專利名稱：梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素在組織愈合中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過(guò)施用天然產(chǎn)生的和/或修飾的梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素，和/或不含有絡(luò)合蛋白的神經(jīng)毒素促進(jìn)受傷組織的愈合。該神經(jīng)毒素可用于促進(jìn)傷口愈合(包括預(yù)防疤痕形成)并且可應(yīng)用于眼科領(lǐng)域，例如，通過(guò)例如閉合發(fā)炎的眼睛用于治療受傷的角膜組織。還涉及它們的診斷用途和在本文中用作藥物。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及使用天然產(chǎn)生的和/或修飾的神經(jīng)毒素促進(jìn)受傷表面或淺表組織愈合。來(lái)源于血清型A、B、C1、D、E、F和G肉毒桿菌(Clostridium botulinum)神經(jīng)毒素，以及梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素中天然產(chǎn)生的不含絡(luò)合蛋白的梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素可用于增強(qiáng)或促進(jìn)上述愈合。作用持續(xù)時(shí)間短的梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素，例如E或F型已經(jīng)用于某些希望肌肉麻痹時(shí)間相對(duì)短暫的情況中，例如快速愈合的傷口的治療中。具有更短的生物學(xué)持久性的梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素可降低抗體產(chǎn)生，由此保持梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素在傷口愈合中的治療效果。
損傷或外科介入后的傷口邊緣的張力可對(duì)傷口愈合產(chǎn)生不利影響。反射性肌收縮，尤其可伴隨發(fā)生止痛效果的降低，可能會(huì)使任何未愈合的傷口邊緣移位。該移位可促使病原體進(jìn)入其中并且，最壞的是，需要二次愈合治療。在二次愈合中，必須再次打開(kāi)手術(shù)傷口，每天清潔數(shù)次。必須經(jīng)常地清除壞死的組織(清創(chuàng)術(shù))。二次愈合與初次愈合相比需要相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間不僅費(fèi)力和需要額外的支出，而且導(dǎo)致外觀令人不滿意的大疤痕。它還可能導(dǎo)致未縫合在一起的肌肉粘連，愈合后結(jié)締組織有瘢痕的肌肉收縮時(shí)偶然會(huì)發(fā)生疼痛。為避免該情況通常固定受傷區(qū)域。這可通過(guò)例如使用夾板，專門(mén)的繃帶或其他固定和定位器械來(lái)完成。然而，這些目前使用的方法在很多情況中是不充分的和/或不方便的，并且通常不能使用，尤其是對(duì)手術(shù)后或腹部的傷口。
厭氧菌、革蘭氏陽(yáng)性菌肉毒桿菌產(chǎn)生一種有效的多肽神經(jīng)毒素，肉毒素，它能導(dǎo)致人類(lèi)和動(dòng)物的神經(jīng)性麻痹疾病，即肉毒桿菌中毒。在泥土中發(fā)現(xiàn)了肉毒桿菌的芽孢，可在不正確消毒的和密封的家庭式罐頭工廠的食品容器中生長(zhǎng)，這是許多肉毒桿菌中毒的起因。肉毒桿菌中毒的影響典型地發(fā)生在食用被肉毒桿菌污染的食物后的18至36小時(shí)。肉毒桿菌毒素可不減弱地通過(guò)腸壁，因?yàn)槠渫ㄟ^(guò)絡(luò)合蛋白，例如紅血球凝聚素和無(wú)毒的，非紅血球凝聚蛋白，而免受胰蛋白酶的攻擊。純的神經(jīng)毒素經(jīng)過(guò)腸的再吸收影響末梢運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。肉毒桿菌毒素的中毒癥狀可從走路困難、吞咽困難和說(shuō)話困難發(fā)展到呼吸肌麻痹和死亡。
肉毒桿菌毒素是人類(lèi)已知的最致命的天然生物試劑。在小鼠中胃腸外施用肉毒桿菌毒素(純化的神經(jīng)毒素)血清型A(BoNT/A)約5-6微微克是一個(gè)MLD(最小致死量)。一單位(U)肉毒桿菌毒素定義為每只重量為18-20g的雌性Swiss Webster小鼠腹膜內(nèi)注射的MLD。已表征了7種免疫特異性肉毒桿菌毒素類(lèi)型，分別為肉毒桿菌神經(jīng)毒素血清型A、B、C1、D、E、F和G，它們每一種之間通過(guò)與血清特異性抗體的中和作用互相區(qū)別。肉毒桿菌毒素的不同血清型根據(jù)其感染的動(dòng)物種類(lèi)，和其導(dǎo)致麻痹的嚴(yán)重程度和持續(xù)時(shí)間的不同而變化。例如，當(dāng)在大鼠中測(cè)量產(chǎn)生麻痹幾率時(shí)，確定BoNT/A是肉毒桿菌毒素血清型B(BoNT/B)效力的500倍。此外，BoNT/B在靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中以480U/kg的劑量施用時(shí)是無(wú)毒的，而該劑量大約是BoNT/A在靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中的MLD的12倍。相反，給小鼠注射時(shí)，血清型A的麻痹持續(xù)時(shí)間是E型的10倍。BoNT/C1則優(yōu)先作用于鳥(niǎo)類(lèi)。
肉毒桿菌毒素已在臨床上用于治療神經(jīng)肌肉的失調(diào)，所述疾病的特征為由病理性末梢神經(jīng)的活動(dòng)過(guò)度導(dǎo)致的骨骼肌機(jī)能亢進(jìn)。BoNT/A已被U.S.食品和藥物管理局批準(zhǔn)用于治療眼瞼痙攣、斜視和半側(cè)顏面痙攣。非血清型A的肉毒桿菌毒素血清型與BoNT/A相比顯然具有較低的活性和/或較短的作用時(shí)間。外周肌內(nèi)注射BoNT/A后往往能在一周內(nèi)看到臨床效果。單次肌內(nèi)注射BoNT/A后癥狀緩解的典型持續(xù)時(shí)間平均能保持三個(gè)月。
