸。0078術(shù)語“過量表達(dá)”表示在宿主細(xì)胞中表達(dá)多肽的過程，其中多核苷酸已被導(dǎo)入該宿主細(xì)胞中。0079如此處所述，本發(fā)明的一個(gè)方面的特征是“基本上純的”(或重組的)核酸，其包括編碼NSP24家族蛋白酶或NSP25家族蛋白酶的核苷酸序列、和/或此類核酸的等價(jià)物。0080術(shù)語“等價(jià)物”指編碼功能上等價(jià)的多肽的核苷酸序列。等價(jià)的核苷酸序列將包括由于一個(gè)或多個(gè)核苷酸置換、添加或缺失而有所不同的序列，諸如等位基因變體。例如在一些實(shí)施方式中，由于遺傳密碼的簡并性，等價(jià)的核苷酸序列包括不同于SEQIDNO8核苷酸序列的序列，所述SEQIDNO8核苷酸序列編碼SEQIDNO2中所示的NSP24蛋白酶。0081如此處所用，術(shù)語“糖化作用”指將淀粉酶促轉(zhuǎn)化成為葡萄糖。0082如此處所用，“淀粉”指由植物的復(fù)合多糖碳水化合物組成的任何物質(zhì)，包括具有式(C6H10O5)x的直鏈淀粉和支鏈淀粉，其中X可以是任何數(shù)字。0083術(shù)語“顆粒淀粉”指生的未熟化的(生的)淀粉(例如尚未經(jīng)過糊化的淀粉)。0084如此處所用，術(shù)語“凝膠化作用”表示通過熟化將淀粉分子溶解以形成粘性懸浮液。0085如此處所用，術(shù)語“液化作用”指淀粉轉(zhuǎn)化的階段，其間凝膠化的淀粉被水解以提供低分子量的可溶性糊精。0086如此處所用，術(shù)語“可溶性淀粉水解物”指由淀粉水解產(chǎn)生的可溶性產(chǎn)物，其可以包含單糖、二糖和寡糖(例如葡萄糖、麥芽糖和更高級的糖)。0087術(shù)語“單糖”表示聚合物諸如淀粉的一個(gè)單體單位，其中聚合度(DP)是1(例如葡萄糖、甘露糖、果糖和半乳糖)。0088術(shù)語“二糖”表示一種包含兩個(gè)共價(jià)連接的單糖單位的化合物(DP2)(例如蔗糖、乳糖和麥芽糖)。0089術(shù)語“DP3+”表示各種聚合度在3以上的聚合物。蛋白酶和編碼它們的多核苷酸0090本發(fā)明涉及NSP24家族蛋白酶，諸如酸性蛋白酶，并且還涉及酸性真菌蛋白酶，其與SEQIDNO2蛋白酶或SEQIDNO10蛋白酶(圖6)具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性。在一些實(shí)施方式中，NSP24家族蛋白酶被命名為NSP24，其包括SEQIDNO10的序列(成熟蛋白序列)或者還包括SEQIDNO2的前蛋白序列。0091在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及NSP24家族蛋白酶的生物學(xué)活性片段。在一些實(shí)施方式中，生物學(xué)活性片段包括具有至少250個(gè)氨基酸殘基、至少300個(gè)氨基酸殘基、至少350個(gè)氨基酸殘基、至少375個(gè)氨基酸殘基以及至少400個(gè)氨基酸殘基的蛋白酶。0092在其它實(shí)施方式中，生物學(xué)活性片段包括多肽序列的至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％，所述多肽序列與圖6中的蛋白質(zhì)序列(SEQIDNO2或SEQIDNO10)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％和至少99％的序列同一性。在一些實(shí)施方式中，生物學(xué)活性片段將包括多肽序列的至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％和至少98％，所述多肽序列與具有SEQIDNO2或SEQIDNO10的母體NSP24蛋白酶具有至少95％的序列同一性。在一些實(shí)施方式中，生物學(xué)活性片段將包括多肽序列的至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％和至少98％，所述多肽序列與具有SEQIDNO2或SEQIDNO10的母體NSP24蛋白酶具有至少99％的序列同一性。0093在一些實(shí)施方式中，生物學(xué)活性片段為體內(nèi)存在的多種片段，例如由轉(zhuǎn)錄后加工所產(chǎn)生的片段或者由選擇性剪接的RNA的翻譯所產(chǎn)生的片段。片段包括那些在天然的或內(nèi)源性的細(xì)胞中表達(dá)的片段，例如由于翻譯后加工、例如由于氨基末端信號序列的去除產(chǎn)生的片段，并包括在表達(dá)系統(tǒng)例如CHO細(xì)胞中產(chǎn)生那些片段。一些優(yōu)選的片段是這樣的片段，例如活性片段，其由蛋白水解切割或選擇性剪接事件而產(chǎn)生。因?yàn)殡闹T如NSP24家族蛋白酶通常表現(xiàn)出一定范圍的生理學(xué)特性，并且因?yàn)榇祟愄匦钥梢员粴w因于由該分子的不同部分引起的，所以有用的NSP24家族蛋白酶片段或NSP24家族蛋白酶類似物是在任何NSP24蛋白酶活性生物學(xué)試驗(yàn)中表現(xiàn)出生物學(xué)活性的那些。0094在一些實(shí)施方式中，生物學(xué)活性片段包括具有SEQIDNO2或SEQIDNO10的NSP24的蛋白酶活性的至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％和至少100％。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，片段或類似物在任何體內(nèi)或體外NSP24蛋白酶試驗(yàn)中具有NSP24蛋白酶(SEQIDNO2或SEQIDNO10)的蛋白酶活性的至少40％或至少90％。0095NSP24家族蛋白酶或NSP25家族蛋白酶的片段可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知的方法生成。表現(xiàn)出蛋白酶生物學(xué)活性的候選片段的能力可以通過如此處所述的本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法加以評估。同樣包括在內(nèi)的是NSP24家族蛋白酶或NSP25家族蛋白酶，其含有對于該肽的生物學(xué)活性非必需的殘基或者由于選擇性mRNA剪接或選擇性蛋白質(zhì)加工事件所產(chǎn)生的殘基。0096在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明所包括的蛋白酶是具有SEQIDNO2或SEQIDNO10的蛋白酶的衍生物。衍生物可以與SEQIDNO10具有至少80％、85％、90％、93％、95％、97％、98％和99％的序列同一性。0097本發(fā)明也包括多種蛋白酶類似物。蛋白酶類似物是帶有增加肽穩(wěn)定性的修飾的那些；此類類似物可以在肽序列中含有例如一個(gè)或多個(gè)非肽鍵(其取代了肽鍵)。同樣包括在內(nèi)的是包括除天然存在的L-氨基酸以外的殘基例如D-氨基酸，或者非天然存在的或合成氨基酸，例如b或氨基酸的類似物；以及環(huán)狀類似物。類似物在氨基酸序列方面或者不涉及序列的方面或者兩個(gè)方面，都不同于天然存在的蛋白酶諸如NSP24或NSP25蛋白。非序列修飾包括本發(fā)明所包括的蛋白酶的體內(nèi)或體外的化學(xué)衍生作用。非序列修飾作用包括乙酰化作用、甲基化作用、磷酸化作用、羧化作用或糖基化作用的變化。0098在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明包括NSP25家族蛋白酶。NSP25家族蛋白酶是與SEQIDNO9的成熟蛋白序列(圖9)具有至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％和至少99％氨基酸序列同一性的酸性蛋白酶，或者它們的生物學(xué)活性片段。一種具體的NSP25家族蛋白酶是具有SEQIDNO9的被命名為NSP25的蛋白酶。在一些實(shí)施方式中，NSP25家族蛋白酶將是一種蛋白酶的生物學(xué)活性片段，其包括與SEQIDNO9具有至少90％序列同一性的序列的至少75％、至少80％、至少85％、至少90％和至少95％。在另一個(gè)實(shí)施方式中，NSP25家族蛋白酶將是一種蛋白酶的生物學(xué)活性片段，其包括與SEQIDNO9具有至少95％序列同一性的序列的至少75％、至少80％、至少85％、至少90％和至少95％。0099盡管根據(jù)本發(fā)明的酸性蛋白酶能夠在酸性條件下水解蛋白，但在一些實(shí)施方式中，蛋白酶活性的最適pH是在pH3.0至5.5的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方式中，蛋白酶活性的最適pH范圍是在pH3.0至5.0之間，而在其它實(shí)施方式中，蛋白酶活性的最適pH范圍是在pH3.0至4.5之間。0100根據(jù)本發(fā)明的蛋白酶，諸如NSP24家族蛋白酶或NSP25家族蛋白酶，可以包括氨基酸置換諸如使用L-氨基酸進(jìn)行“保守氨基酸的置換”，其中一種氨基酸被另一種生物學(xué)相似的氨基酸置換。保守氨基酸的置換是那些保持了被置換的氨基酸的總電荷、疏水性/親水性、和/或空間體積(stericbulk)的置換。保守置換的實(shí)例是在下列各組間進(jìn)行的置換Gly/Ala、Val/Ile/Leu、Lys/Arg、Asn/Gln、Glu/Asp、Ser/Cys/Thr和Phe/Trp/Tyr。衍生物可以例如有少至1至10個(gè)氨基酸殘基不同，諸如6-10個(gè)、少至5個(gè)、少至4個(gè)、3個(gè)、2個(gè)或者甚至1個(gè)氨基酸殘基不同。表1舉例說明了本領(lǐng)域所公認(rèn)的示例性的氨基酸置換。此外，置換可以通過一種或多種不破壞蛋白酶生物學(xué)活性的非保守性氨基酸置換、缺失或插入來完成。表1保守氨基酸的置換0101在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的蛋白酶是天然的序列。此類天然序列可以從自然界分離或者可以通過重組或合成的方式產(chǎn)生。術(shù)語“天然序列”具體地包括天然存在的截短形式或分泌形式的NSP24或NSP25家族蛋白酶(例如生物學(xué)活性片段)，以及天然存在的變體形式(例如選擇性剪接的形式)。0102在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的酸性蛋白酶是PepA蛋白酶，其與SEQIDNO7具有至少97％、至少98％和至少99％的序列同一性。在一些實(shí)施方式中，該蛋白酶具有SEQIDNO7序列并被命名為“L388M”。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，該蛋白酶由具有SEQIDNO5或SEQIDNO3序列的核苷酸序列所編碼。