一種檢測(cè)復(fù)方依山紅提取物對(duì)HepG 2.2.15細(xì)胞的藥效的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及檢測(cè)復(fù)方依山紅藥效的方法。更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)復(fù)方 依山紅提取物對(duì)IfepG2.2.15細(xì)胞的藥效的方法
【背景技術(shù)】
[0002] 乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)引起的一種嚴(yán)重的世界范 圍內(nèi)危害人類(lèi)健康的疾病，在我國(guó)感染率高達(dá)10%-20%，HBV持續(xù)感染會(huì)導(dǎo)致肝硬化和原 發(fā)性肝細(xì)胞肝癌等肝臟疾病，現(xiàn)有的抗病毒藥物如干擾索和拉米夫定的療效仍然不能令 人滿(mǎn)意，因此尋找安全有效的抗HBV藥物已成為當(dāng)今醫(yī)藥學(xué)界一項(xiàng)迫切任務(wù)。中醫(yī)藥治療慢 性乙型肝炎在我國(guó)具有悠久的歷史，近幾十年有學(xué)者陸續(xù)對(duì)一些中草藥進(jìn)行抗HBV篩查，發(fā) 現(xiàn)確實(shí)存在一些高效、低毒抑制HBV的中草藥。復(fù)方依山紅是從壯族民間挖掘出來(lái)的治療乙 型肝炎的經(jīng)驗(yàn)方，對(duì)慢性乙型肝炎具有較好的治療效果。該方由壯藥材滿(mǎn)山紅、毛雞骨草、 田基黃、牛大力等組成，具有祛邪排毒、清利散瘀、疏通道路、扶助正氣的作用（李常偉，李 兵，盧汝梅，龐宇舟.復(fù)方依山紅組方藥材的化學(xué)成分研究進(jìn)展[J].廣西中醫(yī)藥，2014,（5): 7-8)。但是目前復(fù)方依山紅的藥理機(jī)制還未清楚，為了更好地促進(jìn)復(fù)方依山紅制劑的研制， 本發(fā)檢測(cè)評(píng)價(jià)復(fù)方依山紅提取物對(duì)IfepG2.2.15細(xì)胞的藥效。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的一個(gè)目的是解決至少上述問(wèn)題，并提供一種評(píng)價(jià)復(fù)方依山紅藥效的方 法。目前復(fù)方依山紅的藥理機(jī)制還未清楚，為了更好地促進(jìn)復(fù)方依山紅制劑的研制，本發(fā)明 通過(guò)測(cè)試所述溶液b的吸光值A(chǔ)及所述上清液a的吸光值&，所述溶液d的吸光值如及所述上 清液c的吸光值A(chǔ)3來(lái)計(jì)算HepG2.2.15細(xì)胞的存活率及不同濃度復(fù)方依山紅提取物對(duì)HepG 2.2. 15細(xì)胞分泌的HBsAg與HBeAg的抑制率；確定不同濃度復(fù)方依山紅提取物對(duì)HepG 2.2.15細(xì)胞的藥效，能客觀靈敏的反應(yīng)復(fù)方依山紅藥效，且本發(fā)明的檢測(cè)方法簡(jiǎn)單易操作。
[0004] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：
[0005] -種檢測(cè)復(fù)方依山紅提取物對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的藥效的方法，所述檢測(cè)方法包 括以下步驟：
[0006] 1)、配置不同濃度的復(fù)方依山紅提取物溶液；
[0007] 2)、將HepG2.2.15細(xì)胞接種到RPM1-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)形成細(xì)胞懸浮液；
[0008] 3)、依次將步驟1)中所述的不同濃度復(fù)方依山紅提取物溶液分別加入到所述細(xì)胞 懸浮液中，其中設(shè)有不加復(fù)方依山紅提取物溶液的細(xì)胞懸浮液作為對(duì)照；
[0009] 4)、將步驟3)中加入了不同濃度復(fù)方依山紅提取物的細(xì)胞懸浮液進(jìn)行離心，分離 上清液a后，加入染色劑染色，染色后用醋酸清洗，再加入堿緩沖溶液后成溶液b，最后測(cè)試 所述溶液b的吸光值A(chǔ)及測(cè)試所述上清液a的吸光值A(chǔ)1;將步驟3)中不加復(fù)方依山紅提取物 的細(xì)胞懸浮液進(jìn)行離心，分離上清液c后，加入染色劑染色，染色后用醋酸清洗，再加入堿緩 沖溶液后成溶液d，測(cè)試所述溶液d的吸光值知及測(cè)試所述上清液c的吸光值A(chǔ)3;
[0010] 5)、通過(guò)測(cè)試所述溶液b的吸光值A(chǔ)及所述上清液a的吸光值^，所述溶液d的吸光 值知及所述上清液c的吸光值A(chǔ)3來(lái)計(jì)算HepG2.2.15細(xì)胞的存活率及不同濃度復(fù)方依山紅提 取物對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌的HBsAg與HBeAg的抑制率;確定不同濃度復(fù)方依山紅提取物 對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的藥效，其中所述HepG2.2.15細(xì)胞的存活率=(A/A2)X100 %，不同濃 度復(fù)方依山紅提取物對(duì)ifepG2.2.15細(xì)胞分泌的HBsAg與HBeAg的抑制率=^/%)X100%。 [0011]優(yōu)選的是，所述配置不同濃度的復(fù)方依山紅提取物溶液為:取復(fù)方依山紅提取物， 溶于無(wú)菌去離子水，制成濃度為 0 · 00032mg/L、0 · 0016mg/L、0 · 08mg/L、0 · 04mg/L、0 · 2mg/L、 lmg/L的復(fù)方依山紅提取物溶液。
