一種用于檢測her-2基因擴(kuò)增的探針和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種用于檢測HER-2基因擴(kuò)增的FISH試劑 盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 人表皮生長因子受體 2(humanepidermalgrowthfactorreceptor_2，HER-2)基 因位于染色體17ql2_q21，是表皮生長因子受體（EGFR)家族成員，其編碼蛋白具有酪氨酸 蛋白激酶活性，與EGFR高度同源。研究證實(shí)，HER-2介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)與多種腫瘤的形成、增 殖、轉(zhuǎn)移、侵襲及放化療耐藥有關(guān)。以往其相關(guān)研究多集中于乳腺癌和卵巢癌。近年的研究 顯示，HER-2在胃癌中也存在高表達(dá)，有望成為一個(gè)新的基因治療靶點(diǎn)。
[0003] 體外細(xì)胞培養(yǎng)研究顯示，在乳腺癌細(xì)胞中，HER-2基因拷貝數(shù)明顯增加，HER-2的 過度表達(dá)促進(jìn)了乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和惡性轉(zhuǎn)化。在HER-2過表達(dá)的乳腺癌中，90%以上具 有基因擴(kuò)增，提示基因擴(kuò)增是多數(shù)乳腺癌HER-2過表達(dá)的前提。最新研究表明，25%~30% 的原發(fā)性浸潤性乳腺癌存在HER-2基因擴(kuò)增和蛋白過表達(dá)的現(xiàn)象。HER-2的高表達(dá)可提高 乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能，ffiR-2擴(kuò)增和隨后的基因產(chǎn)物過表達(dá)已經(jīng)成為乳腺癌預(yù)后和治療 的標(biāo)記。胃癌中存在HER-2基因過表達(dá)于1986年首次被報(bào)道。在胃癌中，HER2過表達(dá)所 占的比例波動在6%~35%之間。截至目前，大量臨床均證實(shí)HER2蛋白在胃癌中是重要的 預(yù)后指標(biāo)。近年來，隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，以HER-2為靶點(diǎn)的靶向治療藥物一一曲妥珠單抗 (羅氏制藥，中文商品名：赫賽?。?。該藥物用于治療HER-2高表達(dá)的乳腺癌患者，不僅顯著 減少了腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率，也提高了患者的生存質(zhì)量。隨機(jī)對照臨床研究已證實(shí)，抗J1ER2 單克隆抗體曲妥珠單抗聯(lián)合化療在ffiR2過表達(dá)晚期胃癌中的療效顯著優(yōu)于單純化療。赫 賽汀以HER-2為治療靶點(diǎn)，若要篩選可受益于赫賽汀治療的患者，必須進(jìn)行HER-2基因檢 測。
[0004] 目前，臨床上檢測HER-2狀態(tài)的常用方法有免疫組織化學(xué)法 (immunohistochemistry,IHC)和焚光原位雜交法(fluorescenceinsitu hybridization，F(xiàn)ISH)。IHC是基于抗體在蛋白（基因產(chǎn)物）水平上檢測HER-2的狀態(tài)，該 法易于開展，已被廣泛使用，但技術(shù)本身受組織固定、抗原修復(fù)、一抗的靈敏度和特異度、染 色結(jié)果評定等多種變量的影響，使得結(jié)果不夠準(zhǔn)確和穩(wěn)定，尤其對ffiR-2輕、中度表達(dá)的樣 本易產(chǎn)生假陰性。FISH是基于探針直接在DNA(基因）水平上檢測HER-2的狀態(tài)，該法靈 敏、準(zhǔn)確、可靠，結(jié)果具有高度的可重復(fù)性。但FISH依賴于制作的探針的質(zhì)量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測HER-2基因擴(kuò)增的FISH探針和試劑盒。本 試劑盒基于熒光原位雜交原理，采用雙熒光探針技術(shù)，用于檢測人類ffiR-2基因擴(kuò)增。試劑 盒由HER-2/CSP17探針和DAPI復(fù)染液兩種成分組成，HER-2基因由紅色信號指示，內(nèi)對照 CSP17由綠色信號指示。組織切片樣本經(jīng)過一系列預(yù)處理步驟后在雜交儀上與探針共變性、 雜交，然后在熒光顯微鏡下實(shí)現(xiàn)對樣本ffiR-2基因擴(kuò)增狀態(tài)的檢測。
