重組的肉毒梭菌神經(jīng)毒素的制作方法
【專利說明】重組的肉毒梭菌神經(jīng)毒素
[0001] 本專利申請(qǐng)要求2012年10月31日提交的GB1219602. 8的優(yōu)先權(quán)，其通過引用 全文納入本文。
[0002] 本發(fā)明涉及編碼血清型E的肉毒梭菌（Clostridiumbotulinum(C.botulinum)) 神經(jīng)毒素（BoNT/E)的核酸序列，以及用于生產(chǎn)重組BoNT/E的方法。本發(fā)明還涉及重組 BoNT/E的相應(yīng)醫(yī)療應(yīng)用。
[0003] 肉毒菌神經(jīng)毒素由肉毒梭狀芽孢桿菌以大蛋白復(fù)合體的形式生成，由與多種輔助 蛋白復(fù)合的BoNT本身組成。目前存在七種不同類型的肉毒菌神經(jīng)毒素，S卩：肉毒菌神經(jīng)毒 素血清型A、B、Ci、D、E、F和G，其都共有類似的結(jié)構(gòu)和作用模式?？苫谕ㄟ^特異性中和抗 血清的滅活來區(qū)分不同的BoNT血清型，這類通過血清型的分類與氨基酸水平的序列相同 性百分比相關(guān)?；诎被嵝蛄邢嗤园俜直龋o定血清型的BoNT蛋白還可進(jìn)一步分為不 同的亞型。
[0004]BoNT是已知最強(qiáng)力的毒素，對(duì)小鼠的半數(shù)致死量（LD50)范圍為0? 5-5ng/kg(取 決于血清型）。BoNT在胃腸道內(nèi)吸收并在進(jìn)入全身循環(huán)后結(jié)合膽堿能神經(jīng)末梢的突觸前 膜并避免其神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的釋放。BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F和BoNT/G切割突觸小泡 蛋白/囊泡相關(guān)膜蛋白（VAMP) ;B〇NT/C、BoNT/A和BoNT/E切割25kDa的突觸體相關(guān)蛋白 (SNAP-25);且BoNT/C切割突觸融合蛋白。
[0005]天然情況下，梭菌神經(jīng)毒素被合成為單鏈多肽，所述單鏈多肽通過蛋白酶水解切 割進(jìn)行翻譯后修飾以形成由二硫鍵連接在一起的兩條多肽鏈。切割發(fā)生在特定的切割位點(diǎn) (通常稱作激活位點(diǎn)），其位于提高鏈間二硫鍵的半胱氨酸殘基之間。該雙鏈形式即毒素的 活性形式。這兩條鏈被稱為重鏈（H鏈，其分子量為約IOOkDa)和輕鏈（L鏈，其分子量為約 50kDa)。H鏈包含C末端靶向組分（Hc結(jié)構(gòu)域）和N末端易位組分（Hn結(jié)構(gòu)域）。該切割位 點(diǎn)位于L鏈和易位組分之間。在Hc結(jié)構(gòu)域結(jié)合其目標(biāo)神經(jīng)元并通過內(nèi)體將結(jié)合的毒素內(nèi) 化至細(xì)胞中后，馬結(jié)構(gòu)域?qū)鏈跨內(nèi)體膜易位至細(xì)胞溶質(zhì)中，且L鏈提供了蛋白酶功能（也 稱作非細(xì)胞毒性蛋白酶）。
[0006] 非細(xì)胞毒性蛋白酶通過蛋白水解切割的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（稱作SNARE蛋白，例如 SNAP-25、VAMP或突觸融合蛋白）發(fā)揮作用，參見GeraldK(2002)"CellandMolecular Biology(《細(xì)胞和分子生物學(xué)》）"（第4版），約翰威力和桑斯公司（JohnWiley&Sons Inc.)?？s寫SNARE來源于術(shù)語可溶性NSF連接受體，其中NSF指N-乙基馬來酰亞胺敏感 型因子。SNARE蛋白是胞內(nèi)囊泡融合所不可或缺的，且因此是分子經(jīng)由囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)分泌出細(xì) 胞所不可或缺的。蛋白酶功能是鋅依賴的內(nèi)肽酶活性且表現(xiàn)出針對(duì)SNARE蛋白的高底物特 異性。因此，一旦遞送至所需靶細(xì)胞，該非細(xì)胞毒性蛋白酶能夠抑制來自該靶細(xì)胞的細(xì)胞分 泌。梭菌神經(jīng)毒素的L鏈蛋白酶是切割SNARE蛋白的非細(xì)胞毒性蛋白酶。
[0007] 已知肉毒菌神經(jīng)毒素能夠?qū)е滤沙谛约∪饴楸?。所述肌肉松弛特性?dǎo)致肉毒菌 神經(jīng)毒素（如BoNT/A)被用于多種醫(yī)療和美容過程，包括治療眉間皺紋或運(yùn)動(dòng)亢進(jìn)的面部 皺紋（hyperkineticfacialline)、頭痛、偏側(cè)面肌痙攣、膀胱功能充進(jìn)、多汗、鼻唇皺紋 (nasallabialline)、宮頸肌張力障礙、瞼痙攣和痙攣。