所有肉毒桿菌毒素血清型明顯抑制神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿在神經(jīng)肌肉接合處的釋放；然而，它們通過(guò)影響不同的神經(jīng)分泌蛋白并且在不同的部位裂解這些蛋白來(lái)完成上述功能。例如，肉毒桿菌血清型A和E都能裂解25千道爾頓(kD)突觸體聯(lián)合蛋白(SNAP-25)；然而，每個(gè)毒素在該蛋白中特異的位置裂解蛋白。已發(fā)現(xiàn)肉毒桿菌毒素血清型C1(BoNTC1)能裂解突觸融合蛋白和SNAP-25。BoNT/B、D、F和G作用于突觸小泡相關(guān)膜蛋白(VAMP也稱為突觸小泡蛋白)，并且每個(gè)血清型在不同的部位裂解蛋白。這些機(jī)理上的差別可能影響各種肉毒桿菌毒素血清型的相對(duì)效力和/或作用持續(xù)時(shí)間。
無(wú)論何種血清型，毒素中毒的分子學(xué)機(jī)制都顯示了相同并且包含數(shù)個(gè)步驟或階段。梭狀芽孢桿菌毒素的神經(jīng)元內(nèi)目標(biāo)通常參與神經(jīng)遞質(zhì)的釋放過(guò)程。該過(guò)程的第一步，毒素通過(guò)H鏈與細(xì)胞表面受體間的特異性相互作用，結(jié)合靶神經(jīng)元的突觸前膜；據(jù)認(rèn)為該受體對(duì)肉毒桿菌毒素各個(gè)血清型是不同的。H鏈的羧基端片斷，Hc，顯示在毒素靶向細(xì)胞表面中起重要作用。
在第二步中，毒素通過(guò)受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞作用被吞噬入細(xì)胞；形成包含毒素的內(nèi)涵體。下一步，毒素從內(nèi)涵體中脫離進(jìn)入細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。這一步被認(rèn)為是由H鏈的氨基端片斷HN介導(dǎo)的，其引發(fā)毒素在pH約5.5或更低時(shí)發(fā)生結(jié)構(gòu)改變。已知內(nèi)涵體具有質(zhì)子泵，能夠降低內(nèi)涵體內(nèi)的pH值。毒素的構(gòu)型改變使其暴露出疏水部分，使毒素將其本身嵌入內(nèi)涵體膜。然后毒素從內(nèi)涵體膜轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)。
肉毒桿菌毒素活性的機(jī)制的下一步驟包括連接H和L鏈的二硫鍵的還原。肉毒桿菌毒素的全部毒性包含于全毒素的L鏈內(nèi)，其必須從重鏈中分離出來(lái)達(dá)到其完全活性；L鏈?zhǔn)卿\(Zn++)內(nèi)肽酶，其在最后的步驟中，選擇性地裂解蛋白，該蛋白對(duì)包含神經(jīng)遞質(zhì)的囊泡識(shí)別并對(duì)接至原生質(zhì)膜的細(xì)胞質(zhì)表面，以及與原生質(zhì)膜融合是必需的。
肉毒桿菌神經(jīng)毒素蛋白質(zhì)分子的分子量，對(duì)于七種已知肉毒桿菌毒素血清型，為約150kD。然而，肉毒桿菌毒素是由梭狀芽孢桿菌有機(jī)體作為包含150kD肉毒桿菌毒素蛋白質(zhì)分子和伴隨的凝血素以及非毒素蛋白質(zhì)的絡(luò)合物釋放。因此，梭狀芽孢桿菌產(chǎn)生的BoNT/A絡(luò)合物為900kD、500kD和300kD形式。而產(chǎn)生的BoNT/B和C1則僅為500kD絡(luò)合物。產(chǎn)生的BoNT/D為300kD和500kD絡(luò)合物。最后，產(chǎn)生的BoNT/E和F僅為近300kD絡(luò)合物。據(jù)信絡(luò)合物(即，分子量大于約150kD)包含非毒素紅血球凝集素和非毒素，非毒性非紅血球凝集素蛋白。
在大量患者重復(fù)注射絡(luò)合物后，產(chǎn)生特異的中和抗體，其能對(duì)抗神經(jīng)毒素的作用。直接的后果是抗體陽(yáng)性的患者不再對(duì)絡(luò)合物應(yīng)答。然而，他們可以再用其他毒素類(lèi)型治療，盡管不是他們所有的人都已被準(zhǔn)予治療。當(dāng)對(duì)患者進(jìn)行所有毒素類(lèi)型的測(cè)試，并已形成對(duì)抗它們的抗體時(shí)，再施用肉毒桿菌毒素絡(luò)合物(不論類(lèi)型)都不再具有藥效。在此情況中必須引起重視的是絡(luò)合物的每一劑量都有助于增加抗體值直到絡(luò)合物施用不再有意義，因?yàn)椴辉儆行А?br> 絡(luò)合物中的非毒素成分可能促進(jìn)特異性抗體的形成。固定在絡(luò)合物中的神經(jīng)毒素，在組織中長(zhǎng)時(shí)間停留并可能激活免疫細(xì)胞遷移到組織中形成抗體。停留時(shí)間較長(zhǎng)并不會(huì)導(dǎo)致靶細(xì)胞對(duì)毒素的吸收量增加，因?yàn)橹卸镜陌屑?xì)胞已不再能吸收毒素。因此緩慢游離出絡(luò)合物的神經(jīng)毒素現(xiàn)在只具有免疫活性。此外，絡(luò)合物中存在的非毒素蛋白可能增強(qiáng)免疫應(yīng)答。紅血球凝集素是一種凝集素，即根據(jù)對(duì)特定糖類(lèi)的高親和力而區(qū)分的蛋白。因?yàn)槠淠芙Y(jié)合至糖類(lèi)的結(jié)構(gòu)，凝集素具有免疫刺激的作用。因此，有可能顯示凝集素刀豆球蛋白A，植物凝集素和美洲商陸有絲分裂原激活T和B淋巴細(xì)胞。肉毒桿菌毒素絡(luò)合物中的紅血球凝集素，也結(jié)合膜相關(guān)糖，因此能夠以相同的方式作為免疫佐劑發(fā)揮作用并參與抗體的形成，并因此導(dǎo)致治療失敗。
本發(fā)明的一個(gè)目的是發(fā)展一種傷口愈合并且預(yù)防疤痕形成的可選擇的方法。特別地，發(fā)明人提出一種合適的活性成分，可用于有效治療患者而不產(chǎn)生中和性抗體，也可用于治療已經(jīng)產(chǎn)生中和性抗體的患者。
