一種提高酪酸菌生長效率的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種提高酪酸菌生長效率的方法，屬于食品發(fā)酵領(lǐng)域。本發(fā)明是一種通過降低發(fā)酵過程酸性產(chǎn)物的生成、促進(jìn)乙醇的合成來提高酪酸菌生長效率的方法，具體為在酪酸菌三級發(fā)酵0?8 h時，開始無菌、無氧勻速流加乙醛溶液至發(fā)酵結(jié)束前4?6 h，乙醛總濃度為1.5?5.0 mmol/L。本發(fā)明將乙醛分子作為代謝調(diào)控分子使用，乙醛分子的添加促進(jìn)NADH的氧化效率、顯著增強(qiáng)了乙醇的合成效率，而且還使乙酸、丁酸的生成效率顯著降低，進(jìn)一步提高了酪酸菌的生長效率，產(chǎn)生了極好的技術(shù)效果。本發(fā)明具有材料易購、操作可控性高、適用于酪酸菌發(fā)酵生產(chǎn)的特點。
【專利說明】一種提高酪酸菌生長效率的方法
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明屬于食品發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種提高酪酸菌生長效率的方法。
【背景技術(shù)】
[0003]除了作為重要的功能微生物在醬類、泡菜、釀酒過程發(fā)揮重要作用外，酪酸菌(丁酸梭菌，Clostridium butyrium)作為人用或動物新型益生菌具有調(diào)整腸道菌落平衡，促進(jìn)腸道有益菌群增殖、增強(qiáng)免疫，預(yù)防腫瘤發(fā)生的功能。此外，酪酸菌在腸道產(chǎn)生的益生產(chǎn)物如B族維生素、維生素K等物質(zhì)，對機(jī)體具有保健作用。酪酸菌的主要代謝產(chǎn)物為丁酸，對腸道上皮組織的再生和修復(fù)有很重要的意義。酪酸菌是典型的厭氧芽胞桿菌，發(fā)酵過程中在厭氧條件下大量產(chǎn)生丁酸、乙酸、乙醇等物質(zhì)。雖然酪酸菌有一定的耐酸性，但這些酸分子大量積累還是會對其生長、代謝產(chǎn)生嚴(yán)重的酸脅迫抑制作用，從而降低其生長效率。因此，有針對性地解除或緩解酪酸菌酸性代謝產(chǎn)物(乙酸、丁酸等)對其本身生長的抑制作用，實現(xiàn)丁酸梭菌的高密度培養(yǎng)，已成為研究和開發(fā)丁酸梭菌微生態(tài)制劑的關(guān)鍵技術(shù)。
[0004]通過發(fā)酵過程中加入堿性物質(zhì)如:氫氧化鈉、氨水、碳酸氫鈉、碳酸鈉等可以中和菌體代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸，維持PH穩(wěn)定在設(shè)定值。如:對比文獻(xiàn)I (采用分批補(bǔ)料發(fā)酵法制備酪酸菌活菌制劑的方法，發(fā)明專利CN201110287802.1，2011)公開了酪酸菌發(fā)酵中補(bǔ)入氨水控制PH的方法;對比文獻(xiàn)2(酪酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基及其制備方法與酪酸菌培養(yǎng)發(fā)酵方法，發(fā)明專利CN201410089743.0，2014)公開了用堿控制發(fā)酵培養(yǎng)基的起始pH為7.4-7.5等;對比文獻(xiàn)3(一種連續(xù)發(fā)酵法生產(chǎn)酪酸菌制劑的方法，發(fā)明專利CN201210135950.6，2012)公開了一種連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)酪酸菌的方法，用堿控制發(fā)酵起始PH6.0-7.5；對比文獻(xiàn)4(酒窖窖泥中丁酸梭菌的分離及其特性研究，謝樹貴，微生物學(xué)通報，2007，34(6): 1047-1051)確定了丁酸梭菌的最適初始PH以及通過流加碳酸鈉溶液控制pH值在6.5。