[0008] 通常，BoNT的生產(chǎn)是通過培養(yǎng)肉毒梭菌并隨后分類和純化梭菌神經(jīng)毒素復(fù)合體來 進(jìn)行的。然而，以該方式生產(chǎn)BoNT是低效的且蛋白產(chǎn)量低。此外，肉毒梭菌是產(chǎn)芽孢細(xì)菌 并因此需要專業(yè)的培養(yǎng)設(shè)備和裝置，這些設(shè)備和裝置是細(xì)菌（如大腸桿菌）培養(yǎng)中不需要 的。因此，增多的BoNT應(yīng)用導(dǎo)致需要替代性和/或改善的生產(chǎn)和純化BoNT的方法。
[0009]US20080103098描述了一種生產(chǎn)雙鏈形式重組BoNT蛋白的方法，該方法包括在 大腸桿菌宿主細(xì)胞中表達(dá)重組核酸構(gòu)建體。然而，所述方法需要在神經(jīng)毒素的環(huán)結(jié)構(gòu)域中 插入特異性、非天然的（即非梭菌的）五肽序列。插入的五肽序列形成激活切割位點(diǎn)，其可 在細(xì)胞裂解后由內(nèi)源性大腸桿菌蛋白酶切割。因此，US20080103098的方法指出，為實(shí)現(xiàn)優(yōu) 化的BoNT表達(dá)，必須通過插入非天然的切割位點(diǎn)對(duì)BoNT序列進(jìn)行修飾。
[0010]US7132259描述了編碼BoNT蛋白的重組核酸分子。然而，US7132259的核酸分 子經(jīng)過修飾以使用非天然的切割位點(diǎn)代替天然的切割位點(diǎn)。因此，US7132259的方法也指 出，需要插入非天然的切割位點(diǎn)以進(jìn)行優(yōu)化的BoNT表達(dá)。
[0011]US6495143描述了編碼BoNT的重鏈（H。）的片段的重組核酸分子，用于誘導(dǎo)免疫 應(yīng)答（例如在疫苗接種中）。然而，該核酸分子不編碼全長BoNT序列。在大腸桿菌中表達(dá) 并純化破傷風(fēng)毒素和BoNT的單個(gè)H和L鏈?zhǔn)强蓪?shí)現(xiàn)的，這些分離的鏈本身是無毒的。單獨(dú) 生產(chǎn)這些肽鏈后并在嚴(yán)格控制的條件下，可通過氧化型二硫鍵連接使H和L亞基結(jié)合以形 成活性雙鏈。不幸的是，該策略具有若干不足。首先，難以表達(dá)和分離大量的單個(gè)鏈，具體 而言，在不存在H鏈的情況下，分離的L鏈在水溶液中完全不可溶且非常易于受到蛋白水解 降解。其次，體外氧化單獨(dú)表達(dá)并純化的H和L鏈以生成活性雙鏈的過程是非常低效的，并 導(dǎo)致活性毒素的產(chǎn)量低并產(chǎn)生許多無活性的非正確折疊或氧化的形式。對(duì)含有正確折疊和 氧化的H和L鏈的毒素進(jìn)行純化是困難的，將其與這些非活性形式和未反應(yīng)的單獨(dú)的H和 L鏈分離也是困難的。因此，US6495143的方法具有大量缺點(diǎn)。
[0012] 因此，本領(lǐng)域中需要改善的方法以生產(chǎn)重組BoNT，特別是活性雙鏈BoNT重組 BoNT/E。
[0013] 通過提供權(quán)利要求中說明的核酸序列和方法，本發(fā)明解決了上述問題中的一個(gè)或 多個(gè)。
[0014] 在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種包含連續(xù)核苷酸序列的核酸序列，所述連續(xù)核苷 酸序列與SEQIDN0:1的核酸序列具有至少80% (例如至少80、81、82、83、84、85、86、87、 88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99. 5、99. 9 或 100% )的序列相同性且所述連續(xù) 核苷酸序列編碼單鏈BoNT/El蛋白。
[0015] 8〇階7^血清型可分為八種亞型，8〇階7^1至8〇階7^8，其共有至少90%的氨基酸 序列相同性；給定亞型中的BoNT/E蛋白共有較高的氨基酸序列相同性百分比（例如至少 95%或更高）。如上文所述，本發(fā)明的核酸序列編碼BoNT/El蛋白。BoNT/El蛋白的一個(gè)示 例是由UniParc氨基酸序列UPI000016EA7F編碼的蛋白。BoNT/El蛋白的另一個(gè)示例是由 SEQIDN0:2的氨基酸序列編碼的蛋白。
[0016] 本發(fā)明的核酸序列被設(shè)計(jì)為優(yōu)選在大腸桿菌細(xì)胞中提供高水平的表達(dá)。
[0017] 多種因素影響給定蛋白的表達(dá)水平。一種這類因素是編碼該蛋白的mRNA序列的 翻譯速率。該因素本身受mRNA使用何種特定密碼子以指定該蛋白的各氨基酸所影響。一些密碼子的翻譯比其他的快。針對(duì)各氨基酸的密碼子的選擇可以變化，因?yàn)樵谔烊坏那闆r 下mRNA密碼子可以簡并。若干不同密碼子可全部指定相同的氨基酸；因此若干不同mRNA序列可編碼相同的蛋白。指定相同氨基酸的不同密碼子被稱為同義密碼子。特定mRNA中 同義密碼子的精確混合影響了編碼的蛋白的翻譯速率。
[0018] 存在多種不同原因用于解釋為什么一些密碼子的翻譯速率比其他的快。