體外研究已表明肉毒桿菌毒素能抑制鉀離子誘導(dǎo)的乙酰膽堿和去甲腎上腺素從腦干組織的初級(jí)細(xì)胞培養(yǎng)基中釋放。此外，已有報(bào)告說(shuō)明肉毒桿菌毒素能抑制脊髓神經(jīng)元的初級(jí)培養(yǎng)基中甘氨酸和谷氨酸的誘發(fā)釋放，以及在腦突觸體標(biāo)本中肉毒桿菌毒素能抑制各個(gè)神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿、多巴胺、去甲腎上腺素、CGRP和谷氨酸鹽的釋放。
可按照已知方法獲得梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素，包括在發(fā)酵罐中建立并培養(yǎng)肉毒桿菌，然后收獲并純化發(fā)酵混合物。所有的肉毒桿菌毒素類(lèi)型最初都合成為非活性的單鏈蛋白質(zhì)，其必須經(jīng)過(guò)蛋白酶裂解或切斷而具有神經(jīng)活性。產(chǎn)生肉毒桿菌毒素血清型A和G的細(xì)菌菌株具有內(nèi)生的能處理毒素的蛋白酶，因此，可從細(xì)菌培養(yǎng)中得到大部分其活性形式。相反，肉毒桿菌毒素血清型C1，D和E是由不能蛋白水解的梭狀芽孢桿菌菌株產(chǎn)生的，因此典型地從培養(yǎng)基中得到的是無(wú)活性的。后繼的激活作用可由胰蛋白酶作為肽酶進(jìn)行。它裂解優(yōu)先暴露于酶的突出的切口部位。血清型B和F由能蛋白水解和不能蛋白水解的菌株產(chǎn)生，因此可能得到活性或非活性形式。然而，甚至是能蛋白水解的菌株，其產(chǎn)生例如BoNT/B血清型，也只裂解產(chǎn)生的毒素的一部分。切斷和未切斷分子的準(zhǔn)確比例取決于不同的因素，包括培養(yǎng)的長(zhǎng)度和培養(yǎng)基的溫度。因此，BoNT/B的任何制品都可能包含一定百分比的非活性毒素，這是BoNT/B與BoNT/A相比效力顯著較低的原因。
國(guó)際專利申請(qǐng)WO 00/74703公開(kāi)了一種制備不含有相關(guān)絡(luò)合蛋白的神經(jīng)毒素制品的方法。該申請(qǐng)的發(fā)明主題內(nèi)容引入本文作為參考。U.S.專利申請(qǐng)系列No.11/184,495和相應(yīng)的PCT/US2005/025408公開(kāi)了包含來(lái)自肉毒桿菌的肉毒桿菌神經(jīng)毒素的藥物組合物，其中肉毒桿菌神經(jīng)毒素絡(luò)合物中天然存在不含有絡(luò)合蛋白的神經(jīng)毒素。所述申請(qǐng)中，關(guān)于包含來(lái)自肉毒桿菌的肉毒桿菌神經(jīng)毒素的藥物組合物，肉毒桿菌神經(jīng)毒素絡(luò)合物中天然存在不含有絡(luò)合蛋白的神經(jīng)毒素，該藥物組合物穩(wěn)定性好并且有利地配制使其不含人類(lèi)血清白蛋白，將其發(fā)明實(shí)質(zhì)內(nèi)容引入本文作為參考。
Frevert，J(DE103 33 317和WO 2005/007185)公開(kāi)了一種穩(wěn)定蛋白活性成分的組合物，例如梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素，在藥物制劑中含有，a)表面活性物質(zhì)，例如非離子洗滌劑(表面活性劑)；和b)選自Glu和Gln或Asp和Asn的至少兩種氨基酸的混合物。
據(jù)報(bào)道，BoNT/A已用于如下臨床設(shè)置1)每次肌肉注射(多種肌肉)大約75-125單位BOTOX用于治療頸張力失常；2)每次肌肉注射5-10單位BOTOX用于治療眉間皺紋(眉溝)(5單位肌肉注射入降眉間肌，10單位肌肉注射入每個(gè)皺眉肌)；3)向恥骨直腸肌括約肌內(nèi)注射大約30-80單位BOTOX用于治療便秘；4)向上眼瞼和下眼瞼的橫向瞼板前的眼輪匝肌中，每條肌肉注射約1-5單位BOTOX用于治療眼瞼痙攣；5)向眼外肌肉內(nèi)注射約1-5單位的BOTOX用于治療斜視，注射量根據(jù)被注射肌肉的大小以及需要的肌肉麻痹程度(即需要的屈光度校正)進(jìn)行調(diào)節(jié)；和6)向五處不同的上肢屈肌內(nèi)注射BOTOX用于治療中風(fēng)后的上肢痙攣，如下(a)深指屈肌(flexor digitorum profundus)7.5U至30U(b)淺指屈肌(flexor digitorum sublimes)7.5U至30U(c)腕尺骨屈肌(flexor carpi ulnaris)10 U至40U(d)腕橈骨屈肌(flexor carpi radialis)15U至60U(e)臂二頭肌50U至200U。所示的五塊肌肉均在同一療程接受注射以使該患者的上肢屈肌在每一療程通過(guò)肌內(nèi)注射接受90U至360U的BOTOX。
臨床應(yīng)用中選擇BoNT/A而不是其他的血清型，例如血清型B、C1、D、E、F和G的原因是肉毒桿菌毒素A型具有本質(zhì)上更長(zhǎng)的治療效果。換言之，A血清型的肉毒桿菌毒素的抑制效果更持久。
可選地，可能需要使用持續(xù)時(shí)間短的神經(jīng)毒素，例如血清型E或F或修飾的血清毒素，具有合適的效果持續(xù)時(shí)間。
目前，導(dǎo)致各種肉毒桿菌毒素的持久性差別的原理還不清楚。然而，有兩種理論可解釋毒素持久性的差別。不希望束縛于任何操作理論或作用機(jī)制，下面將簡(jiǎn)要討論這些理論。第一種理論提出毒素的持久性依賴于靶蛋白質(zhì)的種類(lèi)以及靶蛋白質(zhì)上毒素攻擊的部位-Raciborska，等人，Can.J.Physiol.Pharmcol.77679-688(1999)。例如，SNAP-25和VAMP為囊泡對(duì)接一囊泡的胞吐作用中必需的步驟-中需要的蛋白質(zhì)。分別地，BoNT/A裂解靶蛋白質(zhì)SNAP-25而B(niǎo)oNT/B裂解靶蛋白質(zhì)VAMP。這兩種情況的效果相同，不論裂解哪種蛋白都損害神經(jīng)元通過(guò)胞吐作用釋放神經(jīng)遞質(zhì)的能力。然而，被破壞的VAMP可能比破壞的SNAP-25更容易被新的所替換，例如通過(guò)替換合成。因此，由于細(xì)胞需要更長(zhǎng)時(shí)間合成新的SNAP-25蛋白來(lái)替換被破壞的SNAP-25，因此肉毒桿菌毒素A型具有更長(zhǎng)的持久性。
