用于人外周血循環(huán)腫瘤DNA中Her2基因擴(kuò)增的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于人外周血循環(huán)腫瘤DNA中Her2基因擴(kuò)增檢測的試劑盒。本發(fā)明所述試劑盒的組份設(shè)置及其結(jié)果判讀方案使得檢測過程簡便，可操作性強(qiáng)。檢測結(jié)果可靠、特異性好，同時(shí)利用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，通過計(jì)算ΔCt值對(duì)乳腺癌組織標(biāo)本中的HER2基因擴(kuò)增水平進(jìn)行檢測，可用于通過血液ctDNA檢測進(jìn)行乳腺癌輔助診斷，臨床以及預(yù)后等多個(gè)研究領(lǐng)域。
【專利說明】
用于人外周血循環(huán)腫瘤DNA中Her2基因擴(kuò)増的試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種人外周血循環(huán)腫瘤DNA中化r2基因擴(kuò)增 的檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年上升。在歐美國家，乳腺癌占 女性惡性腫瘤的25%-30%。20世紀(jì)末的統(tǒng)計(jì)資料表明全世界每年約有130萬人診斷為乳腺 癌，而有40萬人死于該病。在我國許多大城市，乳腺癌發(fā)病率已經(jīng)上升為女性惡性腫瘤的第 一或第二位，死亡率占第四位或第五位，成為婦女健康的最大威脅。
[0003] 表皮生長因子受體-2化pidermal growth factor recepto;r-2,皿R2),是一種位 于乳腺和乳腺癌細(xì)胞表面的受體，能夠控制癌細(xì)胞的生長、浸潤和癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，大約20% 的乳腺癌病例中存在皿R2基因和/或蛋白水平增加，它是乳腺癌的獨(dú)立預(yù)后因子，在乳腺癌 的祀向治療和預(yù)后判斷中的作用已經(jīng)得到了全世界臨床醫(yī)生的認(rèn)可。肥R2陽性的腫瘤是一 種高危腫瘤，皿R2癌基因的擴(kuò)增預(yù)示病情進(jìn)展迅速，局部復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)性高，化療緩解期短， 無病生存期(DFS)和總生存期(0S)縮短，對(duì)某些常規(guī)的化療和激素治療反應(yīng)性差。目前最為 常用并經(jīng)FDA批準(zhǔn)的適用于治療肥R2過度表達(dá)或皿R2基因擴(kuò)增的乳腺癌的藥物是曲妥珠單 抗(赫賽?。?，由于運(yùn)種藥物只有針對(duì)皿R2基因擴(kuò)增和蛋白過度表達(dá)的病人才有效，因此準(zhǔn) 確評(píng)價(jià)肥R2基因和蛋白水平至關(guān)重要。
[0004] 鑒于皿R2基因在乳腺癌診斷和治療上的指導(dǎo)意義，采用靈敏、有效的方法對(duì)它進(jìn) 行檢測顯得極其重要。目前，檢測肥R2的方法主要有化154、1肥^15山(：1甜、1?1'斗0?等，其中 臨床最常用的是IHC法和FI甜法，而IHC法是檢測皿R2的蛋白表達(dá)水平，F(xiàn)ISH法是檢測肥R2 的基因擴(kuò)增水平。國內(nèi)大部分醫(yī)院已經(jīng)開展了皿R2I肥檢測，該方法簡便易行、價(jià)格低廉、但 易受多種因素的影響。國外探針試劑盒及祀向藥物(赫賽汀)較昂貴，F(xiàn)ISH技術(shù)要求較高，而 國內(nèi)各醫(yī)療單位乳腺癌肥R2檢測的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性和完整性尚不盡人意。
[0005] 外周血循環(huán)腫瘤核酸中可檢測到與乳腺癌細(xì)胞一致的基因突變。運(yùn)些基因突變的 檢測可W為乳腺癌的分期及藥物的治療和預(yù)后提供豐富的信息。因此，外周血循環(huán)腫瘤DNA 的化r2基因擴(kuò)增檢測為乳腺癌的早期診斷和治療提供的很好的研究方向。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 鑒于上述問題，提出了本發(fā)明，W便提供一種克服上述問題或者至少部分地解決 上述問題的用于外周血循環(huán)腫瘤核酸DNA中化r2基因擴(kuò)增的檢測試劑盒。
[0007] 在第一方面，本發(fā)明提供了一種人外周血循環(huán)腫瘤DNA中化r2基因擴(kuò)增檢測的試 劑盒，所述試劑盒包括:祀向化r2基因目的位點(diǎn)的特異引物、Her2基因特異性水解探針、內(nèi) 參基因的引物和內(nèi)參基因的水解探針。
