多重擴(kuò)增循環(huán)檢測的制作方法
【專利說明】多重擴(kuò)增循環(huán)檢測
[0001] 政府利益 本發(fā)明在國立衛(wèi)生研宄院授予的批準(zhǔn)號1U01AI082184下由政府支持完成。政府對本 發(fā)明具有一定的權(quán)利。
[0002] 相關(guān)申請的交叉引用 本申請要求2012年9月10日提交的標(biāo)題為"多重擴(kuò)增循環(huán)檢測"的美國臨時專利申 請?zhí)?1/699, 103的權(quán)益和優(yōu)先權(quán)，其整體通過引用結(jié)合到本文中。
[0003] 發(fā)明背景 在美國、加拿大和西歐，傳染病占人類死亡率的約7%，而在發(fā)展中地區(qū)，傳染病占人類 死亡率的超過40%。傳染病導(dǎo)致多種臨床表現(xiàn)。常見的明顯表現(xiàn)為發(fā)燒、肺炎、腦膜炎、腹瀉 和含血腹瀉。盡管身體表現(xiàn)提示一些病原體為病原并排除其它，仍剩余多種可能的病原體， 清楚的診斷常常需要進(jìn)行多個測定。用于診斷病原體的傳統(tǒng)微生物學(xué)技術(shù)可耗費(fèi)數(shù)日或數(shù) 周，常常延誤適當(dāng)?shù)寞煶獭?br>[0004] 近年來，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)已經(jīng)成為快速診斷傳染原的方法選擇。PCR可為診斷 傳染病的快速、靈敏和特異工具。使用PCR作為主要診斷方法的挑戰(zhàn)為可能致病微生物的 多樣性和一些病理標(biāo)本中所存在的生物的水平低。運(yùn)行大量PCR測定板（針對每種可能的 致病微生物為一個，其中多數(shù)預(yù)期為陰性）常常是不實(shí)際的。當(dāng)病原體核酸處于低濃度以 及需要大量樣品以收集足夠的反應(yīng)模板時該問題惡化。在一些情況下，樣品不足以測定所 有可能的病原。一種解決方案為運(yùn)行"多重PCR"，其中樣品在單個反應(yīng)中同時測定多個靶 標(biāo)。盡管已經(jīng)證明多重PCR在一些系統(tǒng)中有價值，但關(guān)于高水平多重反應(yīng)的健壯性和難以 清楚分析多個產(chǎn)物存在缺陷。為了解決這些問題，可隨后將測定分為多個二級PCR。將二級 反應(yīng)嵌套在初級產(chǎn)物內(nèi)常常增加健壯性。然而，此進(jìn)一步的操作可能很昂貴并且可導(dǎo)致污 染或其它問題。
[0005]FilmArray?(BioFireDiagnostics,Inc.，SaltLakeCity,UT)是為診斷市場 開發(fā)的用戶友好的、高度多重PCR系統(tǒng)。該單個樣品儀器接受整合樣品制備和嵌套多重PCR 的診斷"袋"。整合的樣品制備提供易用性，而高度多重PCR提供PCR靈敏性和同時檢驗(yàn)多 達(dá)30種不同生物的能力。該系統(tǒng)非常適合其中數(shù)種不同的病原體均表現(xiàn)出相似臨床癥狀 的病原體鑒定。當(dāng)前可得的診斷板包括用于上呼吸道感染的呼吸板和用于血流感染的血液 培養(yǎng)板。其它板處于開發(fā)中。
[0006]FilmArray板，以及與其它儀器一起使用的板中所靶向的許多生物通常在環(huán)境中 存在。盡管這樣的環(huán)境污染傾向于以顯著低于臨床相關(guān)樣品的濃度存在，但可能難以區(qū)分 環(huán)境污染和臨床感染。同樣，某些個體具有通過染色體整合的潛伏病毒感染，其中染色體整 合的病毒DNA可能引起或可能不引起臨床癥狀。具有用于測定陽性結(jié)果由臨床相關(guān)感染還 是由另一種核酸源引起的方法將是合乎需要的。 發(fā)明摘要
[0007] 本公開內(nèi)容涉及用于同時擴(kuò)增若干靶標(biāo)的方法，同時區(qū)分臨床相關(guān)擴(kuò)增和從其它 源例如從背景污染、擴(kuò)增反應(yīng)的交叉反應(yīng)性或染色體整合的擴(kuò)增。