此外，毒素的裂解部位可能影響被破壞的靶蛋白質(zhì)被替換的速度。例如，肉毒桿菌毒素A和E型都裂解SNAP-25。然而，它們?cè)诓煌牟课涣呀猓珺oNT/E與BoNT/A相比，在患者中導(dǎo)致更短時(shí)間的麻痹(出處同上685-6)。
第二種理論提出毒素的不同的持久性取決于其在細(xì)胞內(nèi)不同的半衰期或穩(wěn)定性，即，毒素在細(xì)胞中有效的時(shí)間越長(zhǎng)，效果越久-Keller，等人，F(xiàn)EBS Letters 456137-42(1999)。許多因素都影響毒素在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性，但主要地，毒素越能抵抗細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的代謝作用而不被切斷，就越穩(wěn)定-Erdal，等人，Naunynschmiedeber′s Arch.Pharmacol.35167-78(1995)。
一般，分子抵抗細(xì)胞內(nèi)蛋白酶代謝作用的能力取決于其結(jié)構(gòu)。例如，分子的基本結(jié)構(gòu)可包含一個(gè)獨(dú)特的基本序列，它可導(dǎo)致分子容易被蛋白酶降解或不容易被降解。例如，Varshavsky描述以某些氨基酸結(jié)尾的多肽對(duì)降解蛋白酶更敏感-Proc.Natl.Acad.Sci.USA9312142-12149(1996)。
此外，已知細(xì)胞內(nèi)的酶可通過(guò)例如N-糖基化，磷酸化等等修飾分子，例如多肽。這類(lèi)修飾作用將在本文稱為“二次修飾”?！岸涡揎棥蓖ǔＩ婕皟?nèi)源性分子，例如從RNA翻譯后得到的多肽的修飾。然而，在這里，“二次修飾”也可涉及酶，例如細(xì)胞內(nèi)的酶，修飾外源性分子的能力。例如，當(dāng)給予患者外源性分子，例如藥物后，這些分子將經(jīng)受患者的酶，例如細(xì)胞內(nèi)酶的二次修飾作用。
分子，例如多肽的某些二次修飾，可能抵抗或促進(jìn)降解蛋白酶的作用。其中，這些二次修飾可以，1)影響降解蛋白酶直接作用于分子的能力和/或2)影響分子隱藏在囊泡中避開(kāi)這些降解蛋白酶的能力。
梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素是肉毒桿菌毒素血清型A、B、C1、D、E、F和G中的一種，包括在天然神經(jīng)毒素中存在的不含有絡(luò)合蛋白的肉毒桿菌毒素，或化學(xué)修飾或基因操作修飾的神經(jīng)毒素。化學(xué)修飾或基因修飾的神經(jīng)毒素不含有絡(luò)合蛋白，該絡(luò)合蛋白自然地與肉毒桿菌神經(jīng)毒素形成絡(luò)合物。
對(duì)來(lái)源于肉毒桿菌神經(jīng)毒素的神經(jīng)毒素的修飾，由于是化學(xué)修飾或基因操作，可發(fā)生在神經(jīng)毒素蛋白的各個(gè)部分，例如神經(jīng)毒素分子的重鏈部分和/或輕鏈部分?？梢允菃翁幮揎椈蚨嗵幮揎?。在一個(gè)實(shí)施方式中，來(lái)源于肉毒桿菌神經(jīng)毒素的神經(jīng)毒素蛋白的重鏈包含一處或多處修飾，與原始神經(jīng)毒素相比，它可降低或增加神經(jīng)毒素結(jié)合神經(jīng)細(xì)胞的親和力。該修飾后的神經(jīng)毒素可包含至少一處被替代的和/或刪除的和/或插入的和/或增加的和/或遺傳翻譯后的神經(jīng)毒素氨基酸的修飾，并且優(yōu)選發(fā)生在神經(jīng)毒素的重鏈上。
需要一種修飾的神經(jīng)毒素，其具有各種肉毒桿菌毒素血清型的功效，但具有改變的(更短的)生物學(xué)持久性，其可減少抗體形成。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明涉及使用天然存在和/或修飾的梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素，以及不含有絡(luò)合蛋白的神經(jīng)毒素，促進(jìn)患者受傷表面或淺表組織愈合的方法。該用途包括傷口愈合(包括用于防止瘢痕形成)的用法以及用于眼科學(xué)(例如用于受損角膜組織的治療，例如閉合發(fā)炎的眼睛)。還包括它們用于診斷的用途。根據(jù)希望的作用時(shí)間，預(yù)期用于施用的血清型A、B、C1、D、E、F和G的肉毒桿菌神經(jīng)毒素能促進(jìn)傷口愈合以及防止疤痕形成。此外，具有短的作用時(shí)間以及不含有絡(luò)合蛋白的梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素可以在需要相對(duì)較短的肌肉麻痹的情況中使用。
本發(fā)明是基于通過(guò)麻痹作用于傷口上的肌肉來(lái)固定損傷組織例如傷口。這可以通過(guò)把末梢性肌肉松弛劑直接注射到相應(yīng)肌肉中來(lái)達(dá)到。末梢性肌肉松弛劑選自天然或修飾的神經(jīng)毒素，例如梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素，具有短的作用時(shí)間并且不含有絡(luò)合蛋白。本發(fā)明采用E型和F型肉毒桿菌毒素做為具體實(shí)施方式
。
本發(fā)明還提供了對(duì)在角膜炎和某些眼部手術(shù)介入中改良愈合?？梢酝ㄟ^(guò)外圍和局部注射肌肉松弛藥達(dá)到藥物誘導(dǎo)瞼下垂，從而關(guān)閉眼瞼。所述肌肉松弛藥選自天然或修飾的短效神經(jīng)毒素，例如梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素，具有短的作用時(shí)間并且不含有絡(luò)合蛋白。這種方法用于固定眼睛從而有利于愈合。E型和F型肉毒桿菌毒素做為具體實(shí)施方式