[000引在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述化r2基因目的位點(diǎn)為化r2基因共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血 管擴(kuò)張突變ATM區(qū)。
[0009] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述內(nèi)參基因?yàn)镚APDH、β-ac t i η、B2M、SDHA、HPRT1中 的一種或者多種。
[0010] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述化r2基因目的位點(diǎn)的特異引物分別為：
[0011 ]正向引物：5'-ggctccagagcccacaggc-3'沈Q ID NO: 1;
[0012] 反向引物：5'-tttgttgagccaaacaaagttctctgt-3'沈Q ID N0:2。
[0013] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述化r2基因特異性水解探針為5 ' -ccctcactga tcttgccttc cttgctctcc acccctgacc-3'SEQ ID NO:3。
[0014] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述內(nèi)參基因的引物選自w下引物對(duì)：
[0015] 5'一tt 邑邑 attt 邑邑 atatttttatt 邑 taaaa - 3'SEQ ID N0:4和5'一 曰曰ttcggc曰曰曰曰c曰ccc曰曰曰c曰ccc曰-3'SEQ ID NO:5；
[0016] 5'一taatttgtgtgtgtgtttattggtttg-3'SEQ ID N0:6和5'一 cctcc曰ccc曰曰ttc曰曰曰g曰曰c曰cc曰曰-3'SEQ ID NO:7；
[0017] 5'一tttatattattataatggaaagtatg - 3'SEQ ID N0:8和5'一 曰tttc曰曰t曰曰gt曰曰曰曰曰曰c曰曰曰曰曰曰曰c-3'SEQ ID NO:9；
[0018] 5'一gtggttagagttaatattatatagtatg - 3'SEQ ID N0:10^R5'一 aaa1:a1:actat1:aacaa1:aaccaccat-3 ' SEQ ID NO: 11; W及
[0019] 5'一邑attata 邑ata 邑邑邑邑 t 邑a 邑a 邑aaa 邑a - 3'SEQ ID NO: 12和5'一 ctt曰t曰g曰t曰ggggtg曰g曰g曰曰曰g曰-3'SEQ ID NO :13〇
[0020] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述內(nèi)參基因的水解探針選自5'- ctaacctttaaaatcaaat-3'沈Q ID NO 14、5'-aaatacacacaaacgttca-3'沈Q ID N0:15、5'- aacatttactagaaataat-3'沈Q ID N0:16、5'-taatattacacataaccac-3'SEQ ID N0:17、5,- accacaaataa1:acacatcc-3'沈Q ID NO: 18中的任一個(gè)。
[0021] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述化r2基因的探針和內(nèi)參基因的探針5'端報(bào)告巧 光基團(tuán)分別選自FAM、TET、肥X、TAMRA、Texas Red、Rox和C巧中的一種。
[0022] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述化r2基因的探針和內(nèi)參基因的探針3'端的澤滅 基團(tuán)分別選自B冊(cè)1、B冊(cè)2、TAMRA和DABCTL中的一種。
[0023] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述試劑盒中還包含陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品和無 模板對(duì)照。
[0024] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述陽性質(zhì)控品為乳腺癌化r2陽性基因組DNA、所述 陰性質(zhì)控品為健康人全基因組DNA。
[0025] 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述試劑盒中，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的終濃度組成為：1 ~10XPCR緩沖液、0.1 ~ImM dNTPs、0.01 ~0. lOU/ul TaqDNA聚合酶、1 ~5mM氯化儀。