[0006] 本發(fā)明HER-2/CSP17探針采用隨機(jī)引物法分別標(biāo)記HER-2DNA和CSP17DNA模 板序列而得，為熒光原位雜交雙色探針，所述的探針標(biāo)記時(shí)采用的HER-2DNA為克隆號為RP11-2456M7的BAC克隆，所述的探針標(biāo)記時(shí)采用的CSP17DNA為17號染色體著絲粒特異的 a-衛(wèi)星DNA，其序列為：
[0011] 探針敏感性
[0012] 分析50個(gè)處于中期分裂相的細(xì)胞的100條17號染色體，至少有98條（98% )染 色體分別顯示1個(gè)紅色熒光信號01ER2位點(diǎn)）和1個(gè)綠色熒光信號（CSP17著絲粒位點(diǎn)）。
[0013] 探針特異性
[0014] 分析50個(gè)處于中期分裂相的細(xì)胞的100條17號染色體，至少有98條（98% )染 色體在HER2基因位點(diǎn)區(qū)域和著絲粒位點(diǎn)區(qū)域分別顯示紅色熒光信號和綠色熒光信號。
[0015] 本發(fā)明的有益效果是：
[0016] 本發(fā)明基于熒光原位雜交原理，采用雙熒光位點(diǎn)特異性探針技術(shù)，可以快捷特異 地檢出FFPE樣本中的HER-2基因擴(kuò)增狀態(tài)，可以間接輔助臨床篩選出可受益于赫賽汀靶向 藥物治療的乳腺癌和胃癌患者，可以大大地降低醫(yī)療成本和費(fèi)用，減少醫(yī)療資源的浪費(fèi)，延 長部分患者生存期，提高患者生存質(zhì)量。本發(fā)明所用探針采用隨機(jī)引物法標(biāo)記，比活性高， 信號強(qiáng)，且本發(fā)明采用克隆號為RP11-2456M7的BAC克隆，以及17號染色體著絲粒特異的 a-衛(wèi)星DNA作為模板，申請人意外發(fā)現(xiàn)以該這兩個(gè)模板獲得的HER-2/CSP17探針，用于檢 測FFPE樣本的HER-2基因擴(kuò)增時(shí)，靈敏度、準(zhǔn)確性較國內(nèi)同類產(chǎn)品高，且結(jié)果穩(wěn)定。
【附圖說明】
[0017] 圖1實(shí)施例3HER-2基因FISH檢測陰性鏡檢圖
[0018] 圖2實(shí)施例3HER-2基因FISH檢測陽性（點(diǎn)狀擴(kuò)增）鏡檢圖
[0019] 圖3實(shí)施例3HER-2基因FISH檢測陽性（簇狀擴(kuò)增）鏡檢圖
[0020] 圖4實(shí)施例4HER-2基因FISH檢測陽性（簇狀擴(kuò)增）鏡檢圖
[0021] 圖5實(shí)施例4HER-2基因FISH檢測陽性（點(diǎn)狀擴(kuò)增）鏡檢圖
[0022] 圖6實(shí)施例4HER-2基因FISH檢測陰性鏡檢圖
【具體實(shí)施方式】
[0023] 以下結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)一步闡述。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于本發(fā)明而 不用于限制本發(fā)明的范圍。除非另有定義或說明，本專利所述的科學(xué)技術(shù)術(shù)語與本領(lǐng)域普 通技術(shù)人員所理解具有相同的含義。
[0024] 實(shí)施例1HER-2/CSP17探針的制備
[0025]使用InvitrogenBioPrimeDNALabelingSystemQnvitrogen18094-011)試劑 盒，采用隨機(jī)引物標(biāo)記法制備HER-2/CSP17探針，包括以下流程：
[0026] 1.在避光環(huán)境下標(biāo)記探針：從_20°C取出試劑盒和相關(guān)試劑，冰上解凍，解凍后瞬 時(shí)離心，然后放回冰上。探針標(biāo)記參考體系見表2。
