痢沙門菌rfaH基因打靶片段的PCR擴(kuò)增。M:DL2000DNA Marker;l:Pl/P2 擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0035] 圖 2:減毒株S06004 Δ SpiC Δ rfaH的PCR鑒定。M: λ-EcoTHDNA Marker; 1: S06004; 2:S06004ASpiCArfaH: :Cm。
[0036] 圖3:敲除株的吖啶橙凝集試驗(yàn)。1:S06004;2:S06004 Δ SpiC Δ rfaH。
[0037] 圖4:敲除株LPS結(jié)構(gòu)的SDS-PAGE銀染分析。1: S06004; 2: S06004 Δ SpiC Δ rfaH。
[0038] 圖5:雞白痢沙門菌減毒株在雛雞肝臟、脾臟內(nèi)的定殖。Α:肝臟;Β:脾臟。代表 減毒株。
[0039] 圖6:免疫后雛雞體重變化。" △"代表減毒株。
[0040] 圖7:免疫雛雞清除強(qiáng)毒力沙門菌感染的效率。代表減毒株。
[0041 ]圖8 :敲除株具有區(qū)分疫苗接種動(dòng)物和自然感染動(dòng)物的DIVA性能。1: S06004; 2 : S06004 Δ spiC Δ rfaH。"d.p. i"表示免疫后天數(shù)。
【具體實(shí)施方式】
[0042]在進(jìn)一步描述本發(fā)明【具體實(shí)施方式】之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下 述特定的具體實(shí)施方案;還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體 實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法， 通常按照常規(guī)條件，或者按照各制造商所建議的條件。
[0043]當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端 點(diǎn)以及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和 科學(xué)術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、 材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本 發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實(shí) 現(xiàn)本發(fā)明。
[0044] 除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實(shí)驗(yàn)方法、檢測方法、制備方法均采用本技術(shù)領(lǐng) 域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA技術(shù)及 相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻(xiàn)中已有完善說明，具體可參見Sambrook等 MOLECULAR CL0NING:A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001;Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John ffiley&Sons,New York,1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYM0L0GY,Academic Press,San Diego；Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998;METH0DS IN ENZYM0L0GY,Vol.304,Chromatin(P.M.ffassarman and A.P.ffolffe,eds.),Academic Press，San Diego,1999;和METHODS IN MOLECULAR BI0L0GY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
[0045] 實(shí)施例1雞白痢沙門菌spiC-rfaH雙基因敲除減毒株S06004 AspiC Δ rfaH的構(gòu)建
[0046] 1.材料和方法
[0047] 1.1菌株與質(zhì)粒
[0048]雞白痢沙門菌S06004A spiC突變株由本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室利用重組自殺質(zhì)粒方法無 痕敲除spiC基因構(gòu)建獲得并保存(所述雞白痢沙門菌S06004 AspiC突變株為現(xiàn)有技術(shù)，其 具體的構(gòu)建方法詳見"雞白痢沙門菌S06004 △ spiC突變株的構(gòu)建與鑒定，中國獸醫(yī)科學(xué)， 2014年 04 期"）。
[0049]雞白痢沙門菌S06004(NalR)、E.coli DH5a、E.coli Spy372(Apir)以及質(zhì)粒pKD46 (AmpR)、pKD3(CmR)、pCP20(AmpR、Cm R)均由本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室保存，這些菌體以及質(zhì)粒均為現(xiàn) 有技術(shù)，具體參見雞白痢沙門菌S06004株致病島-2缺失株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性，微生物 學(xué)報(bào)，2015,55(5)。
[0050] PMD20-T克隆載體購自寶生物工程(大連)有限公司。
[0051 ] 1.2主要試劑
[0052] Genomic DNA Extraction Kit、dNTP、普通Taq酶、DNA marker購自寶生物工程（大 連)有限公司，DNA Fragment Purification Kit購自Tiangen公司，細(xì)菌微量生化發(fā)酵管購 自杭州天和生物公司，L-阿拉伯糖購自Sigma公司，LPS Extraction Kit購自iNtRON公司， Pierce Silver Strain Kit購自Thermo公司，其余常規(guī)試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純產(chǎn)品。 引物合成由南京金斯瑞生物公司完成。
