雞白痢沙門菌spiC-rfaH雙基因敲除減毒株及其DIVA疫苗應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于禽沙門菌病的防治領(lǐng)域，具體涉及一種雞白痢沙門菌spiC-rfaH雙基 因敲除減毒株及其DIVA疫苗應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 雞白痢是由雞白痢沙門菌(Salmonella Pullorum)引起的一種多發(fā)性傳染病，對 我國的養(yǎng)雞業(yè)危害極大。該病原菌除了能夠水平傳播，還可經(jīng)蛋垂直傳播而導(dǎo)致孵化率和 出雛率的降低，多侵害20日齡以內(nèi)雛雞，以白色下痢為特征，表現(xiàn)急性敗血癥經(jīng)過，發(fā)病率 和病死率相當高;成年雞多為慢性或隱性感染，一般無明顯臨診癥狀。防治此病的傳統(tǒng)方法 是使用抗生素類藥物，長期使用易引起藥物殘留和細菌耐藥性增強等諸多影響，因此，以疫 苗預(yù)防雞白痢的研究頗受重視。
[0003] 根據(jù)長期以來對雞白痢沙門菌防控措施的探索和實踐，雞白痢沙門菌的控制依賴 一個地區(qū)的感染程度。感染水平低或可實施檢疫淘汰制度的地區(qū)可采取血清學(xué)檢測和撲殺 的辦法控制雞白痢，感染水平高或者無法進行淘汰撲殺的地區(qū)考慮使用疫苗。因此，理想的 雞白痢沙門菌減毒活疫苗除了應(yīng)具備安全性和有效性外，最好還應(yīng)具備D I V A (Differentiation of Infected and Vaccinated Animals, DIVA)的特點，即通過簡單有 效的血清學(xué)檢測方法，就能區(qū)分疫苗免疫動物和自然感染動物，以指導(dǎo)生產(chǎn)現(xiàn)場的疫苗使 用。〇-抗原是革蘭陰性菌細胞最外層結(jié)構(gòu)脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)的主要組成部 分，不僅是病原菌的致病因子，其特異多糖重復(fù)單元的數(shù)目差異也是〇-血清分型的依據(jù)。基 于LPS特異性的玻板凝集試驗以其簡單易行的操作特點，目前在國內(nèi)外被廣泛用于雞白痢 的檢疫診斷。綜上所述，〇-抗原可作為新型雞白痢沙門菌減毒活疫苗的操作靶點和選擇標 志，用以構(gòu)建DIVA疫苗。
[0004] DIVA活疫苗已在畜禽中成功應(yīng)用于防止病毒感染。
[0005] 重組自殺質(zhì)粒技術(shù)和Red同源重組技術(shù)作為基因突變方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于細菌 的基因敲除與基因替換。沙門菌spiC與致病性密切相關(guān)，rfaH參與細菌LPS的生物合成。雙 基因敲除極大地降低了減毒活疫苗在實際應(yīng)用過程中發(fā)生回復(fù)突變的可能性，在不影響免 疫原性的前提下，最大程度的規(guī)避毒力返祖的風險，保證了疫苗的安全性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 鑒于以上現(xiàn)有技術(shù)的情況，本發(fā)明的目的在于提供一種雞白痢沙門菌spiC-rfaH 雙基因敲除減毒株及其制備與應(yīng)用。
[0007] 為了實現(xiàn)上述目的以及其他相關(guān)目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0008] 本發(fā)明的第一方面，提供一種雞白痢沙門菌SpiC-rfaH雙基因敲除減毒株，為spiC 基因和rfaH基因都不表達的雞白痢沙門菌。
[0009] 優(yōu)選的，所述雞白痢沙門菌spiC-rfaH雙基因敲除減毒株，為spiC基因和rfaH基因 都被敲除的雞白痢沙門菌。