[0008] 在本發(fā)明的一個方面，公開了用于鑒定樣品中存在多個靶核酸中的哪些的方法和 裝置。所公開的方法包括提供多個樣品孔（每個樣品孔擁有用于擴(kuò)增來自多個靶核酸序列 中的不同序列的基因座的引物）、向多個樣品孔中的每一個內(nèi)提供部分樣品、同時使多個樣 品孔經(jīng)受擴(kuò)增條件經(jīng)歷若干擴(kuò)增循環(huán)、檢測第一組多個樣品孔的每個中是否發(fā)生擴(kuò)增、使 多個樣品孔同時經(jīng)受擴(kuò)增條件經(jīng)歷若干額外擴(kuò)增循環(huán)、檢測第二組多個樣品孔的每個中是 否發(fā)生擴(kuò)增和通過鑒定其中發(fā)生擴(kuò)增的相應(yīng)孔鑒定樣品中存在的靶核酸。
[0009] 在另一個說明性的實(shí)施方案中，提供了方法區(qū)分樣品中染色體整合和臨床-相關(guān) 感染，說明性地包括提供具有樣品和用于從樣品擴(kuò)增靶核酸序列的引物的樣品孔、使樣品 孔經(jīng)受擴(kuò)增條件經(jīng)歷若干擴(kuò)增循環(huán)、檢測樣品孔中是否發(fā)生擴(kuò)增、使樣品孔經(jīng)受擴(kuò)增條件 經(jīng)歷若干額外擴(kuò)增循環(huán)和檢測樣品孔中是否發(fā)生擴(kuò)增。在某些說明性實(shí)例中，第一個檢測 步驟中的陽性判定可指示染色體整合，第一個檢測步驟中的陰性判定與第二個檢測步驟中 的陽性判定可指示臨床-相關(guān)感染。
[0010] 在又一個說明性實(shí)施方案中，提供了用于分析樣品中靶核酸的方法，包括 (a) 提供其中包含樣品和用于擴(kuò)增靶核酸的引物的樣品孔， (b) 使樣品孔經(jīng)受擴(kuò)增條件經(jīng)歷至少一個擴(kuò)增循環(huán)， (c) 產(chǎn)生所擴(kuò)增靶核酸的熔解曲線，和 (d) 重復(fù)步驟（b)和（c)。
[0011] 這些方法可進(jìn)一步包括測定熔解曲線的值，和通過鑒定熔解曲線的值超過預(yù)定值 的擴(kuò)增循環(huán)測定Cp。在說明性的實(shí)例中，該值可通過熔解曲線負(fù)導(dǎo)數(shù)的峰高或峰面積測定。
[0012] 在又一個實(shí)例中，提供了用于分析樣品中靶核酸的方法，包括 (a) 提供包含樣品、用于擴(kuò)增靶核酸的引物、對照核酸、用于擴(kuò)增對照核酸的引物和 dsDNA結(jié)合染料的樣品孔， (b) 使樣品孔經(jīng)受擴(kuò)增條件經(jīng)歷多個擴(kuò)增循環(huán)， (c) 產(chǎn)生所擴(kuò)增靶核酸和所擴(kuò)增對照核酸的熔解曲線， (d) 測定所擴(kuò)增靶核酸的值，和 (e) 重復(fù)步驟（b)、（c)和（d)。
[0013] 這樣的說明性方法還可包括使用步驟（d)中測定的值產(chǎn)生靶核酸的校準(zhǔn)擴(kuò)增曲 線和繪制校準(zhǔn)擴(kuò)增曲線或測定兩種核酸之間的相對濃度的步驟。
[0014] 本文中還提供反應(yīng)容器和裝置。本發(fā)明其它特征將會在考慮下列例示目前所認(rèn)為 的實(shí)施本發(fā)明的最佳模式的優(yōu)選實(shí)施方案的詳述后對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見。
[0015] 附圖簡述 圖1顯示本公開內(nèi)容的一個實(shí)施方案中所使用的說明性的袋。
[0016] 圖2A-B顯示三個不同循環(huán)后鮑曼不動桿菌（A.baumannii)的擴(kuò)增和恪解曲線。 圖2A顯示假陽性數(shù)據(jù)，圖2B顯示真陽性數(shù)據(jù)。
[0017] 圖3A-B顯示三個不同循環(huán)后熱帶念珠菌（C.tropicalis)的擴(kuò)增和恪解曲線。圖 3A顯示陰性樣品數(shù)據(jù)，圖3B顯示陽性樣品數(shù)據(jù)。