[0005]顯然，對比文獻(xiàn)1、2、3、4均沒有涉及酪酸菌在發(fā)酵過程中的酸、醇代謝特點以及醇酸代謝壓力和調(diào)控的內(nèi)容，而是采用通常的技術(shù)手段用堿性物質(zhì)來中和。雖然現(xiàn)有技術(shù)可以控制發(fā)酵環(huán)境的PH以適于酪酸菌生長，但若能緩解酪酸菌細(xì)胞在厭氧條件下的生理代謝壓力，從還原型輔酶I(NADH)氧化的角度進(jìn)行調(diào)控，則可能會使酪酸菌生長的效率進(jìn)一步地提尚O
[0006]在厭氧條件下細(xì)胞生長代謝過程中由糖酵解途徑(EMP)產(chǎn)生的NADH，可經(jīng)脫氫酶催化反應(yīng)(如:乙醇脫氫酶、丁醇脫氫酶)或通過生成丁酰CoA來氧化，并通過EMP途徑、乙酸合成以及丁酸合成獲得ATP滿足生長需求。但是，乙酸、丁酸的積累也會加重細(xì)胞的代謝負(fù)擔(dān)，引起酸脅迫效應(yīng)。這必然會嚴(yán)重的影響細(xì)胞的生理代謝和細(xì)胞的活性，并引起細(xì)胞自溶。而生成乙醇類有機(jī)物質(zhì)，則可以減弱酸中毒效應(yīng)。因此，若能在厭氧條件下增加NADH經(jīng)乙醇合成途徑的氧化效率，則可能會使細(xì)胞活性得以維持，并進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞生長。選擇合適的受氫體作為代謝調(diào)控分子可能會實現(xiàn)上述目的。
[0007]乙醛作為構(gòu)建雜環(huán)環(huán)系試劑，常用于有機(jī)化工行業(yè)，也用作食品行業(yè)水果香精的調(diào)配劑。但是，沒有把乙醛分子作為代謝因子應(yīng)用于厭氧微生物一酪酸菌培養(yǎng)過程的新功能的報道，即:乙醛作為代謝調(diào)控分子，通過促進(jìn)酪酸菌胞內(nèi)乙醇脫氫酶的活性來增強(qiáng)乙醇的生成效率、還可能緩解酸中毒效應(yīng)并進(jìn)一步提高酪酸菌細(xì)胞生長效率的新功能的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明目的在于提供一種提高酪酸菌生長效率的新方法，其是一種通過降低發(fā)酵過程酸性產(chǎn)物的生成、促進(jìn)乙醇的合成來提高酪酸菌生長效率的方法。
[0009]本發(fā)明目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn):
一種提高酪酸菌生長效率的方法，為在酪酸菌發(fā)酵時流加乙醛;優(yōu)選為:在酪酸菌發(fā)酵0-8 h時，開始無菌、無氧流加乙醛溶液至發(fā)酵結(jié)束前4-6 h，乙醛總濃度為1.5-5.0 mmol/L，即每升發(fā)酵液流加乙醛的量為1.5-5.0 mmol。所述的無菌、無氧流加乙醛溶液通過包括如下步驟的方法實現(xiàn):將玻璃兩通藍(lán)蓋補(bǔ)料瓶改造成三通藍(lán)蓋補(bǔ)料瓶，其中兩通連接過濾器，第三通通過硅膠管連接補(bǔ)料針頭。滅菌后，將瓶裝氮氣通過管件連接在三通藍(lán)蓋補(bǔ)料瓶的一個過濾器上，經(jīng)過濾的無菌氮氣通入補(bǔ)料瓶瓶底，鼓泡置換空氣后，滅菌的針頭在火焰保護(hù)下扎入發(fā)酵罐蓋的補(bǔ)料口，通過蠕動栗進(jìn)行乙醛溶液補(bǔ)料。所述的發(fā)酵優(yōu)選為三級發(fā)酵，三級發(fā)酵的時間優(yōu)選為24 ho