[0027] 表2探針標(biāo)記參考體系
[0030] 該探針標(biāo)記時(shí)采用的HER-2BACDNA為克隆號RPl1-2546M7的BAC克隆，
[0031] 該探針標(biāo)記時(shí)采用的CSP17a-衛(wèi)星DNA序列為：
[0033] 具體操作如下：
[0034] 1?一步（冰上）
[0035]
[0039] 注：熒光素最后加，剩余的熒光素于_20°C避光保存。
[0040] 吹打混勻后，于PCR儀上37°C反應(yīng)3h以上，加入2. 5 y L Stop Buffer終止反應(yīng) 2-3min，醋酸鈉、乙醇沉淀和濃縮，重懸于5 y L CldH2O中2.瞬時(shí)離心后，取5 y L紅色熒光 探針、5 y L綠色熒光探針、5 y L lmg/mL人類Cot-lDNA、85 y L雜交液（比例為1:1:1:17)， 即成HER2/CSP17探針。
[0041] 2.-20 °C避光保存。
[0042] 實(shí)施例2試劑配制
[0043] (1)預(yù)處理液（pH 7.0)配制：稱22.6gNa2EDTA-2H20和6. 34gTris于800mL去 離子水中，溶解后調(diào)節(jié)pH至7. 0,并定容至1L。2-8°C密封保存12個(gè)月，若試劑出現(xiàn)混濁或 污染，請立即丟棄。
[0044] (2) 20XSSC溶液（pH7.0)配制：稱88g檸檬酸鈉和176g NaCl于800mL去離子水 中，溶解后調(diào)節(jié)PH至7. 0,并定容至1L。2-8°C密封保存12個(gè)月，若試劑出現(xiàn)混濁或污染， 請立即丟棄。
[0045] (3) 2XSSC溶液（pH7. 0)配制：用去離子水將20XSSC溶液稀釋10倍，調(diào)節(jié)pH至 7. 0。2-8 °C密封保存12個(gè)月，若試劑出現(xiàn)混濁或污染，請立即丟棄。
[0046] (4) 20mg/mL蛋白酶K母液配制：稱取IOOmg蛋白酶K干粉于5mL2XSSC溶液pH 7.0)中，輕輕搖動，不要渦旋混合，直至完全溶解。按每管400yL的量進(jìn)行分裝，-20°C儲 存，避免反復(fù)凍融。
[0047] (5)慢洗洗滌液配制：取40yLNP-40于40mL2XSSC溶液（pH7. 0)中，充分混 勻?，F(xiàn)配現(xiàn)用。
[0048] 快洗洗滌液配制：取120yLNP-40于40mL2XSSC溶液（pH7. 0)中，充分混勻。 現(xiàn)配現(xiàn)用。
[0049] (6) 70 %、85 %乙醇配制：分別將700mL、850mL無水乙醇用去離子水稀釋至 lOOOmL，室溫密封保存。試劑配制1個(gè)月后或用于處理20張玻片后應(yīng)丟棄，若試劑出現(xiàn)混 濁或污染，請立即丟棄。
[0050] 實(shí)施例3
[0051] 應(yīng)用一種用于檢測FFPE樣本中HER-2基因擴(kuò)增的FISH試劑盒檢測臨床樣本
[0052] 取2014年2月~2014年8月送我公司的80例臨床乳腺癌石蠟包埋組織切片樣 本進(jìn)行HER-2基因擴(kuò)增FISH檢測。檢測包括以下步驟：
[0053] 1、對FFPE樣本進(jìn)行預(yù)處理，具體包括以下步驟：
[0054] (1)烤片
[0055] (2)二甲苯脫蠟
[0056] (3)梯度乙醇水化
[0057] (4)預(yù)處理液處理20min
[0058] (5)蛋白酶K消化 5_15min。
[0059] (6)梯度乙醇逐步脫水
[0060] 2、在避光條件下，將探針與玻片上的待測組織進(jìn)行變性、雜交，具體包括以下步 驟：
[0061] (1)打開雜交儀，設(shè)定或選擇已保存的程序：85°C變性5min，37°C雜交過夜（12~ 16h) 〇
[0062] (2)將雜交儀的濕條用水浸濕，放入雜交儀中，使雜交在一定的濕度條件下進(jìn)行。
[0063] (3)取IOyL探針加在樣本中心區(qū)域，小心蓋上蓋玻片并壓緊，避免產(chǎn)生氣泡，然 后用封片膠（RUBBERCEMENT)封住蓋玻片。
[0064] (4)將玻片輕放于雜交儀中，啟