。
本發(fā)明另一方面，短效的不含有絡(luò)合蛋白的肉毒桿菌毒素用作一種診斷工具，以確定用于治療多種情況的長(zhǎng)效肉毒桿菌毒素的最佳注射位置。以E型肉毒桿菌毒素做為具體實(shí)施方式
。
因此我們認(rèn)為我們的發(fā)明的組成可以在下文中得以概括天然的或修飾的梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素在制備促進(jìn)患者損傷表面或淺表組織愈合的藥物中的用途，其中所述藥物制備用來(lái)在或接近所述損傷組織局部施用；所述用途中梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素不含有絡(luò)合蛋白，該蛋白天然與梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素形成絡(luò)合物；所述用途中天然或修飾的梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素具有大約3至4周的短期效果；所述用途中梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素是F型肉毒桿菌毒素；所述用途中天然或修飾的梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素具有大約3至10天的短期效果；所述用途中梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素是E型肉毒桿菌毒素；所述用途中梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素是經(jīng)修飾具有大約1至4周效果持續(xù)時(shí)間的神經(jīng)毒素；上述用途中所述損傷組織包括傷口，上述用途中所述損傷組織包括角膜組織以及制備的所述藥物用于在或接近眼瞼附近局部施用；另外在上述用途中制備雙組分藥物，第一組分包括用于確定最佳施用位置的具有大約3至10天的短期效果的梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素，而第二組分包括用于后續(xù)治療施用的具有大約12周長(zhǎng)期效果的梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素。此外，一種治療具有表面或淺表組織損傷的患者的方法，所述方法包括局部施用一種天然或修飾的梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素進(jìn)入或接近所述損傷組織，從而加快損傷的愈合，所述方法中梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素不含有絡(luò)合蛋白，該蛋白自然與梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素形成絡(luò)合物，所述方法中天然或修飾的梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素具有大約3至4周的短期效果，所述方法中梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素是F型肉毒桿菌毒素，所述方法中天然或修飾的梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素具有大約3至10天的短期效果，所述方法中梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素是E型肉毒桿菌毒素，所述方法中梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素是經(jīng)修飾具有大約1至4周效果持續(xù)時(shí)間的神經(jīng)毒素，上述方法中所述損傷組織包括傷口，上述方法中所述損傷組織包括角膜組織以及將所述梭狀芽孢肉毒桿菌神經(jīng)毒素在或接近于眼瞼附近局部施用，從而保持眼瞼關(guān)閉并且加快損傷角膜組織的愈合。此外，一種治療需要眼瞼關(guān)閉的眼病患者以用于眼病愈合的方法，包括天然或修飾梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素的進(jìn)入或接近于眼瞼局部施用，使得保持眼瞼關(guān)閉并且加速眼病的愈合。另外，一種測(cè)定用于注射具有大約12周的長(zhǎng)期效果的梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素的最佳位置的方法，包括具有大約3至10天的短期效果的天然或修飾梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素的一個(gè)或多個(gè)初期局部施用，以測(cè)定在一個(gè)或多個(gè)特殊位置的施用效果，從而因此確定用于后續(xù)的所述長(zhǎng)期效果的梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素的最佳施用位置，所述方法中天然或修飾的梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素具有大約3至10天的短期效果，并且不含有自然與梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素形成絡(luò)合物的絡(luò)合蛋白，所述方法中天然或修飾梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素是E型肉毒桿菌毒素。同樣，聯(lián)合藥物中包括可分別施用的第一和第二組分，其中第一組分包括具有大約3至10天的短期效果的梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素，第二組分包括具有大約12周的長(zhǎng)期效果的梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素，這種聯(lián)合藥物中還包括通過(guò)所述第一組分在一個(gè)或多個(gè)特異位置對(duì)于患者施用效果的測(cè)定，從而得以選擇所述第二組分后續(xù)施用最佳位置的說(shuō)明。