[0010]優(yōu)選的，所述的提高酪酸菌生長效率的方法用到的培養(yǎng)基的配制如下:葡萄糖16.6 8/1、酵母粉7.2 8/1、碳酸鈣4.7 g/L、蛋白胨25 8/1、磷酸氫二鉀0.5 g/L、七水硫酸鎂0.8 g/L、一水硫酸錳0.02 g/L，pH7.3;厭氧管斜面培養(yǎng)基需另外加入瓊脂，瓊脂濃度20g/L。除氧后經(jīng)0.1 MPa蒸氣滅菌20 min備用。
[0011]更優(yōu)選的，所述的提高酪酸菌生長效率的方法，包括如下步驟:
(I)種子擴(kuò)大培養(yǎng)與合瓶種子細(xì)胞的收集
按無菌、無氧操作要求，從酪酸菌菌種凍干管接出細(xì)胞至新制備的厭氧管斜面培養(yǎng)基。36-38°C培養(yǎng)12-16 h后，按無菌、無氧操作要求，加入10 mL無菌、無氧水制備厭氧管種子液。
[0012]120 mL厭氧瓶裝培養(yǎng)基30 mL，按1-2%的比例(v/v)將酪酸菌(Clostr idiumbutyrium)厭氧管種子液接入?yún)捬跗恳后w培養(yǎng)基中，36_38°C、100 r/min在搖床上培養(yǎng)12-
14h得到厭氧瓶種子液。按無菌、無氧操作要求，將厭氧瓶種子液進(jìn)行合瓶操作，得到合瓶種子液。
[0013](2) 二級種子培養(yǎng)
裝有培養(yǎng)基的二級種子罐滅菌(10 L)、氮氣置換除氧后，火焰保護(hù)下將合瓶種子液接入二級種子罐，按如下條件進(jìn)行二級種子發(fā)酵培養(yǎng):培養(yǎng)溫度36-38°C，轉(zhuǎn)速為100 r/min,氮氣流量控制為0.1 vvm，罐壓控制為0.03-0.04 MPa，厭氧保護(hù)3 h后，停止通氮氣，發(fā)酵培養(yǎng)12-14 h后，得二級種子液。
[0014](3)三級發(fā)酵
裝有培養(yǎng)基的三級發(fā)酵罐(100 L)滅菌、氮氣置換除氧后，將二級種子液以1-2%的接種量(v/v)移種至三級發(fā)酵罐，按如下條件進(jìn)行三級發(fā)酵:發(fā)酵溫度36-38°C，轉(zhuǎn)速100 r/min,氮氣流量控制為0.lvvm，罐壓控制為0.03-0.04 MPa，厭氧保護(hù)3 h后，停止通氮氣。發(fā)酵培養(yǎng)24 h后，放罐。三級發(fā)酵培養(yǎng)0-8 h時，開始無菌、無氧勻速流加補(bǔ)入乙醛溶液至發(fā)酵結(jié)束前4-6 h，使乙醛總濃度為1.5-5.0 mmol/L。優(yōu)選的:三級發(fā)酵培養(yǎng)3 h時，開始無菌、無氧勾速流加補(bǔ)入乙醛溶液至發(fā)酵結(jié)束前4 h，乙醛總濃度為2.0 mmol/L。
[0015]好氧補(bǔ)料技術(shù)運用到厭氧發(fā)酵過程，還需要克服技術(shù)上的一些困難，包括料液以及兩通藍(lán)蓋補(bǔ)料瓶連接件的厭氧環(huán)境的保持(100 L通用攪拌發(fā)酵罐系統(tǒng))。本發(fā)明為了保證無菌、無氧流加乙醛溶液，在普通兩通(無菌空氣進(jìn)瓶通路和料液出瓶通路)玻璃藍(lán)蓋瓶的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改造，將兩通不銹鋼件打孔、焊接，接出第三通，得到三通玻璃藍(lán)蓋補(bǔ)料瓶，其中兩通連接過濾器(過濾精度0.22 MO，第三通通過硅膠管連接補(bǔ)料針頭。滅菌后，將瓶裝氮氣通過管件連接在三通玻璃藍(lán)蓋補(bǔ)料瓶的一個過濾器上，經(jīng)過濾的無菌氮氣直接通入補(bǔ)料瓶瓶底，輕微鼓泡置換空氣30 min(氣體直接從三通玻璃藍(lán)蓋補(bǔ)料瓶上連接過濾器的第二通溢出瓶外)后，打開經(jīng)硅膠管連接在第三通的包扎滅菌的針頭，火焰保護(hù)下扎入罐頂補(bǔ)料口。通過蠕動栗按要求進(jìn)行乙醛溶液補(bǔ)料。