0103本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明所包括的蛋白酶的多核苷酸序列。一些此類多核苷酸包括a)編碼NSP24家族蛋白酶的多核苷酸，該蛋白酶與SEQIDNO2或SEQIDNO10具有至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％和至少99％的序列同一性；b)編碼SEQIDNO2序列的多核苷酸；c)具有SEQIDNO8序列的多核苷酸；d)編碼NSP24家族蛋白酶生物學(xué)活性片段的多核苷酸；e)與SEQIDNO8序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％和至少99％的序列同一性的多核苷酸；f)與對應(yīng)于SEQIDNO4、SEQIDNO8或者SEQIDNO4或SEQIDNO8片段的DNA序列的核酸探針相雜交的多核苷酸，所述片段具有至少10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100或150個(gè)連續(xù)的核苷酸；g)編碼NSP25家族蛋白酶的多核苷酸，其與SEQIDNO4具有至少85％、至少90％、至少93％、至少95％、至少97％、至少98％和至少99％的序列同一性；h)編碼SEQIDNO9蛋白酶的多核苷酸；i)具有SEQIDNO4序列的多核苷酸；j)編碼NSP25家族蛋白酶的生物學(xué)活性片段的多核苷酸；k)編碼SEQIDNO7的序列及其生物學(xué)活性片段的多核苷酸；和l)具有SEQIDNO3或SEQIDNO5序列的多核苷酸。0104因?yàn)檫z傳密碼的簡并性，一個(gè)以上的密碼子可以被用于編碼一具體氨基酸。因此，不同的DNA序列可以編碼與例如SEQIDNO2多肽具有相同氨基酸序列的多肽。本發(fā)明包括編碼此同一多肽的多種多核苷酸。0105當(dāng)單鏈形式的核酸能夠在適宜的溫度和溶液離子強(qiáng)度條件下與其它核酸進(jìn)行退火時(shí)，則該核酸可與另一核酸序列雜交。對于低、中、高以及極高嚴(yán)緊性條件的雜交而言，雜交和清洗條件為本領(lǐng)域所熟知(參見例如Sambrook(1989)supra，具體是第9章和第11章)。一般而言，雜交涉及核苷酸探針和同源DNA序列，其通過互補(bǔ)多核苷酸廣泛的堿基配對形成穩(wěn)定的雙鏈雜合體(同樣參見第8章，GeneCloning，AnIntroduction，T.A.Brown(1995)ChapmanandHallLondon)。在一些實(shí)施方式中，可以將帶有探針和同源序列的濾膜在2×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)、0.5％SDS中，在大約60℃(中等嚴(yán)緊性)、65℃(中/高嚴(yán)緊性)、70℃(高嚴(yán)緊性)和大約75℃(非極高嚴(yán)緊性)下進(jìn)行洗滌(CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley&Sons，NewYork，1989，6.3.1-6.3.6，在此被并入本文作為參考)。0106包括在本發(fā)明內(nèi)的是等位基因變異；天然突變體；誘導(dǎo)突變體；由在高或低嚴(yán)緊性條件下與編碼SEQIDNO2、SEQIDNO8、SEQIDNO9和SEQIDNO10的多肽的核酸雜交的DNA所編碼的蛋白；以及被抗血清特異性結(jié)合至具有SEQIDNO2或SEQIDNO10的NSP24蛋白酶的多肽，尤其是被抗血清特異性結(jié)合至NSP24蛋白酶的活性位點(diǎn)或結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽。在一些實(shí)施方式中，編碼本發(fā)明的NSP24家族蛋白酶的核酸，諸如編碼SEQIDNO2的NSP24蛋白酶的核酸，在高嚴(yán)緊性條件下，與對應(yīng)于來自SEQIDNO8的至少12、15或20個(gè)連續(xù)核苷酸的核酸雜交。0107本發(fā)明的核酸和多肽包括由于所公開序列中的測序錯(cuò)誤而不同于本文所公開的序列的那些核酸和多肽。0108DNA序列的同源性由兩DNA序列間的同一性程度確定?？梢杂糜?jì)算機(jī)程序來確定多肽序列或核苷酸序列的同源性或者同一性百分比。進(jìn)行序列聯(lián)配以及確定序列同一性的方法是技術(shù)人員已知的，可以不經(jīng)過過多的實(shí)驗(yàn)而進(jìn)行，并且可以明確地計(jì)算出同一性的值。參見，例如Ausubel等eds.(1995)CurrentProtocolsinMolecularBiology，Chapter19(GreenePublishingandWiley-Interscience，NewYork)；和ALIGN程序(Dayhoff(1978)inAtlasofProteinSequenceandStructure5Suppl.3(NationalBiomedicalResearchFoundation，Washington，D.C.)。有大量用于比對序列和確定序列同一性的算法是可利用的，包括，例如Needleman等(1970)J.Mol.Biol.48443的同源性聯(lián)配算法；Smith等(1981)Adv.Appl.Math.2482的局部同源性聯(lián)配算法；Pearson等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.852444的相似性搜索法；Smith-Waterman算法(Meth.Mol.Biol.70173-187(1997)；以及BLASTP、BLASTN和BLASTX算法(參見Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215403-410)。使用這些算法的計(jì)算機(jī)化程序也是可利用的，包括但不限于ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟件、或者WU-BLAST-2(Altschul等，Meth.Enzym.，266460-480(1996))；或者GAP、BESTFIT、BLASTAltschul等，supra、FASTA和TFASTA，可獲自GeneticsComputingGroup(GCG)包，Version8，Madison，Wis.，USA；和PC/Gene程序中的CLUSTAL，Intelligenetics，MountainView，Calif。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以確定用于測量聯(lián)配的合適參數(shù)，包括用于在所比較的序列長度內(nèi)獲得最大聯(lián)配所需的算法。優(yōu)選地，使用程序確定的默認(rèn)參數(shù)來測定序列同一性。具體而言，序列同一性可以通過Smith-Waterman同源性搜索算法加以測定(Meth.Mol.Biol.70173-187(1997))，如在MSPRCH程序(OxfordMolecular)中使用擬合空位搜索(affinegapsearch)，并使用下列搜索參數(shù)所進(jìn)行的空位開放罰分為12，空位延伸罰分為1。優(yōu)選地，成對的氨基酸比較可以使用GeneticsComputerGroup，Inc.，Madison，Wis.的GCG序列分析軟件包中的GAP-程序進(jìn)行，其使用blosum62氨基酸置換矩陣，空位權(quán)重為12，長度權(quán)重為2。關(guān)于兩氨基酸序列的最適聯(lián)配，變體氨基酸序列的連續(xù)片段相對于參比氨基酸序列而言可以含有額外的氨基酸殘基或缺失的氨基酸殘基。被用于與參比氨基酸序列進(jìn)行比較的連續(xù)片段將包括至少20個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基，并可以是30、40、50、或更多個(gè)氨基酸殘基?？梢酝ㄟ^指定空位罰分，對衍生物的氨基酸序列中與包含空位有關(guān)的增加的序列同一性進(jìn)行校正。0109在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明所包括的蛋白酶(例如與SEQIDNO2序列具有至少80％序列同一性的NSP24家族蛋白酶)，來源于細(xì)菌或真菌諸如絲狀真菌。一些優(yōu)選的絲狀真菌包括曲霉屬某些種(Aspergillusspp.)和木霉屬某些種(Trichodermaspp.)。一種優(yōu)選的木霉為里氏木霉(T.reesei)。然而，根據(jù)本發(fā)明的蛋白酶和/或編碼蛋白酶的DNA可以是來源于真菌，諸如犁頭霉屬某些種(Absidiaspp.)；枝頂孢霉屬某些種(Acremoniumspp.)；傘菌屬某些種(Agaricusspp.)；Anaeromycesspp.；曲霉屬某些種(Aspergillusspp.)，包括刺孢曲霉(A.aculeatus)、泡盛曲霉(A.awamori)、黃曲霉(A.flavus)、臭曲霉(A.foetidus)、A.fumaricus、煙曲霉(A.fumigatus)、構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)、黑曲霉(A.niger)、米曲霉(A.oryzae)、土曲霉(A.terreus)和雜色曲霉(A.versicolor)；Aeurobasidiumspp.；Cephalosporumspp.；毛殼菌屬某些種(Chaetomiumspp.)；鬼傘屬某些種(Coprinusspp.)；Dactyllumspp.；鐮刀菌屬某些種(Fusariumspp.)，包括F.conglomerans、磚紅鐮刀菌(F.decemcellulare)、爪哇鐮刀菌(F.javanicum)、亞麻鐮刀菌(F.lini)、尖鐮孢菌(F.oxysporum)和茄腐鐮刀菌(F.solani)；粘帚霉屬某些種(Gliocladiumspp.)；腐質(zhì)霉屬某些種(Humicolaspp.)，包括特異腐質(zhì)霉(H.insolens)和疏棉狀腐質(zhì)霉(H.lanuginose)；毛霉屬某些種(Mucorspp.)；脈孢菌屬某些種(Neurosporaspp.)，包括粗糙脈孢菌(N.crassa)和好食脈孢霉(N.sitophila)；Neocallimastixspp.；Orpinomycesspp.；青霉屬某些種(Penicilliumspp.)；顯革菌屬某些種(Phanerochaetespp.)；Phlebiaspp.；Piromycesspp.；根霉屬某些種(Rhizopusspp.)；裂褶菌屬某些種(Schizophyllumspp.)；栓菌屬某些種(Trametesspp.)