發(fā)明詳述如文中所述，損傷或手術(shù)介入后的傷口愈合會(huì)受到傷口邊緣張力的不利影響。本發(fā)明包括使用天然存在和/或修飾的神經(jīng)毒素，包括梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素，以及那些不含有絡(luò)合蛋白的神經(jīng)毒素，來(lái)增強(qiáng)傷口的愈合并預(yù)防疤痕形成。本發(fā)明此方面基于一種新方法，即通過(guò)麻痹作用于傷口的肌肉來(lái)固定傷口的周?chē)鷧^(qū)域。這可以通過(guò)直接注射末梢性作用肌肉松馳劑到相應(yīng)肌肉來(lái)達(dá)到。但是，對(duì)此，常規(guī)的肌肉松馳劑具有兩個(gè)不合適的理由。第一，由于它們的小分子量，它們從注射位置迅速擴(kuò)散，從而對(duì)身體的其它部分造成不希望的效果。第二，它們的局部代謝很快并因此失去它們的效力。
肉毒桿菌毒素，一種末梢性作用肌肉松馳劑，有利于足夠長(zhǎng)時(shí)間地保持在注射位置，以通過(guò)神經(jīng)吸收從而在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持其活性形式。由于毒素的高分子量，這種量不會(huì)采取擴(kuò)散方式而只是從注射位置緩慢移出。由于在循環(huán)血液中的稀釋，更多遠(yuǎn)處的神經(jīng)未受影響。由于血清中的蛋白酶，毒素迅速失活。肉毒桿菌毒素的不同血清型具有不同的作用持續(xù)時(shí)間。A和B血清型可以阻斷神經(jīng)許多周，F(xiàn)血清型可以持續(xù)3至4周而E血清型只能持續(xù)3至10天。為了獲得較短的麻痹時(shí)期，必須在手術(shù)前幾天在手術(shù)區(qū)域周?chē)粋€(gè)或多個(gè)位置注射毒素，這取決于需要麻痹的肌肉大小。根據(jù)希望麻痹的時(shí)間，可選擇E血清型或F血清型。由于手術(shù)時(shí)所選手術(shù)位置的肌肉組織已經(jīng)通過(guò)毒素進(jìn)行了麻痹，麻醉師需要更小量的突觸后作用肌肉松馳劑。因此減少了呼吸肌麻痹引起術(shù)后呼吸障礙的危險(xiǎn)。由于手術(shù)位置在術(shù)后4-5天內(nèi)都保持局部麻痹，因此在這段期間內(nèi)傷口縫線不會(huì)受到額外的張力。需要最長(zhǎng)的保持局部固定的時(shí)間直到傷口完全愈合，通常最長(zhǎng)為1-2周。如果傷口愈合情況復(fù)雜，例如通過(guò)第二次愈合，則需要較長(zhǎng)時(shí)間的持續(xù)麻痹。另一個(gè)實(shí)施方式中，在傷口愈合中需要延長(zhǎng)肌肉麻痹時(shí)間，因此需要進(jìn)行A或B血清型的肉毒桿菌毒素的施用。在神經(jīng)細(xì)胞中的毒素裂解后，神經(jīng)功能緩慢地恢復(fù)，并在毒素完全蛋白水解降解后大約2天完全恢復(fù)。短暫的固定不會(huì)導(dǎo)致任何顯著的肌肉萎縮。
另一個(gè)實(shí)施方式中，使用不含有絡(luò)合蛋白，血凝素，和其它外源蛋白的A或B，C1，D，E，F(xiàn)，G血清型梭狀芽孢桿菌肉毒桿菌神經(jīng)毒素有利于傷口愈合和阻止瘢痕形成。做為兩種商業(yè)的A型肉毒桿菌毒素絡(luò)合產(chǎn)品BOTOX和DYSPORT的代替物，以及現(xiàn)有技術(shù)中描述的其它類(lèi)型(B、C1、D、E、F、G)絡(luò)合物的代替物，已經(jīng)開(kāi)發(fā)出一種不含有絡(luò)合蛋白，血凝素，和其它外源蛋白的僅為神經(jīng)毒素(A、B、C1、D、E、F、或G型)的新型藥物。由于它的低分子量，其可以更快速地?cái)U(kuò)散到靶細(xì)胞并在其中得以吸收，在免疫細(xì)胞之前，被血凝素吸引并被激活?？乖瓕W(xué)研究顯示，任何不含絡(luò)合蛋白類(lèi)型的神經(jīng)毒素，不誘導(dǎo)，或至多很少誘導(dǎo)抗體的形成，這不同于A血清型商業(yè)產(chǎn)品和B至G血清型的配合物。在新發(fā)明藥物(不含絡(luò)合蛋白的A、B、C1、D、E、F或G型神經(jīng)毒素)的治療使用中，甚至在重復(fù)施用后，都沒(méi)有由于抗體而失敗。由于它們直接的生物利用率，這種神經(jīng)毒素可以在施用肉毒桿菌毒素絡(luò)合物后，例如在BOTOX或DYSPORT治療后出現(xiàn)針對(duì)相應(yīng)類(lèi)型的抗體效價(jià)(稱作第二非響應(yīng)期)后，仍然適用于患者的治療，這就是說(shuō)不再受其后BOTOX或DYSPORT治療的影響，因?yàn)樯虡I(yè)毒素的施用不再提供治療效果。
這種新發(fā)明的藥物對(duì)那些從未，或很多年沒(méi)有進(jìn)行肉毒桿菌神經(jīng)毒素治療的患者有特別的好處，因?yàn)樗麄兊目贵w效價(jià)很低或開(kāi)始為零。其用途的優(yōu)點(diǎn)在于，由于純毒素治療，患者效價(jià)的增長(zhǎng)為零，或至多非常的不明顯。換句話說(shuō)，新發(fā)明的治療組合物可以長(zhǎng)時(shí)間施用而不失效。其同樣適用于那些產(chǎn)生針對(duì)肉毒桿菌毒素的抗體效價(jià)的患者。
因此，可以通過(guò)不含有絡(luò)合蛋白的神經(jīng)毒素替代高分子量的毒素配合物進(jìn)行施用，防止梭狀芽孢桿菌肉毒桿菌神經(jīng)毒素治療過(guò)程中抗體的誘導(dǎo)。完全分離絡(luò)合蛋白的神經(jīng)毒素能夠直接生物利用，并且能直接結(jié)合到運(yùn)動(dòng)終板的神經(jīng)末梢上。