[0016]與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明具有如下優(yōu)點和顯著的進(jìn)步:按本發(fā)明進(jìn)行操作，不將乙醛分子作為有機(jī)化工試劑和食品行業(yè)調(diào)香劑，而是作為代謝調(diào)控分子使用。本發(fā)明具有材料易購、操作可控性高、適用于發(fā)酵生產(chǎn)的特點。乙醛分子的添加促進(jìn)NADH的氧化效率、顯著增強(qiáng)了乙醇的合成效率(放罐時乙醇濃度增加了 11.7-29.7%)。而且，還產(chǎn)生了出人意料的效果:乙醛分子的添加使乙酸、丁酸的生成效率顯著降低，放罐時分別降低了28.7-42.1%和22.2-57.8%。這樣，酪酸菌厭氧發(fā)酵過程中，由于乙酸和丁酸的積累對細(xì)胞產(chǎn)生的酸中毒效應(yīng)也得到有效地緩解，并促進(jìn)了細(xì)胞活性的維持，進(jìn)一步提高了酪酸菌的生長效率，放罐時酪酸菌活細(xì)胞數(shù)提高了 15.1-28.1%，產(chǎn)生了極好的技術(shù)效果。這是與現(xiàn)有技術(shù)最明顯的不同。
【具體實施方式】
[0017]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0018]實施例1
(I)培養(yǎng)基的制備
葡萄糖20 g/L，蛋白胨30 g/L，酵母粉20 g/L，磷酸氫二鉀0.5 g/L，七水硫酸鎂0.5 g/L，輕質(zhì)碳酸鈣I 8/1，一水硫酸錳0.02 g/L，pH7.3;厭氧管斜面培養(yǎng)基需另外加入瓊脂，瓊脂濃度20;pH 7.3。除氧后經(jīng)0.1 MPa蒸氣滅菌20 min備用。
[0019](2)種子擴(kuò)大培養(yǎng)與合瓶種子細(xì)胞的收集
按無菌、無氧操作要求，從酪酸菌菌種凍干管接出細(xì)胞至新制備的厭氧管斜面培養(yǎng)基。37°C培養(yǎng)12 h后，按無菌、無氧操作要求，加入10 mL無菌、無氧水制備厭氧管種子液。
[0020]120 mL厭氧瓶裝培養(yǎng)基30 mL，按1%的比例(v/v)將酪酸菌(Clostr idiumbutyrium)厭氧管種子液接入?yún)捬跗恳后w培養(yǎng)基中，37°C、100 r/min在搖床上培養(yǎng)12 h得到厭氧瓶種子液。按無菌、無氧操作要求，將厭氧瓶種子液進(jìn)行合瓶操作，得到合瓶種子液。
[0021](3) 二級種子培養(yǎng)
裝有培養(yǎng)基的二級種子罐滅菌(10 L)、氮氣置換除氧后，火焰保護(hù)下將合瓶種子液按1%的比例(v/v)接入二級種子罐，按如下條件進(jìn)行二級種子發(fā)酵培養(yǎng):培養(yǎng)溫度37°C，轉(zhuǎn)速為100 r/min，氮氣流量控制為0.1 vvm，罐壓控制為0.03-0.04 MPa，厭氧保護(hù)3 h后，停止通氮氣，發(fā)酵培養(yǎng)12 h后，得二級種子液。
[0022](4)三級發(fā)酵
裝有培養(yǎng)基的三級發(fā)酵罐(100 L)滅菌、氮氣置換除氧后，將二級種子液以1%的接種量(v/v)移種至三級發(fā)酵罐，按如下條件進(jìn)行三級發(fā)酵:發(fā)酵溫度37°C，轉(zhuǎn)速100 r/min，氮氣流量控制為0.1vvm，罐壓控制為0.03-0.04 MPa，厭氧保護(hù)3 h后，停止通氮氣。發(fā)酵培養(yǎng)24h后，放觸。
