一種提升破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌產(chǎn)毒能力的培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提升破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌產(chǎn)毒能力的培 養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】
[0002] 破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌(Clostridium tetani)產(chǎn)毒培養(yǎng)基是破傷風(fēng)類毒素制備過 程中的關(guān)鍵因素之一，所以，培養(yǎng)基的質(zhì)量直接影響破傷風(fēng)類毒素疫苗的質(zhì)量和產(chǎn)量。
[0003] 《微生物培養(yǎng)基的制造與應(yīng)用》陳天壽主編，1995年第一版中所闡述鐵(Fe)是過氧 化氫酶、過氧化物酶、細(xì)胞色素、細(xì)胞色素氧化酶的組成部分，缺鐵時這些酶的合成會受到 影響，營養(yǎng)菌(破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌)的生長也需要鐵最適合的濃度為〇. 5-0.6mg/L。鐵對細(xì) 菌毒素也很重要，只在一定濃度范圍內(nèi)才能產(chǎn)毒。例如白喉菌在含鐵〇.14mg/L的培養(yǎng)基中， 毒素量最高，鐵的濃度達(dá)到〇. 6mg/L時，則完全不產(chǎn)毒。
[0004] 同時《微生物培養(yǎng)基的制造與應(yīng)用》陳天壽主編，1995年第一版中還闡述酵母透析 液(Yeast Dialyyzate)成分:酵母粉可配制流腦菌、百日咳菌、破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌培養(yǎng) 基。
[0005] 根據(jù)以上資料制備破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌產(chǎn)毒培養(yǎng)基的常用配方是:乳酪消化液總 氮1000毫克、牛肉胃酶消化液總氮1000毫克、純化水約770毫升、醋酸鈉5克、KH2PO4I克、 Na2HP04· 12H20 1克、甘油60毫升、葡萄糖2.5克、I號溶液5毫升、Π 號溶液2毫升、酵母透析 液30毫升、FeCl3 · 6H2O 0.03克、活性炭2克。
[0006] 附：I號溶液1000毫升的配方:硫胺素0.3克、核黃素0.3克、啦哆醇0.3克、苯多酸鈣 1.2克、生物素4毫克、無水乙醇250毫升、純化水加至1000毫升。
[0007] Π 號溶液1000毫升的配方:煙草酸0.25克、胱氨酸75克、尿嘧啶2.5克、鹽酸150毫 升、硫酸鋅10克、MgS〇4· 2H2〇 50克、純化水加至1000毫升。
[0008] 上述培養(yǎng)基存在破傷風(fēng)發(fā)酵產(chǎn)毒能力低，導(dǎo)致難提純，收率低，效價低的問題，使 用該配方的培養(yǎng)基發(fā)酵后，產(chǎn)毒在40-50Lf/ml。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有的破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌培養(yǎng)基在使用過程 中，發(fā)酵產(chǎn)毒能力低，難提純，收率低，效價低的問題。
[0010] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的。
[0011] 1. -種提升破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌產(chǎn)毒能力的培養(yǎng)基，由以下組分及其含量組成：
[0012] 牛肉胃酶消化液總氮1 · OOg/Ι ± 〇 · 〇5g/L，乳酪消化液總氮1 · 00g/L ± 0 · 05g/L，醋 酸鈉5 · Og/L±0 · lg/L，磷酸氫二鈉 1 ·00g/L±0 · 05g/L，磷酸二氫鉀 1 · 00g/L±0 · 05g/L，甘油 60ml/L±2ml/L，葡萄糖2 · 5g/L±0 · lg/L，I號因子5 · 0ml/L±0 · lml/L，Π 號因子2 · 00ml/L土 0.051111/1，酵母浸粉5.(^/1±0.18/1^6(：13.6!120 0.0258/1±0.0018/1，溶劑為純化水；
[0013] 所述的I號因子由以下組分及其含量組成：
[0014] 維生素 B1 0.3g/L±0.01g/L，維生素 B2 0.3g/L±0.01g/L，維生素 B6 0.3g/L土 0 · 01 g/L，泛酸鈣 1 · 2g/L ± 0 · 06g/L，生物素 0 · 004g/L ± 0 · 001 g/L，無水乙醇 250ml/L ± 10ml / L，溶劑為純化水；
[0015] 所述的Π 號因子由以下組分及其含量組成：