在角膜炎和眼部某些手術(shù)介入中，把繃帶放在眼上或把上下眼瞼縫合都是為了保持眼睛閉合。用這種方法來(lái)固定眼睛有利于愈合?？梢栽诟鼡Q繃帶時(shí)進(jìn)行愈合過(guò)程的每日評(píng)估。但是，如果眼瞼縫合在一起就不可能檢查眼睛表面。同樣可以通過(guò)外圍和局部作用肌肉松馳劑的注射產(chǎn)生的藥物誘導(dǎo)瞼下垂來(lái)閉合眼瞼。根據(jù)期望的關(guān)閉時(shí)間，把E或F型肉毒桿菌毒素注射入上瞼提肌中。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是明顯的。眼睛能夠保持可接近檢查，以便于監(jiān)視愈合過(guò)程，并且能在對(duì)患者無(wú)壓力的情況下進(jìn)行任何需要的進(jìn)一步測(cè)量。短暫的瞼下垂是可逆的，類(lèi)似于上述的麻痹過(guò)程。
如前詳述，A和B血清型的肉毒桿菌毒素可以用于不同原因的肌張力障礙或痙攣。如果障礙復(fù)雜或如果癥狀中包括幾個(gè)肌肉群，經(jīng)常不清楚哪個(gè)肌肉需要通過(guò)毒素麻痹從而最大的減輕患者痛苦。如果試驗(yàn)把A或B血清型注射入錯(cuò)誤的肌肉中，將對(duì)患者導(dǎo)致額外的壓迫。為了定位長(zhǎng)持久效應(yīng)時(shí)間毒素的毒素治療中注射的最佳位置，需要使用表現(xiàn)為短效應(yīng)持續(xù)時(shí)間的毒素做測(cè)試。E型肉毒桿菌毒素適于這種診斷測(cè)試?；颊咴趯?shí)際治療前會(huì)經(jīng)歷預(yù)期的變化。由于其作用持續(xù)時(shí)間只有幾天，患者將可預(yù)測(cè)通過(guò)長(zhǎng)持久效應(yīng)毒素治療之后將產(chǎn)生什么效果。如果注射不是最佳的，干擾效應(yīng)只會(huì)持續(xù)很短的時(shí)間，而可以在另外的肌肉上進(jìn)行另外的注射以測(cè)試效果。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1人體肉毒桿菌注射增強(qiáng)傷口愈合患者經(jīng)過(guò)瘢痕修整切除手術(shù)。瘢痕位于腹部。瘢痕是由外傷導(dǎo)致的，并且當(dāng)時(shí)在第三治療中心縫合。
患者仰臥，局部注射5ml具有1∶200000腎上腺素的0.5％的利多卡因。切除瘢痕并使用單極燒灼法控制住出血。把不含有絡(luò)合蛋白的肉毒桿菌毒素A注射(10單位)入傷口周?chē)⒃趥谏戏稚?。使?-0Vicryl用于深度縫合和6-0 Nylon用于淺表縫合來(lái)閉合傷口。
手術(shù)后大約24小時(shí)，患者顯示出注射肌肉的明顯麻痹，并且喪失移動(dòng)切除處周?chē)?厘米直徑內(nèi)的皮膚的能力。傷口在術(shù)后早期愈合良好?？梢钥闯鲈趥谶吘墱p少了運(yùn)動(dòng)和張力?；颊叩膫谟锨覜](méi)有并發(fā)癥。相比術(shù)前的瘢痕，術(shù)后12月的瘢痕的整容外形是極好的且優(yōu)于最初的瘢痕。
實(shí)施例2肉毒桿菌誘導(dǎo)瞼下垂以促進(jìn)角膜愈合患者患有角膜炎或者接收了眼部外科手術(shù)介入。
注射不含有絡(luò)合蛋白的E或F型肉毒桿菌毒素入提肌眼瞼中，以在上眼瞼上產(chǎn)生弛緩瞼下垂，并對(duì)角膜產(chǎn)生安全而有效的保護(hù)。檢查監(jiān)視眼睛的愈合過(guò)程。重復(fù)注射直到潛在的疾病或情況治愈。
其它實(shí)施方式可以理解的是，盡管本發(fā)明已通過(guò)其詳細(xì)說(shuō)明進(jìn)行了描述，但前述的說(shuō)明是用于說(shuō)明而不限制發(fā)明的范圍，本發(fā)明通過(guò)所附的權(quán)利要求的范圍進(jìn)行限定。其它方面、優(yōu)點(diǎn)和改進(jìn)包括在下面的權(quán)利要求的范圍中。
權(quán)利要求
1.天然的或修飾的梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素制備用于促進(jìn)患者受傷表面或淺表組織愈合的藥物中的用途，其中所述藥物制備成用于在或靠近所述受傷組織局部施用。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其中梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素不含有絡(luò)合蛋白，該蛋白與梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素自然地形成絡(luò)合物。
3.如權(quán)利要求1或2所述的用途，其中天然的或修飾的梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素特征為具有約為3至4周的短期效果。
4.如權(quán)利要求3所述的用途，其中梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素為肉毒桿菌毒素F型。
5.如權(quán)利要求1或2所述的用途，其中天然的或修飾的梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素特征為具有約為3至10天的短期效果。
6.如權(quán)利要求5所述的用途，其中梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素為肉毒桿菌毒素E型。
7.如權(quán)利要求1或2所述的用途，其中梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素是具有約為1至4周短期效果的修飾的神經(jīng)毒素。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述受傷組織包括傷口。
9.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述受傷組織包括角膜組織，所述藥物制備用于在或靠近眼瞼附近局部施用。