；木霉屬某些種(Trichodermaspp.)，包括里氏木霉(T.reesei)、里氏木霉(T.reesei)(長枝木霉(T.longibrachiatum))和綠色木霉(T.viride)；和接合霉屬某些種(Zygorhynchusspp.)。宿主細(xì)胞0110在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了用本文所述的DNA構(gòu)建物和載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，被導(dǎo)入宿主細(xì)胞的編碼本發(fā)明所包括的蛋白酶(例如與SEQIDNO2具有至少95％序列同一性的NSP24家族蛋白酶)的多核苷酸編碼異源性蛋白酶，而在其它實(shí)施方式中，該多核苷酸編碼在宿主細(xì)胞中過量表達(dá)的內(nèi)源性蛋白酶。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了在宿主細(xì)胞諸如細(xì)菌和真菌宿主細(xì)胞中發(fā)揮功能的基因啟動(dòng)子控制下，異源性蛋白酶基因的表達(dá)或者蛋白酶基因的過量表達(dá)。0111一些優(yōu)選的宿主細(xì)胞包括絲狀真菌細(xì)胞。絲狀真菌宿主細(xì)胞的非限定性實(shí)例包括木霉屬某些種(Trichodermaspp.)(例如綠色木霉(T.viride)和里氏木霉(T.reesei)、紅褐肉座菌(Hypocreajecorina)的無性型，以前被分類為長枝木霉(T.longibrachiatum))、青霉屬某些種(Penicilliumspp.)、腐質(zhì)霉屬某些種(Humicolaspp.)(例如特異腐質(zhì)霉(H.insolens)和灰色腐質(zhì)霉(H.grisea))、曲霉屬某些種(Aspergillusspp.)(例如黑曲霉(A.niger)、構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)、米曲霉(A.orzyae)和泡盛曲霉(A.awamori))、鐮刀菌屬某些種(Fusariumspp.)(禾赤鐮孢菌(F.graminum))、脈孢菌屬某些種(Neurosporaspp.)、肉座菌屬某些種(Hypocreaspp.)和毛霉屬某些種(Mucorspp.)。進(jìn)一步地，宿主細(xì)胞可以包括芽孢桿菌屬某些種(Bacillusspp.)(例如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、緩慢芽孢桿菌(B.Lentus)、脂肪嗜熱芽孢桿菌(B.stearothremophilus)和短小芽胞桿菌(B.brevis))以及鏈霉菌屬某些種(Streptomycesspp.)(例如雜色鏈霉菌(S.coelicolor)和變鉛青鏈霉菌(S.lividans)(TK23和TK21))。分子生物學(xué)0112本發(fā)明依靠重組遺傳領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。公開本發(fā)明中的一般使用方法的基本教科書包括Sambrook等MolecularCloning，ALaboratoryManual(2nded.1989)；Kriegler，GeneTransferandExpressionALaboratoryManual(1990)；和Ausubel等，eds.，CurrentProtocolsinMolecularBiology(1994))。0113異源基因，包括例如絲狀真菌的基因啟動(dòng)子序列，一般在轉(zhuǎn)化進(jìn)入宿主細(xì)胞諸如里氏木霉細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制和/或表達(dá)以前，被克隆進(jìn)中間載體。這些中間載體一般是原核載體，例如質(zhì)?；虼┧筝d體。0114為獲得克隆基因的高水平表達(dá)，異源基因與啟動(dòng)子間的距離優(yōu)選地同天然存在的基因與啟動(dòng)子間的距離大約相同。然而，如本領(lǐng)域已知，在不損失啟動(dòng)子功能的條件下，對此距離的一些變化是可以接受的。0115本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，在不改變其功能的條件下，天然啟動(dòng)子可以通過置換(replacement)、取代、添加或消除一個(gè)或多個(gè)核苷酸而被修飾。本發(fā)明實(shí)踐包括而不限于對啟動(dòng)子的此類改變。0116表達(dá)載體/構(gòu)建物一般包含轉(zhuǎn)錄單位或表達(dá)盒，其包含表達(dá)異源序列所需的全部額外的元件。因此，典型的表達(dá)盒包含被可操縱地連接于異源核酸序列的啟動(dòng)子和對轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行有效的多聚腺苷酸化、核糖體結(jié)合位點(diǎn)以及翻譯終止所需的信號。盒的其它元件可以包括增強(qiáng)子，且如果基因組DNA被用作結(jié)構(gòu)基因，則還包括攜帶功能性剪接供體位點(diǎn)和受體位點(diǎn)的內(nèi)含子。0117本發(fā)明實(shí)踐并不受到對遺傳構(gòu)建物中啟動(dòng)子的選擇所限制。但是，示例性的啟動(dòng)子為里氏木霉cbh1、cbh2、eg1、eg2、eg3、eg5、xln1和xln2啟動(dòng)子。同樣，來自泡盛曲霉和黑曲霉葡糖淀粉酶基因(glaA)的啟動(dòng)子(Nunberg等(1984)Mol.CellBiol.42306-2315)以及來自構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶的啟動(dòng)子可以用于所述的載體。被用于枯草芽孢桿菌所用載體的優(yōu)選啟動(dòng)子為AprE啟動(dòng)子；大腸桿菌所用的優(yōu)選啟動(dòng)子為Lac啟動(dòng)子，釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)所用的優(yōu)選啟動(dòng)子為PGK1，黑曲霉(Aspergillusniger)所用的優(yōu)選啟動(dòng)子為glaA，而里氏木霉(Trichodermareesei)的優(yōu)選啟動(dòng)子為cbh1。0118除啟動(dòng)子序列以外，表達(dá)盒應(yīng)當(dāng)還包含結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)下游以提供有效的終止作用。終止區(qū)可以從與啟動(dòng)子序列相同的基因中獲得，或者可以從不同的基因中獲得。0119盡管任何真菌終止子在本發(fā)明中都有可能是有用的，但是一些優(yōu)選的終止子包括來自構(gòu)巢曲霉trpC基因(Yelton，M.等(1984)PNASUSA811470-1474，Mullaney，E.J.等(1985)MGG19937-45)、泡盛曲霉或黑曲霉葡糖淀粉酶基因(Nunberg，J.H.等(1984)Mol.CellBiol.42306，Boel，E.等(1984)EMBOJ.31581-1585)、米曲霉TAKA淀粉酶基因和米氏毛霉(Mucormiehei)羧基蛋白酶基因(EPO公布號.0215594)的終止子。0120用于將遺傳信息傳送入細(xì)胞的具體表達(dá)載體并非特別關(guān)鍵。用于在真核或原核細(xì)胞表達(dá)的任何常規(guī)載體都可以被使用。標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)菌表達(dá)載體包括噬菌體λ和M13，以及質(zhì)粒諸如基于pBR322的質(zhì)粒、pSKF、pET23D，和融合表達(dá)系統(tǒng)諸如MBP、GST和LacZ。也可以給重組蛋白添加表位標(biāo)簽，以提供簡便的分離方法，例如c-myc。適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)和/或整合載體實(shí)例在Sambrook等(1989)supra、Bennett和Lasure(Eds.)MoreGeneManipulationsinFungi，(1991)AcademicPresspp.70-76與pp.396-428及其所引用的文章；USP5,874,276以及真菌遺傳保藏中心菌株目錄(FungalGeneticStockCenterCatalogueofStrains)(FGSC，www.fgsc.net.)中提供?？梢詮腜romega和Invitrogen獲得有用的載體。一些具體的有用載體包括pBR322、pUC18、pUC100、pDONTM201、pENTRTM、pGEN3Z和pGEN4Z。然而，本發(fā)明意欲包括其它形式的表達(dá)載體，其具有發(fā)揮著等效的功能并且已被或正在被本領(lǐng)域所知曉。因此，大量的各種宿主/表達(dá)載體的組合可以被用于表達(dá)本發(fā)明的DNA序列。有用的表達(dá)載體，例如，可以包括染色體的、非染色體的和合成的DNA序列的片段，諸如各種已知的SV40衍生物和已知的細(xì)菌質(zhì)粒，例如來自大腸桿菌的質(zhì)粒，包括colE1、pCR1、pBR322、pMb9、pUC19以及它們的衍生物、宿主范圍更廣的質(zhì)粒，例如RP4、噬菌體DNA例如大量的λ噬菌體的衍生物，例如NM989，以及其它DNA噬菌體例如M13和絲狀單鏈DNA噬菌體、酵母質(zhì)粒諸如2μ質(zhì)粒或其衍生物。0121在一些實(shí)施方式中，表達(dá)載體包括選擇性標(biāo)記。選擇性標(biāo)記的實(shí)例包括賦予其抗微生物抗性的標(biāo)記。營養(yǎng)型標(biāo)記也可用于本發(fā)明中，包括那些本領(lǐng)域已知的標(biāo)記如amdS、argB和pyr4。用于轉(zhuǎn)化木霉的有用標(biāo)記是本領(lǐng)域已知的(參見例如Finkelstein，chapter6，inBiotechnologyofFilamentousFungi，F(xiàn)inkelstein等，EDSButterworth-Heinemann，BostonMA(1992)和Kinghorn等，(1992)AppliedMolecularGeneticsofFilamentousFungi，BlackieAcademicandProfessional，ChapmanandHall，London)。在一些實(shí)施方式中，表達(dá)載體還將包括復(fù)制元、編碼抗生素抗性的基因，這使得能夠?qū)Π葜亟M質(zhì)粒的細(xì)菌進(jìn)行選擇，以及包括質(zhì)粒非必需區(qū)中獨(dú)特的限制性位點(diǎn)，以使得能夠插入異源序列。