[0016] 煙酸2.5g/L±0. lg/L，尿嘧啶2.5g/L±0. lg/L，L-胱氨酸75g/L±lg/L， ZnSOdO · Og/L ± 0 · 5g/L，MgS〇438 · 4g/L ± 0 · 5g/L，濃鹽酸 150ml/L ± 10ml/L，溶劑為純化水。
[0017] 2.根據(jù)技術(shù)方案1所述一種提升破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌產(chǎn)毒能力的培養(yǎng)基，其中牛 肉胃酶消化液總氮〇. 95g/L，乳酪消化液總氮0.95g/L，醋酸鈉4.9g/L，磷酸氫二鈉0.95g/L， 磷酸二氫鉀〇.95g/L，甘油58ml/L，葡萄糖2.4g/L，I號因子4.9ml/L，n號因子1.95ml/L，酵 母浸粉4.9g/L，F(xiàn)eCl 3 · 6H20 0.024g/L;
[0018] 所述的I號因子中維生素 B1 0.29g/L，維生素 B2 0.29g/L，維生素 B6 0.29g/L，泛 酸鈣1 · 14g/L，生物素0 · 003g/L，無水乙醇240ml/L;
[0019] 所述的Π 號因子中煙酸2 · 4g/L，尿嘧啶2 · 4g/L，L-胱氨酸74g/L，ZnS〇49 · 5g/L， MgS〇437.9g/L，濃鹽酸 140ml/L。
[0020] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
[0021 ]提尚了破傷風(fēng)梭狀芽抱桿菌廣毒能力及蛋白收率。
[0022]本發(fā)明配方的各組分及其含量的巧妙配合，提升了破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌的產(chǎn)毒能 力，與現(xiàn)有培養(yǎng)基相比，破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)后絮狀單位由現(xiàn)有的50Lf/ml提高至 88Lf/ml以上，產(chǎn)毒能力提高了 38Lf/ml~48Lf/ml，蛋白收率也由125mg/L提高至170mg/L以 上，其蛋白收率提高了45mg/L，提高36%。產(chǎn)生了預(yù)料不到的技術(shù)效果。
【具體實施方式】
[0023]以下各實施例所用試劑均為市售。其中酵母浸粉為美國BD公司生產(chǎn)(產(chǎn)品名稱:酵 母浸粉（212730)，產(chǎn)地：美國（碧迪醫(yī)療器械（上海)有限公司，聯(lián)系地址：上海市南京西路 1168號中信泰富廣場30樓，電話:021-32104610。破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌第三代菌種可在中國 微生物菌種保藏管理委員會病毒保藏中心購買原始菌種(菌號:64008)。破傷風(fēng)抗毒素絮狀 反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品購自中國食品藥品檢定研究院。以下實施例無特殊說明，為常規(guī)方法。
[0024]實施案例1破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌發(fā)酵 [0025](一)培養(yǎng)基的配置
[0026] (1)1號因子配制（以總體積1000ml為例），溶劑為純化水 [0027] 表1 I號因子配方
[0028]
[0029] 按表1中I號因子配方計量，先將無水乙醇配制成體積分?jǐn)?shù)為25%乙醇溶液，稱量 維生素 B1、維生素 B2、維生素 B6、生物素、泛酸鈣加入25%的乙醇溶液中，于60°C水浴加熱至 完全溶解，用純化水定溶至l〇〇〇ml體積，放于2-8°C冷庫保存?zhèn)溆谩?br>[0030] (2) Π 號因子配制（以總體積1000ml為例），溶劑為純化水 [0031] 表2 Π 號因子配方
[0032]
[0033] 配制方法:按表2中Π 號因子配方計量，用配置量的3/4純化水稀釋濃鹽酸，稱量煙 酸、尿嘧啶、L-胱氨酸、ZnS〇4、MgS〇4于稀釋的鹽酸溶液中，置于60°C水浴加熱至完全溶解后， 用純化水定溶至l〇〇〇ml體積，放于2-8°C冷庫保存?zhèn)溆谩?br>[0034] (3)培養(yǎng)基配制（以總體積1000ml為例），溶劑為純化水 [0035] 表3培養(yǎng)基配方
[0036]
[0037] 按表3培養(yǎng)基配方的計量，稱取醋酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、葡萄糖、酵母浸 粉于適當(dāng)容器中，用適量純化水溶解，加入甘油、I號因子、Π 號因子，再將FeCl3 ·6Η20用三 角瓶單獨溶解后加入，用純化水定容至所需配制量。
[0038] (4)調(diào)節(jié)pH值:用5mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.3-7.4。
[0039] (5)滅菌:采用蒸汽對步驟(4)培養(yǎng)基進(jìn)行滅