[0010] 雞白痢沙門菌為現(xiàn)有技術(shù)，具體信息為:Accession:NC_021984.1;GI:529218781。 spiC基因為現(xiàn)有技術(shù)，具體信息為Accession: JN673268.1;GI :374304599dfaH基因為現(xiàn) 有技術(shù)，具體信息為 ACCESSION: CP006575 ;REGI0N: 3520762 …3521250。
[0011] 只要將雞白痢沙門菌中的spiC基因和rfaH基因都進行敲除，使得spiC基因和rfaH 基因都不表達，即可獲得雞白痢沙門菌spiC-rfaH雙基因敲除減毒株。
[0012] 優(yōu)選地，本發(fā)明一實施例中，被敲除的spiC基因的序列如SEQ ID NO. 1所示，具體 為：
[0013] TCTGAGGAGGGATTCATGCTGGCAGTTTTAAAAGGCATTCCATTAATTCAGGATATCAAGGCCGAAGGTAATAGCCG ATCCTGGATAATGACTATTGATGGGCATCCTGCCAGAGGAGAAATTTTCTCAGAAGCATTTTCTATTTCTTTGTTCT TAAATGACCTGGAAAGCTTACCTAAGCCTTGTCTTGCCTATGTGACACTACTGCTTGCAGCACACCCGGACGTACAT GATTATGCTATACAGCTCACAGCGGATGGGGGATGGTTAAACGGTTATTATACCACAAGTAGTAGCTCTGAGCTTAT TGCTATTGAGATAGAAAAACACCTGGCTTTAACTTGCATTTTAAAAAATGTAATACGCAATCACCATAAACTTTATT CGGGTGGGGTATAA〇
[0014] 優(yōu)選地，本發(fā)明一實施例中，被敲除的rfaH基因的序列如SEQ ID NO.2所示，具體 為：
[0015] ATGCAATCCTGGTATTTACTGTACTGCAAACGCGGGCAACTTCAGCGTGCTCAGGAACACCTCGAAAGACAAGCGGT AAGTTGCCTGACACCGATGATCACCCTGGAAAAAATGGTACGCGGAAAACGTACCTCCGTCAGCGAACCGCTCTTTC CTAATTATCTGTTCGTTGAATTTGATCCGGAAGTGATACATACCACTACAATCAACGCCACGCGCGGCGTCAGCCAT TTTGTGCGCTTTGGCGCGCATCCTGCGATCGTGCCTTCCAGCGTTATTCATCAGCTTTCTATCTACAAGCCCGAAGG CGTTGTCGATCCTGAAACCCCCTATCCCGGCGATAGCGTC ATCATCACGGAAGGCGCATTTGAAGGGCTGAAAGCGATTTTTACCGAACCGGATGGCGAAACGCGTTCGATGTTACT GCTTAATTTACTCAATAAAGAAGTGAAGCAGAGCGTAAAAAACACCGGTTTTCGCAAGATTTAG〇
[0016] 進一步地，所述減毒株還可經(jīng)過其他基因改造。
[0017]所述的其他基因改造是指除spiC基因和rfaH基因雙敲除以外的基因改造。所述其 他基因改造可以是單個目標基因的改造或者為多個感興趣目標基因的改造。感興趣目標基 因并不特指，可以根據(jù)研究需要設(shè)定并改造。例如，可以是一個、兩個、三個以上目標基因的 改造。理論上可以不斷對其進行基因改造，對于目標基因的改造數(shù)量可以按照需要操作，沒 有特別限制。
[0018]基因改造具體是指通過生物或化學(xué)或物理的手段使基因相比改造前在結(jié)構(gòu)上發(fā) 生變化。這種變化主要是指堿基對組成的變化，包括但不限于一個或多個堿基對的替換、增 添、缺失引起的改變。所述基因改造包括但不限于目標基因的敲入、目標基因的敲除等。目 標基因的敲入、目標基因的敲除可以采用基因打靶、同源重組等技術(shù)來完成。