所選的具體抗生素抗性基因并非關(guān)鍵性的，本領(lǐng)域已知的許多抗性基因中的任何一個(gè)都是適用的。優(yōu)選地選擇原核序列，這樣，它們便無法干擾DNA在里氏木霉中的復(fù)制和整合。0122本發(fā)明的轉(zhuǎn)化方法可以導(dǎo)致將全部或部分轉(zhuǎn)化載體穩(wěn)定整合入宿主細(xì)胞諸如絲狀真菌宿主細(xì)胞的基因組中。但是，還考慮的轉(zhuǎn)化作用是，其導(dǎo)致了自我復(fù)制的染色體外轉(zhuǎn)化載體的維持。0123許多標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)染方法可以被用于產(chǎn)生表達(dá)大量蛋白酶的細(xì)菌或絲狀真菌(例如曲霉屬或木霉屬)細(xì)胞系。一些公布的將DNA構(gòu)建物導(dǎo)入產(chǎn)纖維素木霉屬菌株的方法包括Lorito，Hayes，DiPietro和Harman，(1993)Curr.Genet.24349-356；Goldman，VanMontagu和Herrera-Estrella，(1990)Curr.Genet.17169-174；和Penttila，Nevalainen，Ratto，Salminen和Knowles，(1987)Gene6155-164，也參見USP6,022,725；USP6,268,328和Nevalainen等，″TheMolecularBiologyofTrichodermaanditsApplicationtotheExpressionofBothHomologousandHeterologousGenes″inMolecularIndustrialMycology，Eds，LeongandBerka，MarcelDekkerInc.，NY(1992)pp129-148；對于曲霉屬而言，包括Yelton、Hamer和Timberlake，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA811470-1474，對于鐮刀菌屬而言，包括Bajar，Podila和Kolattukudy，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA888202-8212，對于鏈霉菌屬而言，包括Hopwood等，1985，GeneticManipulationofStreptomycesLaboratoryManual，TheJohnInnesFoundation，Norwich，UK和Femandez-Abalos等，Microbiol1491623-1632(2003)，而對于芽孢桿菌屬而言，包括Brigidi，DeRossi，Bertarini，Riccardi和Matteuzzi，(1990)FEMSMicrobiol.Lett.55135-138。0124然而，將外源核苷酸序列導(dǎo)入宿主細(xì)胞的任何熟知的方法都可以被使用。這些方法包括使用磷酸鈣-轉(zhuǎn)染法、polybrene法、原生質(zhì)體融合、電穿孔、生物射彈法(biolistics)、脂質(zhì)體、顯微注射、原生質(zhì)載體、病毒載體以及任何其它熟知的將克隆的基因組DNA、cDNA、合成DNA或其它外源遺傳物質(zhì)導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法(參見例如Sambrook等，supra)。同樣使用的是美國專利號6,255,115中所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法。唯一必不可少的是所用的具體遺傳工程方法應(yīng)當(dāng)是能夠?qū)⒅辽僖环N基因成功地導(dǎo)入能夠表達(dá)該基因的宿主細(xì)胞中。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)本發(fā)明所包括的蛋白酶(例如NSP24家族蛋白酶)的方法，其包括向宿主細(xì)胞中導(dǎo)入包含啟動(dòng)子的多核苷酸，該啟動(dòng)子被可操縱地連接于編碼蛋白酶諸如NSP家族蛋白酶的核酸；在適于蛋白酶表達(dá)和產(chǎn)生的合適培養(yǎng)條件下培養(yǎng)該宿主細(xì)胞；并產(chǎn)生所述的蛋白酶。在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，蛋白酶是與SEQIDNO2或SEQIDNO10具有至少95％序列同一性的NSP24家族蛋白酶或者其生物學(xué)活性片段。0125當(dāng)表達(dá)載體被導(dǎo)入細(xì)胞后，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞被培養(yǎng)在適于基因表達(dá)的條件下，并受到蛋白酶基因啟動(dòng)子序列的控制。大批量的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以如下文實(shí)施例3中所述進(jìn)行培養(yǎng)。最后，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從培養(yǎng)物中回收產(chǎn)物。0126因此，本發(fā)明在此提供了所需多肽的表達(dá)和增強(qiáng)的分泌，該多肽的表達(dá)是在基因啟動(dòng)子序列的控制之下，所述基因啟動(dòng)子序列包括天然存在的蛋白酶基因、融合DNA序列以及多種異源構(gòu)建物。本發(fā)明還提供了表達(dá)和分泌高水平的此類所需多肽的方法。蛋白表達(dá)0127本發(fā)明的蛋白質(zhì)是由用載體諸如含有基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生的，所述基因的表達(dá)是在基因啟動(dòng)子序列控制之下。本發(fā)明對于增強(qiáng)蛋白質(zhì)諸如本發(fā)明所包括的蛋白酶的細(xì)胞內(nèi)和/或細(xì)胞外產(chǎn)生特別有用。蛋白質(zhì)可以是同源的或者異源的。對于所述基因表達(dá)的適宜條件包括向培養(yǎng)物中提供本發(fā)明的誘導(dǎo)供給組合物(inducingfeedcomposition)。生產(chǎn)該蛋白的最適條件將隨對宿主細(xì)胞的選擇以及隨對將要表達(dá)的蛋白酶蛋白的選擇而變化。通過常規(guī)的實(shí)驗(yàn)和優(yōu)化作用，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)容易地確定此類條件。0128感興趣的蛋白酶蛋白可以在表達(dá)后被分離或回收并純化。根據(jù)樣品中存在的其它組分，感興趣的蛋白可以按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法加以分離或純化。標(biāo)準(zhǔn)的純化方法包括電泳技術(shù)、分子技術(shù)、免疫技術(shù)和層析技術(shù)，所述層析技術(shù)包括離子交換層析、疏水層析、親合層析以及反相HPLC色譜和色譜聚焦。例如，感興趣的蛋白可以用標(biāo)準(zhǔn)的抗感興趣蛋白的抗體柱加以純化。結(jié)合蛋白質(zhì)濃縮，超濾和透析技術(shù)也是有用的。合適純化技術(shù)的一般指南，參見Scopes，ProteinPurification(1982)。必需的純化程度將根據(jù)感興趣蛋白質(zhì)的用途而變化。在一些實(shí)例中，將不必進(jìn)行純化。細(xì)胞培養(yǎng)0129宿主細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞可以培養(yǎng)在常規(guī)的營養(yǎng)培養(yǎng)基中。轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基可以根據(jù)適合于活化啟動(dòng)子以及選擇轉(zhuǎn)化體來進(jìn)行修改。具體的培養(yǎng)條件諸如溫度、pH及類似的條件可以是用于被選擇用來表達(dá)的宿主細(xì)胞的那些條件，并且對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言將是顯而易見的。此外，優(yōu)選的培養(yǎng)條件可以在科學(xué)文獻(xiàn)諸如Sambrook，(1982)supra；Kieser，T，MJ.Bibb，MJ.Buttner，KFChater，andD.A.Hopwood(2000)PRACTICALSTREPTOMYCESGENETICS.JohnInnesFoundation，NorwichUK；Harwood.等，(1990)MOLECULARBIOLOGICALMETHODSFORBACILLUS，JohnWiley中和/或從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC；www.atcc.org)中找到。真菌宿主細(xì)胞諸如木霉細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體一般可以根據(jù)其較快的生長速度或者在固體培養(yǎng)基上形成帶有光滑而非粗糙輪廓的圓形克隆而區(qū)別于非穩(wěn)定轉(zhuǎn)化體。表達(dá)多肽的回收和純化蛋白酶的方法0130本發(fā)明所包括的多肽，諸如由轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞所產(chǎn)生的與SEQIDNO10具有至少80％序列同一性的多肽，可以從培養(yǎng)基中回收，這通過多種常規(guī)方法進(jìn)行，包括通過離心或過濾將宿主細(xì)胞從培養(yǎng)基中分離出來，或者如有必要，裂解細(xì)胞并從細(xì)胞級分或細(xì)胞殘骸移取上清。在一些情況下，經(jīng)過澄清之后，上清或?yàn)V液中的蛋白質(zhì)組分利用鹽例如硫酸銨進(jìn)行沉淀。然后，將沉淀的蛋白質(zhì)溶解并可以通過各種層析方法例如離子交換層析、凝膠過濾層析、親合層析以及其它本領(lǐng)域所認(rèn)知的方法進(jìn)行純化。肽和蛋白質(zhì)的抗體可以通過免疫動(dòng)物例如兔或小鼠來進(jìn)行制備，并通過現(xiàn)有技術(shù)的方法回收抗-NSP24蛋白酶抗體。0131用于本發(fā)明的試驗(yàn)包括，但不限于WO9934011和USP6,605,458中所述的那些試驗(yàn)。組合物和應(yīng)用0132在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及包含如此處所述的本發(fā)明的蛋白酶的組合物。