鲬和李氏*的快速鑒別試劑盒及鑒別方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬漁業(yè)資源調(diào)查魚類的鑒別技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及鯆和李氏飾快速鑒別方 法。
[0002]背景介紹
[0003] 鯆是我國(guó)的重要經(jīng)濟(jì)魚種之一，在中國(guó)漁業(yè)經(jīng)濟(jì)中占有重要地位。鯆屬軸形目鯆 科，為近海底層魚類，成體體長(zhǎng)一般為200~350mm，其幼魚在外形上與鱸形目雛?科的李氏 飾十分相似。這兩種魚分類地位不同，成魚形態(tài)差異明顯，幼魚卻因形態(tài)相似不易分辨。實(shí) 際的海洋漁業(yè)資源拖網(wǎng)調(diào)查中往往能同時(shí)捕獲大量的鯆幼體和李氏鱅成體，其體長(zhǎng)多在80 ~120mm之間，根據(jù)傳統(tǒng)的分類方法不易區(qū)分二者，導(dǎo)致漁業(yè)資源信息統(tǒng)計(jì)錯(cuò)誤，甚至 Genbank中亦有將李氏麟，序列誤作為鯆序列公布的情況，這對(duì)于漁業(yè)資源的有效利用、可 持續(xù)發(fā)展和系統(tǒng)研究產(chǎn)生負(fù)面影響，尤其是對(duì)于作為重要經(jīng)濟(jì)種類的鯆資源管理利用和相 關(guān)研究十分不利。
[0004] 目前，鯆和李氏f銜的分類通常使用兩類方法:形態(tài)學(xué)方法及基因序列法。常規(guī)的形 態(tài)學(xué)分類主要通過(guò)以下兩點(diǎn)區(qū)分鯆和李氏銷：
[0005] 1)第一背鰭:鯆第一背鰭與第二背鰭緊鄰，背鰭鰭式為I，VIII;李氏鋪第一背鰭與 第二背鰭分開，背鰭鰭式為IV;
[0006] 2)棘或小刺:鯆的前鰓蓋骨后下角有2棘，李氏鑛丨前鰓蓋骨棘末端上緣有3小刺。
[0007] 如果漁獲物形態(tài)完整，通過(guò)仔細(xì)分辨第一背鰭、棘或小刺可區(qū)分體長(zhǎng)相仿的鯆幼 魚和李氏雌?。由于拖網(wǎng)、保存和運(yùn)輸過(guò)程中的外力破壞，經(jīng)常出現(xiàn)一部分形態(tài)特征受損甚 至個(gè)體殘缺的不完整漁獲樣品，無(wú)法從形態(tài)特征對(duì)其種類進(jìn)行鑒別。近年來(lái)許多外形相似 的漁獲種類都利用基因序列進(jìn)行鑒別分類，該方法主要是對(duì)受檢對(duì)象線粒體中的C0I片段 進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序，利用DNA中堿基序列的特異性進(jìn)行物種區(qū)分鑒別，該方法雖然準(zhǔn)確，但耗時(shí) 長(zhǎng)、花費(fèi)高，需動(dòng)用大型實(shí)驗(yàn)設(shè)備。因此，開發(fā)一種快速、準(zhǔn)確、成本低廉的方法來(lái)鑒別鯆幼 魚與李氏是很有必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為了克服形態(tài)分類鑒定方法的不準(zhǔn)確性以及基因序列分類耗時(shí)長(zhǎng)、花費(fèi)高等不 足，本發(fā)明旨在建立一種穩(wěn)定性高、快速準(zhǔn)確、成本低廉的方法對(duì)鯆和李氏?進(jìn)行區(qū)分鑒 別。
[0009] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供一種鯆和李氏鑛的快速鑒別試劑盒，該試劑盒 中包括堿基序列為SEQ ID No. 1/2的引物對(duì)，以及限制性內(nèi)切酶Hinfl或其同切酶。
[0010]序列為SEQ ID No. 1 的正向引物：F 5'_caaccacaaagacattggcacyctc_3'；
[0011 ]序列為SEQ ID Νο·2的反向引物：R 5'_tagacttctgggtggccaaaga_3'。
[0012] 其中所述的限制性內(nèi)切酶Hinfl或其同切酶的酶切位點(diǎn)為5'···6νΑ Ν ΤΟ··3'的限 制性內(nèi)切酶。
[0013] 另一方面，本發(fā)明提供一種鯆和李氏麵的快速鑒別方法，包括對(duì)樣品總DNA進(jìn)行 PCR擴(kuò)增的步驟，所述PCR擴(kuò)增引物對(duì)的堿基序列為SEQ ID Νο.1/2:
[0014] 序列為SEQ ID No. 1 的正向引物：F 5'_caaccacaaagacattggcacyctc_3'；
[0015] 序列為SEQ ID Νο·2的反向引物：R 5'_tagacttctgggtggccaaaga_3'。
[0016] 進(jìn)一步地，本發(fā)明所述的鯆和李氏爾餘的快速鑒別方法中還包括對(duì)PCR產(chǎn)物酶切的 步驟，所述的酶切步驟使用限制性內(nèi)切酶Hinfl或其同切酶。這些限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn) 為5'…GVA N TC…3'的限制性內(nèi)切酶。