[0023]采用上述酪酸菌通用種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基，按上述方式厭氧發(fā)酵24h，細(xì)胞數(shù)(以Hungate滾管計數(shù)法進(jìn)行菌落CFU計數(shù))為2.6 X 18 CFU/mL，發(fā)酵液中的乙醇濃度為89 mg/L、乙酸濃度為251 mg/L、丁酸濃度為4.5 g/L。
[0024]實施例2
(I)培養(yǎng)基的制備
葡萄糖16.6 g/L、酵母粉7.2 g/L、碳酸|丐4.7 g/L、蛋白胨25 g/L、磷酸氫二鉀0.5 g/L、七水硫酸鎂0.8 g/L、一水硫酸錳0.02 g/L，pH7.3;厭氧管斜面培養(yǎng)基需另外加入瓊脂，瓊脂濃度20 g/L。除氧后經(jīng)0.1 MPa蒸氣滅菌20 min備用。
[0025](2)種子擴(kuò)大培養(yǎng)與合瓶種子細(xì)胞的收集
按無菌、無氧操作要求，從酪酸菌菌種凍干管接出細(xì)胞至新制備的厭氧管斜面培養(yǎng)基。37°C培養(yǎng)12 h后，按無菌、無氧操作要求，加入10 mL無菌、無氧水制備厭氧管種子液。
[0026]I 20 mL厭氧瓶裝培養(yǎng)基3 O mL，按1%的比例(v/v)將酪酸菌(Clostridiumbutyrium)厭氧管種子液接入?yún)捬跗恳后w培養(yǎng)基中，37°C、100 r/min在搖床上培養(yǎng)12 h得到厭氧瓶種子液。按無菌、無氧操作要求，將厭氧瓶種子液進(jìn)行合瓶操作，得到合瓶種子液。
[0027](3) 二級種子培養(yǎng)
裝有培養(yǎng)基的二級種子罐滅菌(10 L)、氮氣置換除氧后，火焰保護(hù)下將合瓶種子液按1%的比例(v/v)接入二級種子罐，按如下條件進(jìn)行二級種子發(fā)酵培養(yǎng):培養(yǎng)溫度37°C，轉(zhuǎn)速為100 r/min，氮氣流量控制為0.1 vvm，罐壓控制為0.03-0.04 MPa，厭氧保護(hù)3 h后，停止通氮氣，發(fā)酵培養(yǎng)12 h后，得二級種子液。
[0028](4)三級發(fā)酵
裝有培養(yǎng)基的三級發(fā)酵罐(100 L)滅菌、氮氣置換除氧后，將二級種子液以1%的接種量(v/v)移種至三級發(fā)酵罐，按如下條件進(jìn)行三級發(fā)酵:發(fā)酵溫度37°C，轉(zhuǎn)速100 r/min，氮氣流量控制為0.1vvm，罐壓控制為0.03-0.04 MPa，厭氧保護(hù)3 h后，停止通氮氣。發(fā)酵培養(yǎng)24h后，放觸。
[0029]采用上述優(yōu)選的培養(yǎng)基，按上述方式厭氧發(fā)酵24h，細(xì)胞數(shù)(以Hungate滾管計數(shù)法進(jìn)行菌落CFU計數(shù))為5.7 X 18 CFU/mL，比實施例1提高了2.2倍。而且，發(fā)酵液中的乙醇濃度為111 mg/L，比實施例1提高了 24.7%。發(fā)酵液中的乙酸濃度為188 mg/L，比實施例1降低了75%。發(fā)酵液中的丁酸濃度為2.7 g/L，比實施例1降低了60%。取得了出人意料的結(jié)果。另外，實施例2所采用的優(yōu)選培養(yǎng)基配方所用葡萄糖、酵母粉和蛋白胨分別比實施例1所用的濃度降低了 17%、64%和17%，極大的節(jié)約了原材料成本。
[0030]實施例3
(I)培養(yǎng)基的制備:同實施例2。
[0031](2)種子液擴(kuò)大培養(yǎng)與合瓶種子細(xì)胞的收集:同實施例2。
[0032](3)二級種子培養(yǎng):同實施例2。
[0033](4)三級發(fā)酵:除補(bǔ)加調(diào)控因子外，三級發(fā)酵其余條件同實施例2。