在根據(jù)本發(fā)明的組合物以及應(yīng)用中有用的蛋白酶的一些非限制性實(shí)例包括例如NSP24家族蛋白酶或者NSP25家族蛋白酶，更具體地與SEQIDNO2具有至少85％序列同一性的NSP24家族蛋白酶或者其生物學(xué)活性片段，諸如與SEQIDNO10序列具有至少90％序列同一性的蛋白酶。在一些實(shí)施方式中，酶組合物為單組分蛋白酶組合物。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及在工業(yè)和商業(yè)應(yīng)用中使用本發(fā)明的蛋白酶的方法。組合物與工業(yè)應(yīng)用的下列描述意欲為示例性的而非包括性的。0133包括本發(fā)明蛋白酶的組合物可以進(jìn)一步包括其它酶類，諸如，但不限于，葡糖淀粉酶、α淀粉酶、顆粒淀粉水解酶、纖維素酶、脂酶、木聚糖酶、角質(zhì)酶、半纖維素酶、氧化酶以及它們的組合。0134在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，組合物將包括本發(fā)明的蛋白酶和葡糖淀粉酶，所述蛋白酶與SEQIDNO10序列具有至少85％的序列同一性。葡糖淀粉酶可以是從絲狀真菌來源諸如曲霉屬、木霉屬或根霉屬菌株獲得的野生型葡糖淀粉酶，或者葡糖淀粉酶可以是蛋白質(zhì)工程化葡糖淀粉酶，諸如黑曲霉葡糖淀粉酶的變體。在其它優(yōu)選的實(shí)施方式中，組合物將包括本發(fā)明的蛋白酶和α淀粉酶。在一些實(shí)施方式中，α淀粉酶可以從細(xì)菌來源諸如芽孢桿菌屬某些種或者從真菌來源諸如曲霉屬某些種獲得。在一些實(shí)施方式中，組合物可以包括根據(jù)本發(fā)明的蛋白酶以及葡糖淀粉酶和α淀粉酶。這些酶類的商業(yè)來源是已知的，并且可從例如GenencorInternational，Inc.和NovozymesA/S獲得。0135在若干實(shí)施方式中，本發(fā)明已考慮用于乙醇生產(chǎn)、烘焙、果汁生產(chǎn)、釀造、蒸餾、酒類制造、皮革、油類與脂肪、紙與漿以及動(dòng)物飼料生產(chǎn)。0136在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明被考慮作為去污劑和清潔產(chǎn)品的活性“生物學(xué)”組分。在此，蛋白酶、淀粉酶和脂酶被用于分解蛋白質(zhì)、淀粉和脂肪污漬。本發(fā)明的實(shí)施方式包括通過進(jìn)行穩(wěn)定性研究測試酶類與去污劑組分的相容性以及在多種配方中測試它們。0137仍在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明考慮了將淀粉液化并糖化為葡萄糖并異構(gòu)化為果糖的酶促用途。本發(fā)明可以被用于將大體積的植物底物，諸如糧食(例如玉米、小麥、蜀黍、黑麥及類似物)轉(zhuǎn)變?yōu)樵鎏饎?，如高果糖玉米糖漿和麥芽糖糖漿。0138本發(fā)明的酶(一種或多種)可應(yīng)用于食品和飼料工業(yè)以提高蛋白質(zhì)的可消化性。蛋白酶還被用于多種工業(yè)應(yīng)用方面，具體而言，用于紡織品、平版印刷、化學(xué)工藝、農(nóng)業(yè)、環(huán)境廢棄物轉(zhuǎn)化、生物漿加工、生物量轉(zhuǎn)化為燃料以及其它化學(xué)方法(一種或多種)。進(jìn)而，該蛋白酶被應(yīng)用于保健及個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品諸如化妝品、皮膚護(hù)理品、牙膏及類似物。飼料0139本文所述的本發(fā)明酶被用于動(dòng)物飼料。所述飼料可以包括植物材料諸如玉米、小麥、高梁、大豆、油菜、向日葵以及任何此類植物材料的混合物或者植物蛋白來源，用于家禽、豬、反芻動(dòng)物、水產(chǎn)養(yǎng)殖和寵物。應(yīng)當(dāng)考慮，各種性能參數(shù)諸如生長、飼料攝取和飼料效率，以及改善的均勻性、動(dòng)物棚舍中降低的氨濃度、隨之提高的動(dòng)物福利和健康狀況都將得到改善。食品0140食用蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物代表了一個(gè)小而重要的市場部分。此類制品被用于術(shù)后患者或用于消化系統(tǒng)損傷的個(gè)體。此水解產(chǎn)物可以作為本身相對粗的制品被施用(Clegg，1978In″BiochemicalAspectsofNewProteinFood″，J，Adler-Nissen，B，O，Eggum，L，Munck&H.S.Olseneds.，p.109-117，Pergamon，Oxford)，或者作為高度純化的氨基酸混合物用于靜脈內(nèi)施用。乳蛋白的酶水解產(chǎn)物已被用作食用制品。0141瘦肉食品，特別是肉類的酶促嫩化，代表了一個(gè)巨大的市場部分，其目前由植物蛋白酶和某些微生物酶類所主導(dǎo)。魚類瘦肉的酶促成熟和嫩化在許多國家也是相當(dāng)重要的。因此，現(xiàn)在所描述的酶類被用于食品的多種用途中。0142進(jìn)一步，本發(fā)明的酶或酶組合物可以用于由例如植物蛋白如大豆、豌豆、羽扇豆或油菜籽蛋白、奶如酪蛋白、肉類蛋白或魚蛋白來制作蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物。此處所述的酶(一種或多種)可以被用于蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物以改善溶解性、均一性或可發(fā)酵性，減少抗原性、減少水解產(chǎn)物的苦味，或者用于制造食品、飼料或醫(yī)藥產(chǎn)品的其它目的。此處所述的酶(一種或多種)可以被單獨(dú)使用或者與其它肽酶一起或者與其它酶類如外切肽酶一起使用。此處所述的酶(一種或多種)與富含外切肽酶的酶制劑一起使用，將會(huì)改善蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的口味。0143而且，該酶或酶組合物可以被用于魚或肉的加工，例如改變質(zhì)地和/或粘性。皮革0144工業(yè)皮革制造有賴于涉及皮革的清潔、脫毛以及最終的鞣制和干燥的一系列步驟。酶處理在脫毛步驟中發(fā)揮了重要的作用，該步驟是通過應(yīng)用蛋白水解酶，如本發(fā)明的肽水解酶而實(shí)現(xiàn)的；由于它們具有高蛋白水解活性和在低pH下具有功效，從而能夠提供皮革制造中目前所用的哺乳動(dòng)物蛋白酶的有效替代品。毛料與絲綢0145此處所述的蛋白酶被用于工業(yè)處理毛料制品以賦予所期望的特性。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了處理紡織品的組合物。該組合物可以被用于處理例如毛料與絲綢(參見例如RE216,034；EP134,267；US4,533,359；和EP344,259)。0146本發(fā)明的方法可以被用于處理含蛋白的纖維，例如角蛋白纖維。其適于處理毛料、毛料纖維或動(dòng)物毛發(fā)，諸如安哥拉山羊毛(angora)、馬海毛(mohair)、開司米毛(cashmere)、alpacca或其它商業(yè)上有用的動(dòng)物毛發(fā)產(chǎn)品，其可以來源于綿羊、山羊、羊駝、駱駝、兔等。蠶絲、蜘蛛絲或人類毛發(fā)也可以用本發(fā)明的方法處理。所述纖維可以是纖維或頂絨(top)、紗線(yarn)或者紡織品或針織品或服裝的形式。清潔0147本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明蛋白酶(一種或多種)的清潔組合物。該清潔組合物可以額外含有通常用于清潔組合物的多種添加劑。它們可以選自，但不限于漂白劑、表面活性劑、助洗劑、酶和漂白催化劑。對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，什么添加劑適合于包含在組合物中將會(huì)是顯而易見的。此處所提供的清單并非詳盡，而應(yīng)當(dāng)被視為合適添加劑的實(shí)例。對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，僅使用那些與組合物中的酶和其它組分相容的添加劑，例如表面活性劑，也將會(huì)是顯而易見的。0148蛋白質(zhì)，具體而言是本發(fā)明的那些蛋白質(zhì)，可以按重量被配制成大約0.01至大約5％(優(yōu)選地0.1％至0.5％)水平的已知的粉末去污劑和液體去污劑，其具有3.5至7.0之間的酸性pH。在一些實(shí)施方式中，此類清潔組合物進(jìn)一步包括其它酶類諸如淀粉酶、其它蛋白酶、纖維素酶、脂酶或內(nèi)切葡萄糖苷酶、以及助洗劑和穩(wěn)定劑。在一些實(shí)施方式中，pH是在4.0至6.5之間，優(yōu)選地在4.0至5.6之間。根據(jù)所需的活性水平，盡管由于其最適pH的緣故，這些酶被稱為酸性蛋白酶，但是在pH7-9下使用這些酶也是有可能的。0149將蛋白質(zhì)加入常規(guī)清潔組合物并沒有任何特殊的使用限制。換言之，只要pH在以上范圍內(nèi)，而溫度在所述蛋白質(zhì)變性溫度以下，適于去污劑的任何溫度與pH也都適于本組合物。此外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)被用在無去污劑的清潔組合物中，再者單獨(dú)使用或者與助洗劑和穩(wěn)定劑組合使用。蛋白質(zhì)加工0150蛋白質(zhì)原材料的酶促水解經(jīng)常導(dǎo)致苦味肽(bitterpeptides)的形成(Clegg，1978)。存在于蛋白水解產(chǎn)物中的苦味肽可能代表了相當(dāng)多的實(shí)際問題，如這樣的情況，例如在不同類型奶酪的熟化過程中以及在食用蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的生產(chǎn)過程中。水解產(chǎn)物的苦味通常是由于特定的肽，且尤其是含有高比例疏水氨基酸的那些肽引起的。通過苦味肽的完全或者部分水解可以有效地減少苦味。因此，此處所述的酶類可用于去除食品的苦味。本發(fā)明的酶或酶組合物可以被用于減少食物中蛋白質(zhì)和/或蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的苦味。0151根據(jù)本發(fā)明還考慮到從蛋白質(zhì)和/或蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物生產(chǎn)游離氨基酸。當(dāng)游離氨基酸為谷氨酸的情況下，其強(qiáng)化了食品的風(fēng)味。