[0017] 本發(fā)明在擴(kuò)增受檢個(gè)體C0I片段的基礎(chǔ)上，采用限制性內(nèi)切酶酶切的方法，使不同 物種產(chǎn)生特異性酶切圖譜，根據(jù)圖譜中條帶的大小判斷受檢個(gè)體的分類歸屬，避免了擴(kuò)增 后的測(cè)序過(guò)程，建立了針對(duì)鯆/李氏鑛的穩(wěn)定性高、快速準(zhǔn)確、成本低廉的鑒別方法，其有 益效果具體包括：
[0018] 1.不受形態(tài)特征影響：能夠針對(duì)形態(tài)特征不明顯或外力造成形體損傷等無(wú)法利用 傳統(tǒng)形態(tài)法分類的個(gè)體進(jìn)行鑒定。
[0019] 2.不受個(gè)體發(fā)育階段限制:排除了時(shí)空限制、遺傳因素等造成的表型差異，從DNA 分子水平上提供可靠的分類依據(jù)。
[0020] 3.準(zhǔn)確快速、成本低廉:與傳統(tǒng)形態(tài)分類法相比，利用DNA分子手段鑒定更為科學(xué)、 準(zhǔn)確；與常規(guī)的DNA檢測(cè)技術(shù)相比，直接對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切40min即可電泳檢測(cè)得出結(jié)果， 無(wú)需測(cè)序，節(jié)省時(shí)間且降低成本。
【附圖說(shuō)明】
[0021]本發(fā)明附圖1幅：
[0022] 鯆及李氏臟聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-酶切分型瓊脂糖凝膠電泳圖譜，圖中：
[0023] M：DL 2000DNA Marker；
[0024] D1、D2:試劑盒法提取的李氏鎌DNA;
[0025] D3、D4:試劑盒法提取的鯆DNA;
[0026] P1、P2:李氏鱗PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0027] 卩3、？4:鯆卩〇財(cái)廣增產(chǎn)物；
[0028] HI、H2:李氏鑛PCR擴(kuò)增后Hinfl酶切產(chǎn)物；
[0029] H3、H4:鯆PCR擴(kuò)增后Hinfl酶切產(chǎn)物。
【具體實(shí)施方式】
[0030]本發(fā)明是在PCR擴(kuò)增受檢樣品CO I片段的基礎(chǔ)上，采用限制性內(nèi)切酶對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn) 行酶切的方法，使不同物種來(lái)源的待測(cè)樣品產(chǎn)生特異性的酶切圖譜，并可根據(jù)圖譜中條帶 的大小判斷待測(cè)樣品的分類來(lái)源。
[0031] 本發(fā)明首先提供一種鯆和李氏鎌j的快速鑒別試劑盒，該試劑盒中包括堿基序列為 SEQ ID No.1/2的引物對(duì)，以及限制性內(nèi)切酶Hinfl或其同切酶。該所述的試劑盒，可以用于 下述本發(fā)明的鯆和李氏雜?的快速鑒別方法的任意【具體實(shí)施方式】。所述的鑒別方法，基本地 包括對(duì)樣品總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的步驟，所述PCR擴(kuò)增引物對(duì)的堿基序列為SEQ ID No. 1/2:
[0032] 序列為SEQ ID No · 1 的正向引物：F 5'-caaccacaaagacattggcacyctc-3'；
[0033] 序列為SEQ ID Νο·2的反向引物：R 5'_tagacttctgggtggccaaaga_3'。
[0034] 進(jìn)一步地，本發(fā)明所述的鯆和李氏麵的快速鑒別方法中還包括對(duì)上述PCR產(chǎn)物酶 切的步驟，所述的酶切步驟使用限制性內(nèi)切酶Hinfl或其同切酶。這些限制性內(nèi)切酶的酶切 位點(diǎn)為5'…GVA Ν ΤΟ··3'的限制性內(nèi)切酶。
[0035] 更為具體地，本發(fā)明的鯆和李氏鑛的快速鑒別方法包括如下步驟：
[0036] a.提取樣品總DNA;
[0037] b.PCR擴(kuò)增：以步驟a所提取的樣品總DNA為模板，使用引物SEQ ID如.1/2進(jìn)行卩0? 擴(kuò)增；
[0038] c.使用限制性內(nèi)切酶Hinfl或其同切酶對(duì)步驟b所得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切；
[0039] d.對(duì)步驟c所得酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)；
[0040] e.結(jié)果判定。
[0041] 本發(fā)明的方法中，首先提取待檢測(cè)樣品的總DNA，【具體實(shí)施方式】中