[0026] 在第二方面，本發(fā)明提供如第一方面所述的試劑盒在制備用于擴(kuò)增人外周血循環(huán) 腫瘤DNA中化r2基因的藥物中的用途。
[0027] 有益效果：
[0028] 1、本發(fā)明通過化r2基因與內(nèi)參基因 PCR擴(kuò)增結(jié)果的計(jì)算，來對(duì)檢測結(jié)果給出判定， 提高了檢測結(jié)果的敏感性和可靠性。Her2基因與內(nèi)參基因 PCR擴(kuò)增結(jié)果指其Ct值，即Her2基 因與內(nèi)參基因的巧光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的闊值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。通過化r2基因與內(nèi)參基因 PCR擴(kuò)增結(jié)果的計(jì)算來對(duì)檢測結(jié)果給出判定的方式是:Her2基因 Ct《32,判定結(jié)果：陽性； 化r2基因 Ct〉32,化r2基因 Ct-內(nèi)參基因 Ct《8,判定結(jié)果：陽性;Ct〉32,化r2基因 Ct-內(nèi)參基因 Ct〉8,判定結(jié)果：陰性。
[0029] 2、本發(fā)明利用循環(huán)腫瘤DN的化r2基因模板非特異性擴(kuò)增，提高了其靈敏度，可W在 循環(huán)腫瘤DNA中檢測化r2基因狀況，操作簡單。通過目的基因與內(nèi)參基因 PCR擴(kuò)增結(jié)果的計(jì) 算，來對(duì)檢測結(jié)果給出判定，提高了檢測結(jié)果的敏感性和可靠性。
[0030] 3、本申請(qǐng)與直接測序法的不同之處在于此申請(qǐng)所用方法為直接通過PCR(聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng))得到的巧光信號(hào)直接判斷化r2基因狀態(tài);而直接測序法需要通過PCR對(duì)目標(biāo)區(qū)域 擴(kuò)增后進(jìn)行測序反應(yīng)方能得到化r2基因的狀態(tài)。
[0031] 4、本發(fā)明所述試劑盒的組份設(shè)置及其結(jié)果判讀方案使得檢測過程簡便，可操作性 強(qiáng)。檢測結(jié)果可靠、特異性好。
[0032] 上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段， 而可依照說明書的內(nèi)容予W實(shí)施，并且為了讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠 更明顯易懂，W下特舉本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，應(yīng)理解，運(yùn)些實(shí)施例僅用于說明本發(fā) 明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后本領(lǐng)域技術(shù) 人員可W對(duì)本發(fā)明做各種改動(dòng)或修改，運(yùn)些等價(jià)同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的 范圍。
[0034] 實(shí)施例1:
[0035] 材料:待檢血漿樣本、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品。所述陽性質(zhì)控品為乳腺癌患者基 因組DNA，所述陰性質(zhì)控品為正常人類基因組DNA。
[0036] 所用引物和探針:化r2基因目的位點(diǎn)引物:SEQ ID N0:1和沈Q ID N0:2;化r2基因 特異的水解探針SEQ ID N0:3;內(nèi)參基因的引物SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:5;內(nèi)參基因的水 解探針SEQ ID NO: 14,其中化r2基因目的位點(diǎn)引物和探針都是根據(jù)化r2基因共濟(jì)失調(diào)毛細(xì) 血管擴(kuò)張突變ATM區(qū)SEQ ID NO: 19設(shè)計(jì)并篩選的。所有引物和探針純度應(yīng)達(dá)到電泳級(jí) (PAGE)或HPLC級(jí)，不含雜帶。提供合成機(jī)構(gòu)出具的合成產(chǎn)物的質(zhì)檢證明，如PA(iE電泳結(jié)果或 HPLC分析圖譜，證明使用PAGE或者HPLC純化后應(yīng)有明顯單峰PAGE或者HPLC純化圖譜，濃度 為long/μL備用。
[0037] 儀器:Lighixycler 480、nano化op 1000、高速離屯、機(jī)、水浴鍋、縱滿震蕩儀、冰箱、 烘箱、滅菌鍋。
