物種鑒別試劑盒和物種鑒別方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域，尤其設及一種物種鑒別試劑盒和物種鑒別方法。
【背景技術】
[0002] 細胞培養(yǎng)，最害怕被污染，不僅是要避免細菌，霉菌的污染，也要避免污染到其他 種類的細胞。但是在實驗時，常常需要操作不同種類的細胞，即使很熟練的操作人員，還是 有可能會有細胞混雜的情況。
[0003] 由于細胞在顯微鏡下的型態(tài)，差別不大，因此細胞培養(yǎng)時，如果發(fā)生細胞污染，是 沒有辦法可W區(qū)別的。W至于一直到實驗結束，都不知道使用的細胞，已經(jīng)不是原本的細胞 了，也導致實驗結果不被采信，或是做出錯誤的結論。
[0004] 因此，如果有一種物種鑒別試劑盒和物種鑒別方法能夠簡單、快速、靈敏、準確地 鑒別出細胞的物種就顯得非常具有意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種能夠簡單、快速、靈敏、準確地鑒別物種的 物種鑒別試劑盒，W克服現(xiàn)有技術存在的不足。
[0006] 為解決上述技術問題，本發(fā)明采用如下的技術方案：
[0007] -種物種鑒別試劑盒，其特征在于:包括一個聚合酶鏈式反應試劑、一個陽性對照 品、一個無菌水W及至少一種物種的專一性引物對。
[000引在本發(fā)明的物種鑒別試劑盒，有15種物種的專一性引物對，所述15種物種的專一 性引物對分別為兔、馬、雞、狗、綠猴、豬、老鼠、大鼠、貓、人、恒河猴、牛、倉鼠、果蛹、魚的專 一性引物對。
[0009] 在本發(fā)明中，通過下列步驟來確定物種的專一性引物對：
[0010] (1)選定待鑒別的物種:依照目前最常見混雜的樣品，選定待鑒別的物種。
[0011] (2)比對基因庫:捜尋基因庫，比對待鑒別物種的異同，選定各物種專一的檢測基 因序列作為引物。
[0012] (3)設計引物:選定檢測基因序列作為引物，設計聚合酶鏈式反應所用引物，需考 慮專一性、靈敏度，W及各種反應條件。
[OOK] (4似細胞株模擬物種進行專一性測試：引物設計完成后，W細胞株進行模擬測試 專一性，如專一性不足，則重新設計引物。
[0014] (5) W陽性對照質粒驗證靈敏度：引物專一性達標后，W陽性對照質粒來檢測引物 靈敏度，目標100顆細胞即可檢測，如果靈敏度不足，則重新設計引物。
[0015] (6) W細胞株模擬物種進行專一性測試：引物專一性與靈敏度皆達標后，W細胞株 相互混合，模擬物種混雜，測試引物的鑒別效能。
[0016] 另外，本發(fā)明還提供一種物種鑒別方法，該鑒別方法采用上述物種鑒別試劑盒，其 步驟為：
[0017] (I)將待測細胞與各個物種的專一性引物對進行PCR反應；
[0018] (2)將PCR反應產(chǎn)物進行跑膠，獲得PCR反應產(chǎn)物大?。?br>[0019] (3)根據(jù)PCR反應產(chǎn)物大小鑒別出待測細胞物種。
[0020] 采用上述技術方案，本發(fā)明相比現(xiàn)有技術具有簡單、快速、靈敏、準確地鑒別細胞 物種的優(yōu)點，具體體現(xiàn)在：
[0021] (1)操作簡便:只要使用本專利提供的試劑盒，就可W鑒別細胞的物種。
[0022] (2)判讀容易:每個物種的聚合酶鏈式反應產(chǎn)物大小固定，訊號清晰，容易判讀。
[0023] (3)專一性強:單一物種只會有專一的訊號，不會與其他物種混淆。
[0024] (4)靈敏度高：100顆細胞就可W正確鑒別物種。
[0025] (5)用途廣泛:不僅能夠鑒別出單一物種的細胞物種;而且可W鑒別物種混雜的細 胞物種。
【附圖說明】
[0026] 下面結合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明進行詳細說明：