0152所述蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物可以是動(dòng)物或植物來源的。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，將要被水解的蛋白是酪蛋白或大豆蛋白。0153該蛋白可以被用于生產(chǎn)食品諸如奶酪和含可可的食品。0154盡管此處所述的酶(一種或多種)以及富集了本發(fā)明酶的酶制品在用于生產(chǎn)無苦味的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物中可能特別是有利的，但是此處所述的酶(一種或多種)還可以被用于大量工業(yè)應(yīng)用，包括含蛋白質(zhì)物質(zhì)諸如細(xì)胞壁的降解或改性。一些蛋白質(zhì)如伸展蛋白是植物細(xì)胞壁的組分。因此，此處所述的酶(一種或多種)將有助于植物細(xì)胞壁的降解和改性。0155本發(fā)明酶制品的劑量以及使用該制品時(shí)的其它條件可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法加以確定。0156蛋白質(zhì)沉淀物在某些產(chǎn)品諸如例如啤酒中也提出了相當(dāng)大的問題，原因在于沉淀導(dǎo)致產(chǎn)品混濁。在啤酒的冷卻儲(chǔ)藏期間，當(dāng)可溶性蛋白沉淀時(shí)，會(huì)在啤酒中產(chǎn)生混濁。這一問題有著相當(dāng)大的經(jīng)濟(jì)重要性，而且除挑選合適的原材料用于制造啤酒外，目前避免此問題的主要方法是向啤酒中加入蛋白水解酶。個(gè)人護(hù)理0157在一些實(shí)施方式中，一旦此處所述的蛋白酶被合成并純化，則將有效的量加入個(gè)人護(hù)理組合物(一種或多種)，其可用于個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品。個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品可以被劃分/描述為化妝品、非處方(‘“OTC”)化合物，其可用于個(gè)人護(hù)理應(yīng)用(例如化妝品、皮膚護(hù)理、口腔護(hù)理、頭發(fā)護(hù)理、指甲護(hù)理)。在一些實(shí)施方式中，此處所述的蛋白酶被加入個(gè)人護(hù)理組合物諸如頭發(fā)護(hù)理組合物、皮膚護(hù)理組合物、指甲護(hù)理組合物、化妝品組合物或者它們的任何組合。因此，可以在例如用于清洗隱形眼鏡的溶液、牙膏、化妝品和皮膚護(hù)理產(chǎn)品中使用該酶或酶制品。增甜劑0158此處所述的蛋白酶可用于生產(chǎn)高麥芽糖或高果糖糖漿以及其它增甜劑。含可發(fā)酵糖類或可被轉(zhuǎn)化為糖類的組分的原材料通常為含淀粉的植物材料，包括但不限于糧食作物(例如玉米、小麥、蜀黍、燕麥和黑麥)的塊莖、根、莖、穗和谷粒以及含糖原材料諸如甜菜、甘蔗、水果材料和糖蜜。益生素(調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡用的寡糖類等有機(jī)物，Prebiotics)0159酶制品可以用于從蛋白質(zhì)生產(chǎn)肽，其中使用基本無其它蛋白水解活性的克隆的酶是有利的。0160通過使用此處所描述的酶(一種或多種)(例如純化的酶)來水解合適的蛋白來源，產(chǎn)生高度適于作為微生物底物的游離氨基酸和肽的粗制品是可能的，所述微生物對用于生長的氨基酸有著特殊的要求。0161這是用在工業(yè)發(fā)酵中的相當(dāng)大量的微生物的情況。必需氨基酸的供應(yīng)通常代表了此類發(fā)酵過程中的流程節(jié)約的一項(xiàng)重要因素。通過應(yīng)用酶所產(chǎn)生的氨基酸制品不但適合用作實(shí)驗(yàn)室的底物而且適合用作大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵的底物。0162此處所述的酶(一種或多種)也可以被用于功能肽、益生素和類似物的原位產(chǎn)生。術(shù)語“益生素”指食品或飼料組分，其通過選擇性地刺激消化道內(nèi)，優(yōu)選地為結(jié)腸內(nèi)的一種或有限數(shù)量的細(xì)菌的生長和/或活性而對宿主產(chǎn)生有益的影響。發(fā)酵與生物乙醇0163使用本發(fā)明的蛋白酶組合物由含淀粉底物的發(fā)酵來生產(chǎn)乙醇，可以包括生產(chǎn)燃料酒精或便攜酒精(portablealcohol)。在一些實(shí)施方式中，酶組合物也可以被用于促進(jìn)燕麥、麥芽以及其它原材料的酵母發(fā)酵以生產(chǎn)例如啤酒。0164淀粉酶是釀造和烘焙工業(yè)的基本酶類。在麥芽制備過程中以及在缺乏添加的糖類或其它碳水化合物的條件下進(jìn)行的某些烘焙過程中，需要淀粉酶來降解淀粉。獲得此類酶的充分活性是成問題的，尤其在麥芽制備工業(yè)。一種用生理學(xué)可接受的系統(tǒng)充分提高淀粉酶活性的方法，導(dǎo)致產(chǎn)生了更加迅速的麥芽制備方法，并且由于提高的糖類可利用性，從而導(dǎo)致產(chǎn)生了具有降低的碳水化合物含量的酒精飲料諸如啤酒。0165在一些實(shí)施方式中，含淀粉底物諸如谷粒(例如玉米、小麥和高梁)、穗以及其它植物殘留物的水解將會(huì)產(chǎn)生酒精諸如乙醇。酒精的生產(chǎn)方法在TheAlcoholTextbook，AReferencefortheBeverage，F(xiàn)uelandIndustrialAlcoholIndustries，3rdEd.，Eds.，K.A.Jacques等，(1999)NottinghamUniversityPress，UK中有所描述。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，蛋白酶將與葡糖淀粉酶以及任選的α淀粉酶一起以組合物方式被應(yīng)用于合并的糖化發(fā)酵步驟，也被稱為同步糖化和發(fā)酵。同樣參考了Chapter2.1，F(xiàn)ermentationAlcohol，S.LewisinIndustrialEnzymology，2nd.Ed.Eds.，T.Godfrey和S.West，(1996)StocktonPress，NY。使用酸性真菌蛋白酶與葡糖淀粉酶相組合通過發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的方法是已知的。例如，USP5,231,017公開了使用來源于黑曲霉的蛋白酶生產(chǎn)乙醇的方法，包括獲得液化的醪液并在糖化步驟期間將蛋白酶引入此液化醪液中，所述糖化步驟可以與發(fā)酵步驟合并在一起。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的蛋白酶組合物將被用于在非熟化過程中用顆粒淀粉底物生產(chǎn)醇類例如乙醇，其中該過程是在低于用于生產(chǎn)醇類的底物中淀粉的糊化溫度的溫度下進(jìn)行。而淀粉水解過程中所用的蛋白酶的數(shù)量將決定于蛋白酶的酶促活性。在一些實(shí)施方式中，該量將是加入到450g漿液中的范圍為0.001至2.0ml的2％蛋白酶溶液，所述漿液被調(diào)節(jié)至20-33％干固體，其中該漿液在糖化作用期間和/或在水解的淀粉中為液化的醪。其它有用的范圍包括0.005至1.5ml以及還有0.01至1.0ml。0166用蛋白酶處理種子和谷粒為通過發(fā)酵過程生產(chǎn)麥芽和飲料提供了有利條件。0167同樣期望在糖化作用期間使用蛋白酶以便水解面粉中的蛋白質(zhì)，并因此在對隨后的醇類發(fā)酵階段的預(yù)期中富集含有可溶性氮的麥芽汁。谷物中增強(qiáng)的淀粉酶活性提高了發(fā)芽的速度和效率，這在麥芽制備過程中是重要的，其中生產(chǎn)的麥芽具有提高的酶促活性，從而導(dǎo)致淀粉被強(qiáng)化水解為可發(fā)酵的碳水化合物，因而，改善了醇類飲料例如啤酒和蘇格蘭威士忌生產(chǎn)過程中的發(fā)酵效率。0168在以下的實(shí)驗(yàn)公開內(nèi)容中，使用了下列縮略語eq(當(dāng)量)；M(摩爾濃度)；μM(微摩爾濃度)；N(正常的)；mol(摩爾)；mmol(毫摩爾)；μmol(微摩爾)；nmol(納摩爾)；g(克)；mg(毫克)；kg(千克)；μg(微克)；L(升)；ml(毫升)；μl(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；μm(微米)；nm(納米)；℃(攝氏度)；h(小時(shí))；min(分鐘)；sec(秒)；msec(毫秒)；Ci(居里)；mCi(毫居里)；μCi(微居里)；TLC(薄層色譜)；Ts(甲苯磺酰基)；Bn(苯甲基)；Ph(苯基)；Ms(甲磺?；?；Et(乙基)、Me(甲基)、ds或DS(干固體含量)、SAPU(酸性蛋白酶分光光度單位，其中1SAPU是在試驗(yàn)條件下每分鐘從酪蛋白底物釋放1微摩爾酪氨酸的蛋白酶活性的量)以及GAU(葡糖淀粉酶單位，其被定義為在pH4.2和60℃條件下每小時(shí)從可溶性淀粉底物產(chǎn)生以葡萄糖計(jì)算的1g還原糖的酶量)。實(shí)施例0169下面的實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述了本發(fā)明，這些實(shí)施例的意圖并不在于以任何方式限制要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍。附圖被認(rèn)為是本發(fā)明的說明書和描述的一個(gè)完整部分。所有引用的參考文獻(xiàn)在此特意地并入作為參考，用于在此描述的所有內(nèi)容。下列實(shí)施例被提供用于舉例說明所要求保護(hù)的發(fā)明，而并非限定所要求保護(hù)的發(fā)明。實(shí)施例1新型蛋白酶NSP24的里氏木霉DNA克隆0170基因組DNA是從里氏木霉菌株QM6a中提取的。根據(jù)在里氏木霉基因組的疊連群1-5500中所發(fā)現(xiàn)的推定的蛋白酶序列，設(shè)計(jì)PCR引物(JointGenomeInstitute(JGI)T.reeseigenomev1.0)。正向引物包含用于定向克隆入pENTR/D載體(Invitrogen)的基序。0171afp6f引物的序列為CACCATGCAGACCTTTGGAGCT(SEQIDNO11)，而afp7r引物的序列為TTATTTCTGAGCCCAGCCCAG(SEQIDNO12)。根據(jù)InvitrogenGateway系統(tǒng)方案，通過凝膠提取方法來純化1.3kb的PCR產(chǎn)物(凝膠純化試劑盒(GelPurificationkit)，Qiagen)，并克隆進(jìn)pENTR/D。0172然后，將載體轉(zhuǎn)化進(jìn)帶有卡那霉素選擇標(biāo)記的化學(xué)感受態(tài)Top10大腸桿菌(Invitrogen)中。