[003引試劑：循環(huán)腫瘤DNA提取試劑盒（上海醫(yī)脈賽科）、DNA聚合酶（羅氏公司）、10XPCR Buffer(羅氏公司）、MgC12(羅氏公司）、dNTP(TaKaRa)、純化水。
[0039] (1)循環(huán)腫瘤DNA的提取
[0040] 采用上海醫(yī)脈賽科技有限公司的循環(huán)腫瘤DNA提取試劑盒提取病人循環(huán)腫瘤DNA, 具體步驟如下：
[0041 ] A、血漿樣品至2ml離屯、管中，加入蛋白消化液A、蛋白酶K、37°C恒溫解30min。B、加 入核酸結(jié)合液、DNA提取磁珠，混合后加入Solutio址R，置于旋轉(zhuǎn)混和儀，溫和和混勻25min。
[0042] C、用磁分離架吸附磁珠 Imin，棄上清。
[0043] D、加入洗涂液I洗涂磁珠兩次。
[0044] E、加入洗涂液II洗涂磁珠兩次。
[0045] F、吸附磁珠，棄上清后靜置3-6min。
[0046] G、加入洗脫液，置于室溫，混和均勻洗脫5min。
[0047] Η、磁場吸附磁珠，回收含基因組DM的洗脫液。
[0048] I、通過微量DNA定量對(duì)樣品中獲得的DNA含量進(jìn)行定量測定。
[0049] J、將上述獲得的循環(huán)腫瘤DNA作為模板。
[0050] (2)PCR反應(yīng)的體系和反應(yīng)條件
[0化1 ] 所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的終濃度組成為：1~10XPCR緩沖液、0.1~ImM dNTPs、0.1 ~luM Her2基因引物、0 . 1~luM內(nèi)參基因引物0.05~2ng/ul模板DNA、0 . 1~luM Her2Taqman水解探針、0.1~luM內(nèi)參基因 Taqman水解探針、0.01~0. lOU/ul TaqDNA聚合 酶、1~5mM氯化儀。
[0052] 所述檢測基因?yàn)榛痳基因、所述內(nèi)參基因?yàn)镚APDH。所述化r2基因的探針和內(nèi)參基 因的探針5/端報(bào)告巧光基團(tuán)為FAM;所述化r2基因的探針和內(nèi)參基因的探針y端的澤滅基 團(tuán)為B冊(cè)1。
[0053]所述dNTPs中包括lOmM dATPUOmM dCTP、10mM dTTP和lOmM dGTP，所述PCR體系中 包含Tris · Cl、氯化鐘、硫酸儀和氯化儀。
[0054] 所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的具體過程為:92~97°C預(yù)變性5~35分鐘，再進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)?反應(yīng)擴(kuò)增階段，92~97°C變性10~30s，50~65°C退火10~30s，并進(jìn)行35~55個(gè)循環(huán)。
[0055] (3)PCR反應(yīng)的加樣布局(見表1)
[0056] 待測DNA樣品、陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品和無模板對(duì)照均進(jìn)行3個(gè)復(fù)孔檢測，PCR儀 96孔板加樣布局見下表。表中PC代表陽性質(zhì)控品（Positive Control)，NC代表陰性質(zhì)控品 (Negative Control)，NTC代表無模板對(duì)照（No template control)，S代表檢測樣本 (sample)。
[0化7] 表1
[0化引 ____
[0059] 實(shí)驗(yàn)結(jié)束W后，按W下步驟進(jìn)行檢測結(jié)果的分析、判定:
[0060] 進(jìn)行無模板對(duì)照(NTC)的擴(kuò)增曲線分析，Her2基因和內(nèi)參基因（最優(yōu)選:ACTB)此時(shí) 應(yīng)無擴(kuò)增曲線明顯擴(kuò)增信號(hào)，說明實(shí)驗(yàn)無污染，可W繼續(xù)分析。
[0061] 質(zhì)控品的內(nèi)參基因（ACTB)應(yīng)均有擴(kuò)增信號(hào)，且呈S型擴(kuò)增曲線，質(zhì)控品內(nèi)參基因 (ACTB)的CP值應(yīng)符合下表中參數(shù)范圍；陰性質(zhì)控品的化r2基因應(yīng)無明顯擴(kuò)增曲線變化，陽 性控品化r2的CP值應(yīng)符合下表中質(zhì)控品的參數(shù)范圍。質(zhì)控品檢測滿足W上條件時(shí)，證明實(shí) 驗(yàn)有效，可繼續(xù)分析。
[0062] 樣本的內(nèi)參基因（ACTB)應(yīng)均有擴(kuò)增信號(hào)，且呈S型擴(kuò)增曲線，樣本單個(gè)PCR檢測結(jié) 果應(yīng)按照表2樣本檢測-單個(gè)PCR結(jié)果判讀。
[0063] 表 2
[0064]
