艱難梭菌毒素a/b的熒光定量pcr檢測試劑盒及檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學領域，尤其涉及一種艱難梭菌毒素 A/B的探針法熒光定量PCR 檢測試劑盒及檢測方法。
【背景技術】
[0002] 艱難梭菌（Clostridium Difficile，C.difficile)是一種革蘭陽性、產(chǎn)毒素或非 產(chǎn)毒素的厭氧芽胞桿菌，它廣泛分布于自然環(huán)境、動物和人的糞便中。艱難梭菌可以寄生在 在人類的腸道中，它本身并沒有侵襲性，但研究發(fā)現(xiàn)，長期使用廣譜抗生素，尤其是克林霉 素、頭孢菌素類、喹諾酮類抗生素后，引起菌群失調(diào)，使耐藥的艱難梭菌被選擇出后大量繁 殖，出現(xiàn)艱難梭菌相關性感染，導致C.difficile相關性腹瀉，目前已被公認為引起抗菌藥 物相關性腹瀉（antibiotic associated diarrhea，AAD)和假膜性腸炎（Pseudo-membrane co 1 i t i s，PMC)的重要致病菌。艱難梭菌感染(CDI)患者臨床表現(xiàn)輕者自限性腹瀉，重者可出 現(xiàn)偽膜性腸炎及中毒性巨結腸。CDI具有復發(fā)率高、耐藥率高、難治率高、死亡率高、醫(yī)療費 用高等特點。因此，艱難梭菌的快速鑒定及其毒素檢測工作迫在眉睫。
[0003] 近年來，艱難梭菌的診斷方法有依賴于厭氧條件的細菌培養(yǎng)、依賴于抗體制備的 谷氨酸脫氫酶(GDH)ELISA檢測法、依賴于基因組DNA提取的分子診斷技術。依賴于菌株培養(yǎng) 的毒素測定法鑒定時可獲得相應菌株，方便后續(xù)研究，但艱難梭菌屬于厭氧菌，培養(yǎng)困難， 費時費力。谷氨酸脫氫酶(GDH)ELISA檢測法需要制備抗體，成本高，過程繁瑣耗時長，且其 穩(wěn)定性雖好但特異性差，無法區(qū)分C.difficile產(chǎn)毒株與無毒株。目前，檢測C.difficile應 用最多的是處于研究前沿的分子生物學檢測法，該方法可以不經(jīng)培養(yǎng)直接從樣品中提取腸 道微生物基因組，利用分子生物學手段進行分離、檢測和定量，其結果可以比較準確的反應 腸道微生物中高豐度菌種的組成及其含量。
[0004] 隨著核酸技術發(fā)展，16S rDNA序列分析已成為鑒定細菌的金標準。利用16S rDNA 序列保守區(qū)域設計引物，此引物幾乎能與所有種屬的核糖靶位點結合。能夠進行快速鑒定， 從而及時給予抗菌治療。然而，該方法也有局限性，當不同種細菌16S rDNA序列幾乎完全相 同時，其鑒定能力就受到限制(如葡萄球菌和伯克霍爾德菌的鑒定）。
[0005] C. difficile產(chǎn)生的毒素 A(tcdA基因編碼的產(chǎn)物)又稱腸毒素，導致回腸腸壁中性 粒細胞浸潤，釋放淋巴因子，引起液體大量分泌和出血性壞死；毒素 B(tcdB基因編碼的產(chǎn) 物)又稱細胞毒素，能使肌動蛋白解聚，損壞細胞骨架，導致細胞固縮壞死，直接損傷腸壁細 胞。C. diff icile的各菌株根據(jù)它們的毒素產(chǎn)生性的不同，大致分為TcdA產(chǎn)生TcdB產(chǎn)生型(A +B+)、TcdA非產(chǎn)生TcdB產(chǎn)生型(A-B+)以及毒素非產(chǎn)生型(A-B-)。有研究表明，A-B+菌株在中 國具有發(fā)病比例高，隱蔽性強，耐藥性高的特點，對臨床科室的危害性更為嚴重。因此，選擇 tcdA和tcdB作為檢測艱難梭菌的目的基因，對艱難梭菌毒性菌株實施簡單、靈敏且快速檢 測，對于臨床診治具有重要意義。
[0006] 用實時熒光定量PCR的方法來檢測外源基因的拷貝數(shù)，是近幾年迅速發(fā)展起來的 新方法，它以低成本、快捷、高靈敏度等優(yōu)點，逐漸取代了價格昂貴、費時費力的Southern blot法。根據(jù)熒光信號的來源不同對熒光定量的方法進行劃分，主要包括特異性熒光探針 (如TaqMan探針)法和非特異性熒光染料(如SYBR Green染料)法。由于SYBR Green染料能與 所有的dsDNA相結合，因此由引物二聚體、錯誤的擴增產(chǎn)物引起的假陽性，會增大定量數(shù)據(jù) 的誤差。目前針對艱難梭菌的定量檢測，已報道比較多的方法是多重實時熒光定量PCR(多 重qPCR)。雖然該方法可以一次性檢測多個靶標基因，但也存在很多弊端，例如1)引物設計 難度大:復雜的多重qPCR引物設計必須依賴于較為大型的數(shù)據(jù)庫和計算機模擬qPCR結果， 以及繁瑣的后期驗證，這個過程不是一般小型實驗室可以完成的；2)產(chǎn)物相互抑制：多重 qPCR副產(chǎn)物焦磷酸的生成，會抑制qPCR反應的延伸；3)在一個qPCR反應體系里，dNTP原料的 量是一定的，所以，每增加一重引物，就會使dNTP原料平分到每個靶標的量減少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 一方面，為解決現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明提供了一種檢測艱難梭菌的引物 對，該引物對為用于檢測c.difficile的16S rDNA引物，其能特異地篩選出C.difficile。