[0019]優(yōu)選地，本發(fā)明另一實施例中，如SEQ ID N0.2所示的rfaH基因被敲除并替換為 FRT位點序列。所述FRT位點序列如SEQIDN0.3所示，具體為：
[0020] Tgggaattagccatggtccatatgaatatcctccttagttcctattccgaagttcctattctctagaagtataggaa cttcgaagctgctccagcctaca〇
[0021]上述FRT位點序列的引入，并不影響雞白痢沙門菌SpiC-rfaH雙基因敲除減毒株的 性能。
[0022]本發(fā)明的第二方面，提供了前述雞白痢沙門菌spiC-rfaH雙基因敲除減毒株的構(gòu) 建方法，包括步驟:將雞白痢沙門菌中的sp i C基因和rfaH基因都敲除。
[0023]可以采用現(xiàn)有的基因編輯方法敲除所述spiC基因和rfaH基因。優(yōu)選地，可采用同 源重組的方法敲除spiC基因和rfaH基因。在優(yōu)選的實施例中，采用Red同源重組的方法敲除 spiC基因和rfaH基因。還可采用其他方法實現(xiàn)基因敲除，并不限于實施例所列舉的方式。 [0024] 基于spiC基因的敲除，spiC基因的完整序列從染色體DNA中去除;基于rfaH基因的 敲除，rfaH基因的完整序列從染色體DNA中被去除。
[0025]在一實施例中，先構(gòu)建spiC基因敲除的雞白痢沙門菌突變株，并在此基礎(chǔ)上敲除 rfaH基因。
[0026]本發(fā)明的第三方面，提供了前述雞白痢沙門菌spiC-rfaH雙基因敲除減毒株在制 備雞白痢沙門菌活疫苗中的用途。
[0027] 本發(fā)明的第四方面，提供了一種雞白痢沙門菌活疫苗，含有前述雞白痢沙門菌 spiC-rfaH雙基因敲除減毒株。
[0028] 進一步的，所述雞白痢沙門菌活疫苗中還含有佐劑。
[0029]本發(fā)明的第五方面，提供了 spiC基因和rfaH基因共同作為靶基因在篩選雞白痢沙 門菌感染治療藥物中的用途。
[0030] 本發(fā)明所述雞白痢沙門菌感染治療藥物為以spiC基因和rfaH基因為治療靶基因， 使spiC基因和rfaH基因敲除、不表達的藥物或者以spiC基因和rfaH基因表達的蛋白為拮抗 對象的藥物;或者以sp i C基因、rfaH基因和其他基因共同作為靶基因加以沉默的藥物。以 spiC基因和rfaH基因為靶點，篩選使這兩個基因不表達的藥物，用于使雞白痢沙門菌毒性 減弱，以治療雞白痢沙門菌感染。例如，該雞白痢沙門菌感染治療藥物可以通過RNA干擾或 者基因重組的方法使spiC基因和rfaH基因敲除或不表達;或者通過制備spiC蛋白和rfaH蛋 白拮抗劑，使spiC基因和rfaH基因表達的蛋白不發(fā)揮作用。
[0031] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0032]本發(fā)明旨研制了一種spiC-rfaH雙基因敲除的雞白痢沙門菌減毒株，本發(fā)明通過 動物試驗發(fā)現(xiàn)，所述突變株毒力顯著降低，在宿主體內(nèi)定殖時間明顯縮短，接種后雞只無不 良反應(yīng)，對強毒力雞白痢沙門菌提供良好的保護作用，可有效清除強毒力菌株感染。
[0033]進一步的，采用所述減毒株做制備的雞白痢沙門菌活疫苗，其毒力相對于野生型 雞白痢沙門菌顯著降低，表現(xiàn)在其對1日齡海蘭白雛雞的致死劑量明顯提高。接種本發(fā)明雞 白痢沙門菌減毒活疫苗后，宿主不產(chǎn)生針對〇-抗原的抗體，通過雞白痢雞傷寒多價檢測抗 原，可有效的應(yīng)用玻板凝集試驗對免疫接種雞和自然感染雞予以區(qū)分。所述疫苗具有良好 的免疫原性，對雛雞可提供堅實的免疫保護效果，并且可以通過玻板凝集試驗快速地區(qū)分 疫苗接種雞與自然感染雞。亦即，所述疫苗具有區(qū)分免疫接種雞和自然感染雞的功能，通過 玻板凝集試驗即可加以區(qū)別，疫苗應(yīng)用不影響雞白痢陽性雞檢疫淘汰制度的實施。
【附圖說明】
[0034] 圖1:雞白