[0065] 若不符合表2中的1、2項(xiàng)要求，則建議重新檢測。
[0066] 在W上實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，均按照常規(guī)條件，例如按照分子克 隆實(shí)驗(yàn)指南（第Ξ版，J.薩姆布魯克等著）中所述的條件或制造廠商所建議的條件進(jìn)行操 作。
[0067] 臨床實(shí)施例:
[0068] a)樣本選擇依據(jù)
[0069] 樣本為經(jīng)病理學(xué)檢查確診為浸潤性乳腺癌患者的石蠟包埋組織切片。
[0070] b)入選標(biāo)準(zhǔn)
[0071 ] 1.臨床上已確診的浸潤性乳腺癌患者；
[0072] 2.可獲得足夠病理標(biāo)本；
[0073] 3.有免疫組化法（1肥)測定結(jié)果
[0074] C)排除標(biāo)準(zhǔn)和剔除標(biāo)準(zhǔn)
[0075] 1.FI甜雜交片不可讀；
[0076] 2.相鄰組織切片肥染色光鏡下見浸潤性乳腺癌細(xì)胞數(shù)量少；
[0077] 3.內(nèi)對(duì)照組呈現(xiàn)非預(yù)想結(jié)果；
[007引 4.FISH信號(hào)不均一(一致性<75%);
[0079] 5.出現(xiàn)背景彌散信號(hào)(>10%信號(hào)位于細(xì)胞漿）；
[0080] 6.酶消化過度(核分辨不清、持續(xù)性自發(fā)巧光）；
[0081 ] 7.細(xì)胞核輪廓不清或有重疊；
[0082] 8.未按照說明書中的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行操作，比如未用中性緩沖甲醒固定、固定少于 化或多于4她；
[008；3 ] d )、樣本采集、保存、運(yùn)輸方法等
[0084]樣本采集為浸潤性乳腺癌患者的石蠟標(biāo)本，于10%的中性福爾馬林固定24-48小 時(shí)。切片厚度4μπι，在室溫中至少可W保存一年。運(yùn)輸過程中，不得劇烈震蕩，W免影響檢測 結(jié)果。
[00化]e)判定標(biāo)準(zhǔn)
[0086] 每例乳腺癌樣本在浸潤性癌區(qū)域，隨機(jī)計(jì)數(shù)30個(gè)癌細(xì)胞核中的雙色信號(hào)。W皿R- 2/CEP17比值作為肥R-2的擴(kuò)增定量標(biāo)準(zhǔn)。皿R-2/CEP17〉2.2,提示擴(kuò)增陽性;肥R-2/CEP17< 1.8,提示擴(kuò)增陰性;二者比值介于1.8~2.2之間，為可疑結(jié)果;此時(shí)可選擇增加細(xì)胞計(jì)數(shù)至 50個(gè)或由另外一個(gè)分析者重新計(jì)數(shù)，若仍為臨界值則在FISH檢測報(bào)告中注明或重復(fù)進(jìn)行 FI甜或I肥檢測。
[0087] 4、15例樣本的檢測結(jié)果顯示，本發(fā)明檢測結(jié)果準(zhǔn)確度與臨床金標(biāo)檢測結(jié)果完全一 致。 Γ00881
[0089] 對(duì)比例:
[0090] 探針GEP17/GLP 肥R2
[0091] 1、對(duì)比例來源
[0092] 購于美國Creative Diagnostic公司，美國Creative Bioarray公司
[0093] 2、主要原材料確定依據(jù)
[0094] (1)質(zhì)理標(biāo)準(zhǔn)
[00M]①生產(chǎn)商提供的技術(shù)指標(biāo)
[0096]
[0097] ②適用于本產(chǎn)品的技術(shù)要求
[0098] 性狀要求:粉色液體
[0099] 靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性均能達(dá)到本實(shí)驗(yàn)的要求。
[0100] (2)試驗(yàn)設(shè)計(jì)
[0101] 探針質(zhì)量是決定FISH實(shí)驗(yàn)是否成功的關(guān)鍵因素。探針的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性 是選擇探針的主要指標(biāo)。我們通過對(duì)不同公司探針(GEP17，GLP皿R2)的靈敏度、特異性和 穩(wěn)定性檢測，來選擇探針來源。
[0102] ①靈敏度
[0103] 在陰性參考片中分析50個(gè)中期分裂相，應(yīng)該有至少98條17號(hào)染色體著絲粒位置顯 示綠色巧光;至少98條肥R-2/neu基因（17ql2)的位置顯示紅色巧光。
[0104] ②特異性
[0105] 陰性參考片N1中期分裂相，要求應(yīng)無任何染色體位點(diǎn)之間的交叉雜交現(xiàn)象；雜交 只出現(xiàn)在巧巾探針預(yù)期的祀?yún)^(qū)域中。
[0106] ③準(zhǔn)確性