將來自若干獨(dú)立克隆的質(zhì)粒DNA用限制性酶消化，從而確認(rèn)正確大小的插入片段。對來自若干克隆的蛋白酶基因插入片段進(jìn)行測序(Sequetech，MountainView，CA)。將來自一個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA，pENTR/D_55.3與pTrex3g/amdS目的載體DNA加入LR克隆酶反應(yīng)(InvitrogenGatewaysystem)中。pTrex3g載體基于大腸桿菌pSL1180(PharmaciaInc.，NJ)，其為pUC118噬菌?；d體并在WO05/001036中有所描述。在LR克隆酶反應(yīng)中進(jìn)行的重組，用來自pENTR/D_55.3的里氏木霉蛋白酶置換目的載體的CmR和ccdB基因。此重組將蛋白酶定向插入目的載體的cbh1啟動(dòng)子和終止子之間。44和50bp的重組位點(diǎn)序列分別保留在蛋白酶基因的上游和下游。將LR克隆酶反應(yīng)的等份試樣轉(zhuǎn)化進(jìn)化學(xué)感受態(tài)Top10大腸桿菌中并過夜生長，用羧芐青霉素選擇。將來自若干克隆的質(zhì)粒DNA用限制性酶消化以確認(rèn)正確的插入片段大小。將來自克隆的質(zhì)粒DNApTrex3g_55.3.1用XbaI消化以釋放出包括cbh1啟動(dòng)子NSP24蛋白酶終止子amdS的表達(dá)盒。通過瓊脂糖凝膠提取法用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化此5.8kb盒，并將其轉(zhuǎn)化進(jìn)里氏木霉菌株，其來自于公眾可獲得的菌株QM6a(參見WO05/001036)。參考圖5、6和7。實(shí)施例2新型蛋白酶NSP25的里氏木霉DNA克隆0173基因組DNA是從里氏木霉菌株QM6a中提取的。根據(jù)在里氏木霉基因組(JGIT.reeseigenomev1.0)的疊連群22-263400中所發(fā)現(xiàn)的推定的蛋白酶序列，設(shè)計(jì)PCR引物。正向引物包含用于定向克隆入pENTR/D載體(Invitrogen)的基序。0174afp8f引物的序列為CACCATGCAGCCCTCATTTGGCAG(SEQIDNO13)，而afp9r引物的序列為CTATTTCTTCTGCGCCCAGCCAAC(SEQIDNO14)。根據(jù)InvitrogenGateway系統(tǒng)方案，通過凝膠提取法來純化1.2kb的PCR產(chǎn)物(凝膠純化試劑盒(GelPurificationkit)，Qiagen)并克隆進(jìn)pENTR/D。然后，將載體轉(zhuǎn)化進(jìn)帶有卡那霉素選擇標(biāo)記的化學(xué)感受態(tài)Top10大腸桿菌(Invitrogen)中。將來自若干獨(dú)立克隆的質(zhì)粒DNA用限制性酶消化，從而確認(rèn)正確大小的插入片段。對來自若干克隆的蛋白酶基因插入片段進(jìn)行測序(Sequetech，MountainView，CA)。將來自一個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA，pENTR/D_22.2與pTrex3g/amdS目的載體DNA一起加入LR克隆酶反應(yīng)(InvitrogenGatewaysystem)中。在LR克隆酶反應(yīng)中進(jìn)行的重組，用來自pENTR/D_22.2的里氏木霉蛋白酶置換目的載體中的CmR和ccdB基因。此重組將蛋白酶定向插入目的載體的cbh1啟動(dòng)子和終止子之間。44和50bp的重組位點(diǎn)序列分別保留在蛋白酶基因的上游和下游。將LR克隆酶反應(yīng)的等份試樣轉(zhuǎn)化進(jìn)化學(xué)感受態(tài)Top10大腸桿菌中并過夜生長，用羧芐青霉素選擇。將來自若干克隆的質(zhì)粒DNA用限制性酶消化，以確認(rèn)正確的插入片段大小。將來自克隆的質(zhì)粒DNApTrex3g_22.2#1用XbaI(并用EcoRI消化以便將細(xì)菌骨架消化成小片段，其在電泳過程中與盒遷移開來)消化，以釋放出包括cbh1啟動(dòng)子NSP25蛋白酶終止子amdS的表達(dá)盒。通過瓊脂糖凝膠提取法用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化此5.7kb盒，并將其轉(zhuǎn)化進(jìn)里氏木霉菌株，該菌株來自于公眾可獲得的菌株QM6a。除NSP24插入片段用NSP25序列替換外，用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒與圖7中舉例說明的質(zhì)?；鞠嗤?。實(shí)施例3木霉的PEG真菌轉(zhuǎn)化0175將來自形成孢子的菌絲體的平板的2cm2瓊脂塞(agarplug)接種于250ml4-擋板搖瓶中的50mlYEG肉湯中，并以200rpm在37℃培養(yǎng)16-20小時(shí)。通過將液體體積轉(zhuǎn)移入50ml錐形管中并在2500rpm下離心10分鐘來回收菌絲體。吸去上清。將菌絲體沉淀轉(zhuǎn)移入裝有40ml過濾除菌的β-D-葡聚糖酶(InterSpexProducts，Inc.)溶液的250ml0.22μmCACorning過濾瓶中，并在200rpm，30℃下溫育2小時(shí)。通過無菌Miracloth(CalBiochem，LaJolla，CA)，將菌絲體收集入50ml錐形離心管中，在2000rpm下離心5分鐘，抽氣。將沉淀用50ml1.2M山梨醇洗滌一次，再次離心，抽氣，并用25ml山梨醇/CaCl2洗滌。將原生質(zhì)體用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)、離心、抽氣，并重懸于山梨醇/CaCl2中，其體積足以產(chǎn)生1.25×108/ml的原生質(zhì)體濃度。每一轉(zhuǎn)化反應(yīng)使用200μl的等份試樣。將20μgDNA(＞1μg/ul)裝入15ml錐形管，并將錐形管放置于冰上。加入200μl原生質(zhì)體。加入50μlPEG混合物，并輕輕混勻，在冰上溫育20分鐘。將2mlPEG混合物加入錐形管中，并在室溫下溫育5分鐘。將4ml山梨醇/CaCl2(總共6.25ml)加入到錐形管中。此轉(zhuǎn)化混合物被分為3等份，每一覆蓋物(overlay)～2ml。將2ml加入到熔化的乙酰胺山梨醇頂層瓊脂的試管中，并將覆蓋物混合物(overlaymixture)倒在乙酰胺山梨醇平皿上，用于選擇能夠依靠乙酰胺作為唯一的氮源來生長的轉(zhuǎn)化體。將平皿在28-30℃溫育，直至克隆出現(xiàn)。通過在乙酰胺培養(yǎng)基(無山梨醇的乙酰胺山梨醇配方)上對單個(gè)克隆重復(fù)傳代，轉(zhuǎn)化體得以純化。材料017640mlβ-D-葡聚糖酶溶液600mgβ-D-葡聚糖酶；400mgMgSO4·7H2O和40ml1.2M山梨醇。0177200mlPEG混合物50gPEG4000(BDHLaboratorySuppliesPoole，England)和1.47gCaCl2·2H2O，在MiIIiQ水中制成。0178山梨醇/CaCl21.2M山梨醇和50mMCaCl0179為了進(jìn)行amdS選擇，使用乙酰胺山梨醇平皿和覆蓋物。為對孢子進(jìn)行純化，使用同樣的平皿，但不含山梨醇。乙酰胺山梨醇瓊脂(培養(yǎng)板和頂層瓊脂)0180乙酰胺(Aldrich99％經(jīng)升華的)0.6g/L；CsCl1.68g/L；葡萄糖20g/L；KH2PO420g/L；MgSO4·7H2O0.6g/L；CaCl2·2H2O0.6g/L；1000×鹽(參見下文)1ml。將pH調(diào)至5.5并將體積定容至300ml。用0.22微米濾膜過濾除菌并在烘箱中加熱至55℃。0181向700ml水中加入Noble瓊脂(低熔點(diǎn)用于頂層瓊脂)20g和山梨醇218g，然后高壓滅菌。將此混合物冷卻至55℃，并加入濾膜除菌的乙酰胺混合物。倒入平皿和試管。1000×鹽——FeSO4·7H2O(0.5g/100ml)；MnSO4·H2O(0.16g/100ml)；ZnSO4·7H2O(0.14g/100ml)；CoCl2·6H2O(0.1g/100ml)，并用0.22微米濾膜過濾除菌。馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA，DifcoDehydratedCultureMedia)——馬鈴薯，來自200g/L的浸液；葡萄糖20g/L和瓊脂15g/L在50-80％終體積的dH2O中充分混合，然后定容至100％終體積。將此混合物高壓滅菌，冷卻至55℃并傾倒。為了制成用于pH3.5培養(yǎng)基的1％脫脂奶瓊脂，如上制備PDA，并向100ml熔化的PDA中加入1.8ml的10％酒石酸和12.5ml滅菌的8％脫脂奶，并鋪板。為了對脫脂奶進(jìn)行預(yù)滅菌，將8％脫脂奶(Difco)在122-123℃下高壓滅菌10分鐘，暴露期間的室壓為32-35psi。取出混合物，冷卻至室溫并在室溫下儲(chǔ)存。0182在搖瓶中生長3天后的轉(zhuǎn)化體中，評估蛋白酶的表達(dá)。用瓊脂塞接種里氏木霉培養(yǎng)基(Davis等，(1970)MethodsEnzymol.1779-143)。將培養(yǎng)物在30℃下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)3天。使培養(yǎng)肉湯通過0.22微米濾膜，并將濾液點(diǎn)到1％脫脂奶瓊脂上。經(jīng)過在室溫下過夜培養(yǎng)，觀察到清澈的區(qū)帶。實(shí)施例4NSP24、NSP25和L388MPeoA的PH活性圖0183PepA(野生型和L388M)、NSP24和NSR25在里氏木霉菌株中均過量表達(dá)，它們的pH活性圖，使用獲自MolecularProbes(EnzChekPorteaseKit-Greenfluorescence)的熒光標(biāo)記的酪蛋白試驗(yàn)進(jìn)行測定。PepA(野生型和L388M)和NSP是全發(fā)酵樣品，而NSP24是在50％甘油中穩(wěn)定化的純化蛋白。將該酶稀釋為1.0mg/ml、0.5mg/ml和0.25mg/ml。熒光標(biāo)記的底物在DIH2O中被稀釋為0.1mg/ml。將10ml底物加入50ml各種pH的緩沖液和30ulDIH2O中。通過加入10ml酶啟動(dòng)反應(yīng)，并在加入100ul1.0MpH10的磷酸鹽中止反應(yīng)前使其繼續(xù)進(jìn)行不同的時(shí)段。用485激發(fā)光在538nm發(fā)射處測量樣品的熒光，并在SpectraMAXEM熒光板讀數(shù)器中在530nm將發(fā)射光用濾鏡截止。