[0008] 一種檢測艱難梭菌的引物對，所述引物對的上游引物具有如SEQ ID N0:1所示的 序列，所述引物對的下游引物具有如SEQ ID N0:2所示的序列。
[0009] 另一方面，本發(fā)明還提供了一種檢測艱難梭菌毒素 A的引物對，所述引物對的上游 引物具有如SEQ ID N0:3所示的序列，所述引物對的下游引物具有如SEQ ID N0:4所示的序 列。
[0010] 又一方面，本發(fā)明還提供了一種檢測艱難梭菌毒素 A的寡核苷酸探針，所述探針具 有如SEQ ID N0:5所不的序列或其互補序列。
[0011] 優(yōu)選地，在寡核苷酸的5'末端結合有熒光物質(zhì)，在3'末端結合有淬滅物質(zhì)。
[0012] 更優(yōu)選地，所述熒光物質(zhì)為FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX中的至少一種;所述淬滅物 質(zhì)為 TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3、DABCYL 中的至少一種。
[0013] 再一方面，本發(fā)明還提供了一種檢測艱難梭菌毒素 A的寡核苷酸組，其具有所述的 檢測艱難梭菌毒素 A的引物對和所述的檢測艱難梭菌毒素 A的寡核苷酸探針。
[0014] 另一方面，本發(fā)明還提供了一種檢測艱難梭菌毒素 B的引物對，所述引物對的上游 引物具有如SEQ ID N0:6所示的序列，所述引物對的下游引物具有如SEQ ID N0:7所示的序 列。
[0015] 又一方面，本發(fā)明還提供了一種檢測艱難梭菌毒素 B的寡核苷酸探針，所述探針具 有如SEQ ID N0:8所不的序列或其互補序列。
[0016] 優(yōu)選地，在寡核苷酸的5'末端結合有熒光物質(zhì)，在3'末端結合有淬滅物質(zhì)。
[0017] 更優(yōu)選地，所述熒光物質(zhì)為FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX中的至少一種;所述淬滅物 質(zhì)為 TAMRA、BHQ 1、BHQ2、BHQ3、DABCYL 中的至少一種。
[0018] 再一方面，本發(fā)明還提供了一種檢測艱難梭菌毒素 B的寡核苷酸組，其具有所述的 檢測艱難梭菌毒素 B的引物對和所述的檢測艱難梭菌毒素 B的寡核苷酸探針。
[0019] 另一方面，本發(fā)明還提供了一種特異性擴增艱難梭菌毒素 A基因的引物對，其具有 外側引物對和內(nèi)側引物對；
[0020] 所述外側引物對的上游引物具有如SEQ ID N0:9所示的序列，所述引物對的下游 引物具有如SEQ ID N0:10所示的序列；
[0021] 所述內(nèi)側引物對的上游引物具有如SEQ ID NO: 11所示的序列，所述引物對的下游 引物具有如SEQ ID N0:12所示的序列。
[0022] 另一方面，本發(fā)明還提供了一種特異性擴增艱難梭菌毒素 B基因的引物對，其具有 外側引物對和內(nèi)側引物對；
[0023] 所述外側引物對的上游引物具有如SEQ ID N0:13所示的序列，所述引物對的下游 引物具有如SEQ ID N0:14所示的序列；
[0024] 所述內(nèi)側引物對的上游引物具有如SEQ ID N0:15所示的序列，所述引物對的下游 引物具有如SEQ ID N0:16所示的序列。
[0025] 另一方面，本發(fā)明還提供了一種艱難梭菌毒素 A/B的探針法熒光定量PCR檢測試劑 盒，其包括所述的檢測艱難梭菌毒素 A的寡核苷酸組和所述的檢測艱難梭菌毒素 B的寡核苷 酸組。
[0026] 優(yōu)選地，所述艱難梭菌毒素 A/B的探針法熒光定量PCR檢測試劑盒還包括所述的檢 測艱難梭菌的引物對。
[0027] 優(yōu)選地，所述艱難梭菌毒素 A/B的探針法熒光定量PCR檢測試劑盒還包括艱難梭菌 毒素 A和艱難梭菌毒素 B的陽性質(zhì)控品，所述艱難梭菌毒素 A的陽性質(zhì)控品具有如SEQ ID N0:17所示