[0107] 將探針與3張陰性參考片N2~N4、3張陽性參考片P1~P3進(jìn)行雜交，在顯微鏡下觀 察結(jié)果。根據(jù)結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)，其符合率應(yīng)為100 %。
[010引（3)試驗(yàn)結(jié)果
[0109] 表1不同廠家探針選擇試驗(yàn)結(jié)果對(duì)比
[0110]
[0111]
【申請(qǐng)人】聲明，本發(fā)明通過上述實(shí)施例來說明本發(fā)明的詳細(xì)特征W及方法，但本發(fā) 明并不局限于上述詳細(xì)特征W及方法，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細(xì)特征W及方法 才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)，對(duì)本發(fā)明所選用材料 和步驟的等效替換W及輔助材料和步驟的增加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù) 范圍和公開范圍之內(nèi)。




【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種人外周血循環(huán)腫瘤DNA中Her2基因擴(kuò)增檢測的試劑盒，所述試劑盒包括：靶向 Her2基因目的位點(diǎn)的特異引物、Her2基因特異性水解探針、內(nèi)參基因的引物和內(nèi)參基因的 水解探針。2. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其中所述Her2基因目的位點(diǎn)為Her2基因共濟(jì)失調(diào)毛細(xì) 血管擴(kuò)張突變ATM區(qū)。3. 如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其中所述內(nèi)參基因?yàn)镚APDH、f3-actin、B2M、SDHA、 HPRT1中的一種或者多種。4. 如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其中所述Her2基因目的位點(diǎn)的特異引物分別為： 正向引物：SEQ ID N0:1; 反向引物：SEQ ID N0:2。5. 如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其中所述Her2基因特異性水解探針為SEQ ID N0:3。6. 如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其中所述內(nèi)參基因的引物選自以下引物對(duì):SEQ ID NO: 4和5、SEQIDN0:6和7、SEQIDN0:8和9、SEQIDN0:10和11以及SEQIDN0:12和13。7. 如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其中所述內(nèi)參基因的水解探針選自SEQ ID NO 14-18中 的任一個(gè)。8. 如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其中所述Her2基因的探針和內(nèi)參基因的探針5'端報(bào) 告熒光基團(tuán)分別選自FAM、TET、HEX、TAMRA、Texas Red、Rox和Cy5中的一種。9. 如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其中所述Her2基因的探針和內(nèi)參基因的探針3'端的 淬滅基團(tuán)分別選自BHQ1、BHQ2、TAMRA和DABCYL中的一種。10. 如權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其中所述試劑盒中還包含陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品 和無模板對(duì)照。11. 如權(quán)利要求10所述的試劑盒，其中所述陽性質(zhì)控品為乳腺癌Her2陽性基因組DNA、 所述陰性質(zhì)控品為健康人全基因組DNA。12. 如權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的試劑盒在制備用于擴(kuò)增人外周血循環(huán)腫瘤DNA中 Her 2基因的藥物中的用途。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK106011239SQ201610341102
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年5月19日
【發(fā)明人】章文羿, 李晶, 崔航, 黃清瑞
【申請(qǐng)人】北京安必奇生物科技有限公司