[0018] 圖4A-B顯示三個不同循環(huán)后金黃色葡萄球菌（S.aureus)的擴(kuò)增和恪解曲線。圖 4A顯示陰性樣品數(shù)據(jù)，圖4B顯示陽性樣品數(shù)據(jù)。
[0019] 圖5顯示用于檢測低負(fù)載樣品的說明性循環(huán)方案。
[0020] 圖6顯示說明性的擴(kuò)增曲線和截止熒光閾值。
[0021] 圖7顯示典型的兩步PCR方案期間可收集的說明性的溫度數(shù)據(jù)。變性/退火段期 間，溫度從基線值上升至最大值，隨后溫度降回基線。延伸段期間，溫度保持恒定。
[0022] 圖8顯示圖7的兩步PCR方案期間可收集的熒光數(shù)據(jù)的說明性的連續(xù)監(jiān)測。
[0023]圖9顯示兩個典型兩步PCR方案循環(huán)后可收集的熒光數(shù)據(jù)的說明性的連續(xù)監(jiān)測。 變性段期間，由于飽和dsDNA-結(jié)合染料從dsDNA釋放，熒光數(shù)據(jù)降低，與典型的熔解曲線相 似。延伸段期間，由于引物ssDNA片段引發(fā)并延伸為dsDNA片段，熒光數(shù)據(jù)上升。
[0024]圖10顯示若干個PCR循環(huán)變性段期間可收集的說明性的熒光數(shù)據(jù)的疊加。
[0025]圖11顯示若干個PCR循環(huán)變性段期間所收集的說明性的熒光數(shù)據(jù)的負(fù)一階導(dǎo)數(shù) 的疊加。
[0026] 圖12顯示包含對照核酸和未知濃度靶核酸的多重PCR反應(yīng)的典型擴(kuò)增曲線。
[0027] 圖13顯示包含對照核酸和靶核酸的多重PCR反應(yīng)的幾個循環(huán)的變性段期間可收 集的熒光數(shù)據(jù)的說明性的負(fù)一階導(dǎo)數(shù)的疊加。
[0028] 圖14顯示說明性的調(diào)整后的圖13對照和樣品核酸的實(shí)時PCR曲線。對通過在對 照窗口連續(xù)監(jiān)測PCR反應(yīng)所產(chǎn)生熔解曲線的負(fù)一階導(dǎo)數(shù)進(jìn)行積分，產(chǎn)生調(diào)整的對照核酸擴(kuò) 增曲線（實(shí)線）。對通過在靶窗口連續(xù)監(jiān)測PCR反應(yīng)所產(chǎn)生熔解曲線的負(fù)一階導(dǎo)數(shù)進(jìn)行積 分，產(chǎn)生調(diào)整的靶核酸擴(kuò)增曲線（虛線）。
[0029] 圖15例示了依照本公開內(nèi)容的方面的熱循環(huán)系統(tǒng)的示例性實(shí)施方案的方框圖。
[0030] 發(fā)明詳述 如本文所使用的，術(shù)語"a"、"an"和"the"定義為指一個或多個，并且包括復(fù)數(shù)，除非上 下文不合適。范圍在本文中可表述為從"約"一個特定值，和/或至"約"另一個特定值。術(shù) 語"約"在本文中用于指近似、在其區(qū)域內(nèi)、大致或大約。當(dāng)術(shù)語"約"與數(shù)字范圍結(jié)合使用 時，其通過擴(kuò)展所列數(shù)字值上面和下面的界限修飾該范圍。一般而言，術(shù)語"約"在本文中 用于修飾數(shù)值在所述值上和下達(dá)5%的差異。當(dāng)表述這樣的范圍時，另一個實(shí)施方案包括從 一個特定值和/或至其它特定值。相似地，當(dāng)值通過使用先詞"約"表述為近似值時，將理 解為該特定值形成另一個實(shí)施方案。將進(jìn)一步理解的是，每個范圍的端點(diǎn)相對于其它端點(diǎn) 均顯著，并且獨(dú)立于其它端點(diǎn)。
[0031] 如本文所使用的詞語"或"意指特定列表中的任何一個成員，并且還包括該列表中 成員的任何組合。
[0032] "樣品"意指如本文所述進(jìn)行測定的動物；動物的組織或器官；細(xì)胞（受試者體內(nèi)、 直接從受試者獲取或維持培養(yǎng)的細(xì)胞或來自培養(yǎng)的細(xì)胞系的細(xì)胞）；細(xì)胞裂解物（或裂解 物級分）或細(xì)胞提取物；