[0012] 優(yōu)選的是，所述復(fù)方依山紅提取物制備方法:復(fù)方依山紅由重量份的壯藥材滿(mǎn)山 紅20、毛雞骨草20、牛大力10、田基黃10、黃根5組成，分別取4份所述復(fù)方依山紅，每份65g， 將所述4份復(fù)方依山紅分別用95wt%乙醇、60wt%乙醇、30wt%乙醇、水作為提取溶劑，每種 溶劑回流提取三次，合并提取液，減壓干燥后分別得四種復(fù)方依山紅提取物，不同濃度的醇 萃取復(fù)方依山紅提取物，能夠更好的確定復(fù)方依山紅提取物對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞作用的有 效部位。
[0013] 優(yōu)選的是，所述RPM11640培養(yǎng)基含有遺傳霉素濃度為360-400mg/L、胎牛血清的重 量百分比為8-12 %、谷氨酰胺的濃度為l-3mmol/L、青鏈霉的重量百分比為0.5-2 %和 NaHC03的重量百分比為2-8 %，所述RPM11640培養(yǎng)基的PH值為7.4-7.6，適合HepG2.2.15細(xì) 胞培養(yǎng)，能快速高效培養(yǎng)出ifepG2.2.15細(xì)胞，并且活細(xì)胞數(shù)大于90%。
[0014] 優(yōu)選的是，步驟2)中所述形成細(xì)胞懸液后計(jì)算細(xì)胞總數(shù)，活細(xì)胞數(shù)量不少于細(xì)胞 總數(shù)的90%，所述Η印G2.2.15細(xì)胞濃度為0.5X105個(gè)/mL-1.5X105個(gè)/mL。
[0015] 優(yōu)選的是，采用自動(dòng)酶標(biāo)儀在吸收波長(zhǎng)為515nm條件下測(cè)試所述溶液b的吸光值A(chǔ) 及所述溶液d的吸光值A(chǔ)2,在吸收波長(zhǎng)為450nm條件下測(cè)試所述上清液a的吸光值^及所述上 清液c的吸光值A(chǔ)3。
[0016] 本發(fā)明至少包括以下有益效果：
[0017] (1)本發(fā)明通過(guò)測(cè)試并計(jì)算HepG2.2.15細(xì)胞的存活率及不同濃度復(fù)方依山紅提 取物對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌的HBsAg與HBeAg的抑制率;確定不同濃度復(fù)方依山紅提取物 對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的藥效;能客觀靈敏的反應(yīng)復(fù)方依山紅藥效，且本發(fā)明的檢測(cè)方法簡(jiǎn)單 易操作，有利于檢測(cè)的規(guī)范化。
[0018] (2)本發(fā)明提供了一種檢測(cè)復(fù)方依山紅提取物對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的藥效的方法， 通過(guò)復(fù)方依山紅提取物對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的藥效，能客觀地確定復(fù)方依山紅提取物的質(zhì) 量及通過(guò)不同濃度醇提取的復(fù)方依山紅提取物測(cè)試其對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的藥效，能夠更 好的確定復(fù)方依山紅提取物對(duì)ifepG2.2.15細(xì)胞作用的有效部位。
[0019] 本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)、目標(biāo)和特征將部分通過(guò)下面的說(shuō)明體現(xiàn)，部分還將通過(guò)對(duì)本 發(fā)明的研究和實(shí)踐而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 結(jié)合下面實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說(shuō)明書(shū) 文字能夠據(jù)以實(shí)施。
[0021] 實(shí)施例1
[0022] 一種檢測(cè)復(fù)方依山紅提取物對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的藥效的方法，所述檢測(cè)方法包 括以下步驟：
[0023] 1)、配置不同濃度的復(fù)方依山紅提取物溶液；
[0024] 2)、將HepG2.2.15細(xì)胞接種到RPM1-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)形成細(xì)胞懸浮液；
[0025] 3)、依次將步驟1)中所述的不同濃度復(fù)方依山紅提取物溶液分別加入到所述細(xì)胞 懸浮液中，其中設(shè)有不加復(fù)方依山紅提取物溶液的細(xì)胞懸浮液作為對(duì)照；
[0026] 4)、將步驟3)中加入了不同濃度復(fù)方依山紅提取物的細(xì)胞懸浮液進(jìn)行離心，分離 上清液a后，加入染色劑染色，染色后用醋酸清洗，再加入堿緩沖溶液后成溶液b，最后測(cè)試 所述溶液b的吸光值A(chǔ)及測(cè)試所述上清液a的吸光值A(chǔ)1;將步驟3)中不加復(fù)方依山紅提取物 的細(xì)胞懸浮液進(jìn)行離心，分離上清液c后，加入染色劑染色，染色后用醋酸清洗，再加入堿緩 沖溶液后成溶液d，測(cè)試所述溶液d的吸光值知及測(cè)試所述上清液c的吸光值A(chǔ)3;
[0027] 5)、通過(guò)測(cè)試所述溶液b的吸光值A(chǔ)及所述上清液a的吸光值^，所述溶液d的吸光 值知及所述上清液c的吸光值A(chǔ)3來(lái)計(jì)算HepG2.2.15細(xì)胞的存活率及不同濃度復(fù)方依山紅提 取物對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞分泌的HBsAg與HBeAg的抑制率;確定不同濃度復(fù)方依山紅提取物 對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的藥效，其中所述HepG2.2.15細(xì)胞的存活率=(A/A2)X100 %，不同