[0034]調(diào)控因子補(bǔ)加:三級發(fā)酵培養(yǎng)開始時，無菌、無氧勻速流加乙醛溶液(濃度為0.2mol/L)至發(fā)酵結(jié)束前4 h，乙醛總濃度為3.0 mmol/L。
[0035]按上述方式厭氧發(fā)酵24h，細(xì)胞數(shù)(以Hungate滾管計數(shù)法進(jìn)行菌落CFU計數(shù))為6.56 X 18 CFU/mL，比實施例2提高了 15.1%;發(fā)酵液中的乙醇濃度為124 mg/L，比實施例2提高了 11.7%;乙酸濃度為132 mg/L，比實施例2降低了29.8%; 丁酸濃度為2.I g/L，比實施例2降低了 22.2%。
[0036]實施例4
(I)培養(yǎng)基的制備:同實施例2。
[0037](2)種子液擴(kuò)大培養(yǎng)與合瓶種子細(xì)胞的收集:同實施例2。
[0038](3)二級種子培養(yǎng):同實施例2。
[0039](4)三級發(fā)酵:除補(bǔ)加調(diào)控因子外，三級發(fā)酵其余條件同實施例2。
[0040]調(diào)控因子補(bǔ)加:三級發(fā)酵培養(yǎng)周期為6h時，開始無菌、無氧勻速補(bǔ)入乙醛溶液(濃度為0.2 mol/L)至發(fā)酵結(jié)束前4 h，乙醛總濃度為1.5 mmol/L。
[0041]按上述方式厭氧發(fā)酵24h，細(xì)胞數(shù)(以Hungate滾管計數(shù)法進(jìn)行菌落CFU計數(shù))為6.91 X 18 CFU/mL，比實施例2提高了 21.2%;發(fā)酵液中的乙醇濃度為130 mg/L，比實施例2提高了17.1%;乙酸濃度為134 mg/L，比實施例2降低了28.7%; 丁酸濃度為1.83 g/L，比實施例2降低了 32.2%。
[0042]實施例5
(I)培養(yǎng)基的制備:同實施例2。
[0043](2)種子液擴(kuò)大培養(yǎng)與合瓶種子細(xì)胞的收集:同實施例2。
[0044](3)二級種子培養(yǎng):同實施例2。
[0045](4)三級發(fā)酵:除補(bǔ)加調(diào)控因子外，三級發(fā)酵其余條件同實施例2。
[0046]調(diào)控因子補(bǔ)加:三級發(fā)酵培養(yǎng)周期為3h時，開始無菌、無氧勻速補(bǔ)入乙醛溶液(濃度為0.2 mol/L)至發(fā)酵結(jié)束前4 h，乙醛總濃度為2.0 mmol/L。
[0047]按上述方式厭氧發(fā)酵24h，細(xì)胞數(shù)(以Hungate滾管計數(shù)法進(jìn)行菌落CFU計數(shù))為7.3 X 18 CFU/mL，比實施例1提高了 28.1%;發(fā)酵液中的乙醇濃度為144 mg/L，比實施例2提高了 29.7%;乙酸濃度為109 mg/L，比實施例2降低了 42.1%; 丁酸濃度為1.14 g/L，比實施例
2降低了 57.8%。
[0048]上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種提高酪酸菌生長效率的方法，其特征在于:所述的方法為:在酪酸菌發(fā)酵O-Sh時，開始無菌、無氧勻速流加乙醛溶液至發(fā)酵結(jié)束前4-6h，乙醛總濃度為1.5-5.0mmol/L; 所述的無菌、無氧流加乙醛溶液通過包括如下步驟的方法實現(xiàn):將玻璃兩通藍(lán)蓋補(bǔ)料瓶改造成三通藍(lán)蓋補(bǔ)料瓶，其中兩通連接過濾器，第三通通過硅膠管連接補(bǔ)料針頭；滅菌后，將瓶裝氮氣通過管件連接在三通藍(lán)蓋補(bǔ)料瓶的一個過濾器上，經(jīng)過濾的無菌氮氣通入補(bǔ)料瓶瓶底，置換空氣后，滅菌的針頭在火焰保護(hù)下扎入補(bǔ)料口，通過蠕動栗進(jìn)行乙醛溶液補(bǔ)料。