[0027] 圖1A、圖IB為兔的專一性引物與15個物種進行PCR反應后的跑膠結果圖；
[0028] 圖2為馬的專一性引物與15個物種進行PCR反應后的跑膠結果圖；
[0029] 圖3A、圖3B為雞的專一性引物與15個物種進行PCR反應后的跑膠結果圖；
[0030] 圖4為狗的專一性引物與15個物種進行PCR反應后的跑膠結果圖；
[0031] 圖5為綠猴的專一性引物與15個物種進行PCR反應后的跑膠結果圖；
[0032] 圖6為豬的專一性引物與15個物種進行PCR反應后的跑膠結果圖；
[0033] 圖7A、圖7B為老鼠的專一性引物與15個物種進行PCR反應后的跑膠結果圖；
[0034] 圖8A、圖8B為大鼠的專一性引物與15個物種進行PCR反應后的跑膠結果圖；
[0035] 圖9為貓的專一性引物與15個物種進行PCR反應后的跑膠結果圖；
[0036] 圖10A、圖IOB為人的專一性引物與15個物種進行PCR反應后的跑膠結果圖；
[0037] 圖11為恒河猴的專一性引物與15個物種進行PCR反應后的跑膠結果圖；
[0038] 圖12為牛的專一性引物與15個物種進行PCR反應后的跑膠結果圖；
[0039] 圖13為倉鼠的專一性引物與15個物種進行PCR反應后的跑膠結果圖；
[0040] 圖14A、圖14B為果蛹的專一性引物與15個物種進行PCR反應后的跑膠結果圖；
[0041 ]圖15A、圖15B為魚的專一性引物與15個物種進行PCR反應后的跑膠結果圖；
[0042] 圖16為兔、馬、雞的專一性引物靈敏度測試結果圖；
[0043] 圖17為狗、綠猴、豬的專一性引物靈敏度測試結果圖；
[0044] 圖18為老鼠、大鼠、貓的專一性引物靈敏度測試結果圖；
[0045] 圖19為人、恒河猴、牛的專一性引物靈敏度測試結果圖；
[0046] 圖20為倉鼠、果蛹、魚的專一性引物靈敏度測試結果圖；
[0047] 圖21為混雜物種鑒別結果圖。
【具體實施方式】
[0048] 本發(fā)明的物種鑒別試劑盒，包括一個聚合酶鏈式反應試劑、一個陽性對照品、一個 無菌水W及至少一種物種的專一性引物對。
[0049] 在本實施例中，有15種物種的專一性引物對，該15種物種的專一性引物對分別為 兔、馬、雞、狗、綠猴、豬、老鼠、大鼠、貓、人、恒河猴、牛、倉鼠、果蛹、魚的專一性引物對，各物 種作為引物的基因序列如表1所示：
[0050] 在實施例中，通過下列方法來獲得上述15個物種的專一性引物對：
[0051] (1)選定帶鑒別的15個物種:依照目前最常見混雜的樣品，選定待鑒別的物種。
[0052] (2)比對基因庫:捜尋基因庫，比對待鑒別物種的異同，選定各物種專一的檢測基 因序列作為引物。
[0053] (3)設計引物:選定檢測基因序列作為引物，設計聚合酶鏈式反應所用引物，需考 慮專一性、靈敏度，W及各種反應條件。
[0054] (4) W細胞株模擬物種進行專一性測試：引物設計完成后，W細胞株進行模擬測試 專一性，如專一性不足，則重新設計引物。
[0055] (5) W陽性對照質粒驗證靈敏度：引物專一性達標后，W陽性對照質粒來檢測引物 靈敏度，目標100顆細胞即可檢測，如果靈敏度不足，則重新設計引物。
[0056] (6) W細胞株模擬物種進行專一性測試：引物專一性與靈敏度皆達標后，W細胞株 相互混合，模擬物種混雜，測試引物的鑒別效能。
[0057] 本發(fā)明的物種鑒別方法，該鑒別方法采用上述物種鑒別試劑盒，其步驟為：
[0058] (1)將待測細胞與各個物種的專一性引物對進行PCR反應，反應過程為：
[0059] 步驟 1:變性：94°C，10min;
[0060] 步驟 2:變性:94°C，30sec;
[0061] 步驟 3:退火:60°C，30sec;
[006