10.如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的用途，其中制備兩組分藥物，第一組分包括具有約3至10天短期效果的梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素，用于確定最佳施用部位，和第二組分包括約12周長(zhǎng)期效果的梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素，用于后續(xù)的治療施用。
11.一種治療具有表面或淺表組織損傷的患者的方法，所述方法包括將天然的或修飾的梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素在或靠近所述損傷組織局部施用，達(dá)到促進(jìn)傷口愈合的目的。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素不含有絡(luò)合蛋白，該蛋白與梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素自然地形成絡(luò)合物。
13.如權(quán)利要求11或12所述的方法，其中天然的或修飾的梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素特征為具有約為3至4周短期效果。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素為肉毒桿菌毒素F型。
15.如權(quán)利要求11或12所述的方法，其中天然的或修飾的梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素特征為具有約為3至10天短期效果。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其中梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素為肉毒桿菌毒素E型。
17.如權(quán)利要求11或12所述的方法，其中梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素是具有約為1至4周短期效果的修飾的神經(jīng)毒素。
18.如權(quán)利要求11至17中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述受傷組織包括傷口。
19.如權(quán)利要求11至16中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述受傷組織包括角膜組織，所述梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素用于在或靠近眼瞼附近局部施用，達(dá)到眼瞼關(guān)閉并且促進(jìn)受傷的角膜組織愈合的目的。
20.確定具有約12周長(zhǎng)期效果的梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素的最佳注射部位的方法，包括首先在一處或多處局部注射天然的或修飾的具有約3至10天短期效果的梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素，以確定在一個(gè)或多個(gè)特異部位施用的效果，由此選擇使用具有長(zhǎng)期效果的梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素進(jìn)行后續(xù)施用的最佳施用部位。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中天然的或修飾的梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素特征為具有約為3至10天的短期效果，并且不含有絡(luò)合蛋白，該蛋白與梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素自然地形成絡(luò)合物。
22.如權(quán)利要求20或21所述的方法，其中天然的或修飾的梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素為肉毒桿菌毒素E型。
23.一種聯(lián)合藥物，包括分別施用的第一和第二組分，其中第一組分包含具有約3-10天短期效果的梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素，第二組分包括具有約12周長(zhǎng)期效果的梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素。
24.如權(quán)利要求23中所述的聯(lián)合藥物，進(jìn)一步包含使用說(shuō)明書(shū)，其中說(shuō)明所述第一組分用于測(cè)定在患者中一個(gè)或多個(gè)特異部位的施用效果，由此選擇所述第二組分進(jìn)行后續(xù)施用的最佳部位。
全文摘要
天然產(chǎn)生的和/或修飾的梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素，包括那些不含有絡(luò)合蛋白的神經(jīng)毒素，所述蛋白自然地與梭狀芽孢桿菌神經(jīng)毒素形成絡(luò)合物，通過(guò)在或靠近受傷組織局部施用，用于增強(qiáng)患者受傷表面或淺表組織的愈合。該神經(jīng)毒素可有利地用于傷口愈合并預(yù)防疤痕產(chǎn)生，并且可應(yīng)用于眼科領(lǐng)域，例如，通過(guò)例如閉合發(fā)炎的眼睛用于治療受傷的角膜組織。另一個(gè)實(shí)施方式包括評(píng)價(jià)毒素施用效果的診斷用途和使用的藥物。
文檔編號(hào)A61P17/02GK101027083SQ200580032613
公開(kāi)日2007年8月29日 申請(qǐng)日期2005年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月27日
發(fā)明者H·V·泰勒 申請(qǐng)人:莫茨藥物股份兩合公司