NSP24在pH3.7下具有最適活性，野生型PepA在pH3.4下具有最適活性，而L388MpepA在pH3.5下具有最適活性。NSP25在pH4.6下具有最適活性。實(shí)施例5在實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵中里氏木霉NSP24蛋白酶與GC106的比較0184當(dāng)今乙醇工業(yè)中所使用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶是由GenencorInternational，Inc.商業(yè)銷售的蛋白酶GC106。在糖類降解、葡萄糖形成以及乙醇生產(chǎn)方面，將NSP24的功能性與GC106進(jìn)行比較。材料DistillaseL-400(Lot#107-04057-901，372GAU/g)GC106(Lot#A01-01300-001，1010SAPU/g)NSP24(Lot#20040423，1165SAPU/g)RedStarRedYeast來自乙醇生產(chǎn)商的醪液和稀釜餾物(MashandThinStillage)(玉米)方法0185從乙醇生產(chǎn)商獲得醪液和稀釜餾物(MashandThinStillage)(在發(fā)酵前，也被稱為大淺盒(backset))，并混合至26.5白利(brix)。將pH用1NHCL調(diào)至pH4.3。然后將樣品分為3-300克的等份試樣并放入32℃水浴中。平衡后，加入下列酶組合表20186DISTILLASEL-400是來源于黑曲霉的液體葡糖淀粉酶，其可以從GenencorInternationalInc.購得。在加入酶后，加入1.00克/瓶的RedStarRedYeast。在16、24、40和48小時(shí)取樣并離心。將500ul每一樣品放入裝有50ul1.1NH2SO4的試管中以停止反應(yīng)。2分鐘后，將樣品用4.5mlDIH2O稀釋并混合。混勻后，使樣品通過0.45微米濾膜并放入HPLC瓶中進(jìn)行分析。通過HPLC(PhenomenexRezex8u)分析樣品。結(jié)果在圖1-4中列出。NSP24的表現(xiàn)與GC106相似。實(shí)驗(yàn)室6在非熟化過程中NSP24對碎玉米的乙醇產(chǎn)量的影響0187用DIH2O制成碾碎的玉米的30％DS漿液。該碾碎的玉米是典型的用于乙醇工業(yè)的#2黃色馬齒形玉米樣品，其被粉碎以使70％以上將通過30目篩。谷粒的含水量用OHAUS，MB35Halogenmoisturebalance(MB35鹵素水份平衡)(NJ)進(jìn)行測量。用6NH2SO4將pH調(diào)至4.2。在125ml裝有100g醪液的燒瓶中進(jìn)行發(fā)酵，其中含有1.0GAU/g劑量的STARGEN001并含有或不含有0.5kg/MT劑量的NSP24。0188在45ml水中制備5gRedStarEthanolRed干酵母(LesaffreyeastCorporation，Milwaukee，WI)，并在接種至發(fā)酵罐前在32℃水浴中混合1小時(shí)。向每一125ml燒瓶中加入0.5ml酵母漿液。將燒瓶放入32℃水浴中并溫和混合此醪液。在發(fā)酵期間，取出樣品進(jìn)行HPLC分析。(HPLC柱PhenomenexRezex有機(jī)酸柱(RHM-Monosaccharide)#00H0132-KO；柱溫60℃；流動(dòng)相0.01NH2SO4；流速0.6ml/min；檢測器RI；注射體積20uL。72小時(shí)后停止發(fā)酵。在不同采樣間隔的化合物產(chǎn)量，包括糖類、乳酸、甘油和乙醇，在下表3中表示，其中+表示NSP24被加入燒瓶中，而--表示NSP24未被加入燒瓶中。經(jīng)測量，所有樣品的乳酸在大約0.01至0.02％w/v之間，而DP-2則測定為0.0。在24小時(shí)，乙酸被測定為大約0，而在71小時(shí)，對于所有樣品在0.03至0.04之間。表3實(shí)施例7使用玉米胚乳進(jìn)行乙醇生產(chǎn)中不同蛋白酶的比較0189使用胚乳(除菌玉米，75.8％淀粉，99.5％的顆粒大小＜30目)作為顆粒淀粉底物制得29.5％的DS醪液。將一百克每一醪液轉(zhuǎn)移至125ml燒瓶，并將培養(yǎng)基的pH調(diào)至pH4.5。將蛋白酶(NSP24；中性蛋白酶(MULTIFECTNEUTRAL，PROTEINASE-T)和堿性蛋白酶(SPEZYMEFAN，PROTEX6LMULTIFECTP-3000和PROTEASE899(GenencorInternational))以0.5kg/MT加入，隨后以2.5Kgs/MT加入STARGEN001(GenencorInternational)淀粉。然后用0.5ml20％酵母(RedStarEthanolRed)接種燒瓶，并放入水浴中保持在32℃。在溫育過程中將燒瓶的內(nèi)容物連續(xù)攪拌以獲得均勻的混合。在不同的時(shí)間間隔取樣進(jìn)行HPLC分析。測定72小時(shí)發(fā)酵罐肉湯中DDGS的殘留淀粉和蛋白質(zhì)含量。乙醇生產(chǎn)的結(jié)果在下表4中表示。表4權(quán)利要求1.一種分離的NSP24家族蛋白酶，其與SEQID10具有至少85％的氨基酸序列同一性。2.權(quán)利要求1所述的分離的NSP24家族蛋白酶，其與SEQID10具有至少90％的氨基酸序列同一性。3.權(quán)利要求2所述的分離的NSP24家族蛋白酶，其與SEQID10具有至少95％的氨基酸序列同一性。4.權(quán)利要求3所述的分離的NSP24家族蛋白酶，其與SEQID10具有至少97％的氨基酸序列同一性。5.一種分離的多核苷酸，其編碼NSP24家族蛋白酶。6.權(quán)利要求5所述的分離的多核苷酸，其中所述分離的核酸編碼NSP24蛋白酶，其與SEQID2具有至少85％的序列同一性。7.權(quán)利要求6所述的分離的多核苷酸，其具有SEQID8的序列。8.一種載體，其包括權(quán)利要求5所述的多核苷酸。9.一種宿主細(xì)胞，其用權(quán)利要求5所述的多核苷酸轉(zhuǎn)化。10.權(quán)利要求9所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是絲狀真菌細(xì)胞。11.權(quán)利要求10所述的宿主細(xì)胞，其中所述絲狀真菌細(xì)胞是曲霉屬某些種(Aspergillusspp.)、鐮刀菌屬某些種(Fusariumspp.)或者木霉屬某些種(Trichodermaspp.)。12.權(quán)利要求11所述的宿主細(xì)胞，其中所述曲霉是黑曲霉(A.niger)、米曲霉(A.oryzae)、構(gòu)巢曲霉(A.nidulans)或者泡盛曲霉(A.awamori)。13.權(quán)利要求11所述的宿主細(xì)胞，其中所述木霉是里氏木霉(T.reesei)。14.權(quán)利要求10所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是四重缺失的宿主細(xì)胞。15.一種產(chǎn)生蛋白酶的方法，包括a)向宿主細(xì)胞中導(dǎo)入多核苷酸，其包括被可操縱地連接于編碼NSP24家族蛋白酶的核酸的啟動(dòng)子，b)將所述宿主細(xì)胞在適于表達(dá)和產(chǎn)生NSP24家族蛋白酶的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，并c)產(chǎn)生所述NSP24家族蛋白酶。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，進(jìn)一步包括回收所述產(chǎn)生的蛋白酶。17.一種分離的母體NSP24家族蛋白酶的生物學(xué)活性片段。18.權(quán)利要求17所述的分離的生物學(xué)活性片段，其中所述母體NSP24家族蛋白酶與SEQIDNO2具有至少90％的序列同一性。19.權(quán)利要求17所述的分離的生物學(xué)活性片段，其中所述片段具有NSP24蛋白酶的至少40％的活性，所述NSP24蛋白酶具有SEQIDNO2或者SEQIDNO10。20.一種酶組合物，其包括權(quán)利要求1所述的NSP24家族蛋白酶。21.一種酶組合物，其包括權(quán)利要求17所述的NSP24家族蛋白酶的生物學(xué)活性片段。22.權(quán)利要求20所述的酶組合物，其中所述組合物是清潔組合物。23.權(quán)利要求22所述的酶組合物，其中所述清潔組合物是去污劑組合物。24.權(quán)利要求20所述的酶組合物，其中所述組合物是淀粉水解組合物。25.權(quán)利要求20所述的酶組合物，其中所述組合物是動(dòng)物飼料組合物。26.權(quán)利要求20所述的酶組合物，其中所述組合物被用于乙醇生產(chǎn)過程。27.權(quán)利要求20所述的酶組合物，其中所述組合物被用于淀粉糖化過程。28.權(quán)利要求20所述的酶組合物，其中所述組合物被用于麥芽糖或果糖的生產(chǎn)。29.權(quán)利要求20所述的酶組合物，其中所述組合物是個(gè)人護(hù)理組合物。30.權(quán)利要求20所述的酶組合物，進(jìn)一步包括葡糖淀粉酶。31.權(quán)利要求21所述的酶組合物，進(jìn)一步包括葡糖淀粉酶。32.權(quán)利要求20所述的酶組合物，進(jìn)一步包括α淀粉酶。33.權(quán)利要求21所述的酶組合物，進(jìn)一步包括α淀粉酶。34.權(quán)利要求33所述的酶組合物，進(jìn)一步包括葡糖淀粉酶。35.一種水解淀粉的方法，包括將含淀粉底物與權(quán)利要求20所述的酶組合物在適于淀粉水解的條件下接觸，并獲得水解的淀粉。36.分離的PepA蛋白酶，其具有SEQIDNO7。37.一種分離的多核苷酸，其編碼權(quán)利要求36所述的蛋白酶。38.權(quán)利要求37所述的多核苷酸，其具有SEQIDNO5。39.一種分離的NSP25家族蛋白酶，其與SEQIDNO9具有至少90％的序列同一性。40.一種分離的多核苷酸，其編碼權(quán)利要求39所述的NSP25蛋白酶。全文摘要本發(fā)明涉及新型酸性蛋白酶，更具體地涉及NSP24家族蛋白酶和NSP25家族蛋白酶，包括它們的生物學(xué)活性片段，并涉及編碼所述蛋白酶的核酸分子。同樣提供了包括編碼所述蛋白酶的核酸序列的載體和宿主細(xì)胞，生產(chǎn)所述蛋白酶的方法，酶組合物以及使用所述蛋白酶的方法。文檔編號C12N5/10GK101094918SQ200580045498公開日2007年12月26日申請日期2005年12月20日優(yōu)先權(quán)日2004年12月30日發(fā)明者K·A·克拉森,N·鄧恩－克萊曼,S·E·蘭特斯,C·E·皮爾格林,P·范索林格恩,M·沃德申請人:金克克國際有限公司