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高酪酸菌生長效率的方法，其特征在于:所述的發(fā)酵為三級發(fā)酵，三級發(fā)酵的時間為24h。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高酪酸菌生長效率的方法，其特征在于:酪酸菌發(fā)酵所用到的培養(yǎng)基的配制如下:葡萄糖16.6g/L、酵母粉7.2g/L、碳酸鈣4.7g/L、蛋白胨25g/L、磷酸氫二鉀0.5g/L、七水硫酸鎂0.8g/L、一水硫酸錳0.02g/L，pH7.3;厭氧管斜面培養(yǎng)基需另外加入瓊脂，瓊脂濃度20g/L;除氧后滅菌。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高酪酸菌生長效率的方法，其特征在于:包括如下步驟: (1)種子擴(kuò)大培養(yǎng)與合瓶種子細(xì)胞的收集 按無菌、無氧操作要求，從酪酸菌菌種凍干管接出細(xì)胞至厭氧管斜面培養(yǎng)基;36-38°C培養(yǎng)12-16h后，按無菌、無氧操作要求，加入1mL無菌、無氧水制備厭氧管種子液； 120mL厭氧瓶裝培養(yǎng)基30mL，按1-2%的比例將酪酸菌厭氧管種子液接入?yún)捬跗恳后w培養(yǎng)基中，36-38°C、100r/min在搖床上培養(yǎng)12-14h得到厭氧瓶種子液;按無菌、無氧操作要求，將厭氧瓶種子液進(jìn)行合瓶操作，得到合瓶種子液； (2)二級種子培養(yǎng) 裝有培養(yǎng)基的二級種子罐滅菌、氮氣置換除氧后，火焰保護(hù)下將合瓶種子液接入二級種子罐，按如下條件進(jìn)行二級種子發(fā)酵培養(yǎng):培養(yǎng)溫度36-380C，轉(zhuǎn)速為lOOr/min，氮氣流量控制為0.1vvm，罐壓控制為0.03-0.04MPa，厭氧保護(hù)3h后，停止通氮氣，發(fā)酵培養(yǎng)12_14h后，得二級種子液； (3)三級發(fā)酵 裝有培養(yǎng)基的三級發(fā)酵罐滅菌、氮氣置換除氧后，將二級種子液以1-2%的接種量移種至三級發(fā)酵罐，按如下條件進(jìn)行三級發(fā)酵:發(fā)酵溫度36-380C，轉(zhuǎn)速lOOr/min，氮氣流量控制為0.1vvm,罐壓控制為0.03-0.04MPa，厭氧保護(hù)3h后，停止通氮氣;發(fā)酵培養(yǎng)24h后，放罐； 三級發(fā)酵培養(yǎng)O-Sh時，開始無菌、無氧勻速流加補(bǔ)入乙醛溶液至發(fā)酵結(jié)束前4-6h，使乙醛總濃度為1.5-5.0mmol/L。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的提高酪酸菌生長效率的方法，其特征在于:所述的二級種子罐為10L發(fā)酵罐，所述的三級發(fā)酵罐為100L發(fā)酵罐。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的提高酪酸菌生長效率的方法，其特征在于:在三級發(fā)酵培養(yǎng)3h時，開始無菌、無氧勻速補(bǔ)入乙醛溶液至發(fā)酵結(jié)束前4h，乙醛總終濃度為2.0mmol/L。
【文檔編號】C12N1/38GK105861410SQ201610356765
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月26日
【發(fā)明人】王志, 夏會麗, 陳雄, 李冬生
【申請人】湖北工業(yè)大學(xué)