[0053] 1.3雙基因敲除減毒株的構(gòu)建方法
[0054] 1.3.1 引物
[0055] 根據(jù)GenBank上已公布的雞白痢沙門菌基因組序列，用引物設(shè)計(jì)軟件Primer5.0設(shè) 計(jì)用于同源重組的引物。
[0056] 表1用于基因敲除的引物序列
[0057]
[0058]
[0059] 引物P1/P2用于同源重組，該引物分別由兩部分組成，5'端序列與rfaH基因兩翼序 列同源，3'端斜體的序列與模板質(zhì)粒pKD3上的氯霉素抗性基因兩側(cè)序列互補(bǔ)。YZ1/YZ2是 rfaH同源重組區(qū)域外側(cè)的一對驗(yàn)證引物，該引物之間的序列在親本株是637bp，rfaH基因被 氯霉素抗性基因置換后約為1160bp，氯霉素抗性基因被敲除后約250bp。
[0060] 1.3.2打靶片段的擴(kuò)增與純化
[0061 ]以pKD3質(zhì)粒為模板，用引物P1/P2對rfaH同源重組片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件:94 °C 變性 5min，94°C45s，58°C45s，72°C60s，進(jìn)行 35 個(gè)循環(huán)，最后 72°C 延伸 lOmin，4°C 保存。采 用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，使用膠回收試劑盒純化，回收片段作為rfaH基因打靶 片段。
[0062] 1.3.3電擊轉(zhuǎn)化打靶片段到感受態(tài)細(xì)胞
[0063] 將編碼Red重組系統(tǒng)的pKD46質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到雞白痢沙門菌S06004 Δ spiC敲除株中， 獲得S06004 △ spiC(pKD46)。挑取單菌落接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中30°C振蕩培養(yǎng) 過夜，按1:100比例轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物至10mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，同時(shí)加入終濃度 30mmol/L的L-阿拉伯糖，30°C振蕩培養(yǎng)至0D6QQ為5~0 · 6，冰浴lOmin，4°C、4000rpm離心 lOmin收集細(xì)菌，用冰浴的無菌去離子水洗1遍，再用預(yù)冷的10%甘油洗2遍，最后以1:200體 積的預(yù)冷的10 %甘油重懸，即制備好感受態(tài)細(xì)胞。
[0064] 將濃度不低于150ngAiL的打靶片段與50yL感受態(tài)細(xì)胞混合后加入到直徑為1mm的 電擊杯中，冰浴2min后進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化。電擊參數(shù)：電阻200Ω，電容25yF，電壓1800V。電擊結(jié) 束后，立即加入lmL S0C培養(yǎng)基，180rpm培養(yǎng)1.5~2h，隨后涂布含有氯霉素的LB培養(yǎng)基，37 °(3培養(yǎng)。挑取單克隆進(jìn)行?0?鑒定，正確的即命名為306004八叩^八奸別 ：：〇11。
[0065] 1.3.4抗性基因的消除
[0066] 將攜帶FLP位點(diǎn)特異性重組酶的pCP20質(zhì)粒導(dǎo)入S06004A spiCArfaH: :Cm突變株 中，通過含氨芐青霉素和氯霉素的雙抗性LB培養(yǎng)基30°C培養(yǎng)，篩選得到陽性克隆S06004A spiCArfaH: :Cm(pCP20)，挑取單菌落在42°CLB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h左右，即可獲得不含 PCP20質(zhì)粒和氯霉素抗性基因的敲除株，命名為S06004 AspiC ArfaH。
[0067] 1.3.5敲除株的生物學(xué)特性
[0068]通過接種葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、甘露糖、鼠李糖、木糖、衛(wèi)矛醇、山梨醇、乳糖、賴氨 酸脫羧酶、乙酰胺、硫化氫、蛋白胨水、側(cè)金花醇等生化鑒定管，對雞白痢沙門菌S06004 Δ spiC Δ rfaH缺失株進(jìn)行生化特性測定。
[0069] 1.3.6敲除株的表型鑒定
[0070] 采用吖啶橙凝集試驗(yàn)、菌落結(jié)晶紫染色對敲除株進(jìn)行S-R型鑒定。按照LPS提取試 劑盒及銀染試劑盒說明書，對突變株LPS結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。
[0071] 2實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0072] 2.1打靶片段的PCR擴(kuò)增
[0073]以pKD3質(zhì)粒為模板，使用P1/P2引物擴(kuò)增出兩端與rfaH基因上下游序列同源，中間 為氯霉素抗性基因 Cm的DNA片段，經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，與預(yù)期llOObp的大小一致， 如圖1所示。
[0074] 2.2敲除株的？0?鑒定
[0075]使用表1中的驗(yàn)證引物對抗性基因消除前后的突變株進(jìn)行PCR鑒定，如圖2所示。通 過外側(cè)引物將擴(kuò)增出的片段克隆到PMD20-T載體上送測序，序列比對證明敲除株構(gòu)建成功。 質(zhì)粒PCP20表達(dá)的FLP重組酶能識(shí)別抗性基因兩側(cè)的FRT位點(diǎn)，通過位點(diǎn)特異性重組將中間 的抗性基因去除，僅在作用位點(diǎn)留下單拷貝的FRT位點(diǎn)。
[0076]亦即，本實(shí)施例中采用如上方法，將雞白痢沙門菌中如SEQ ID NO. 1所示spiC基因 敲除，以及如SEQ ID NO. 2所示的rfaH基因替換為如SEQ ID NO. 3所示FRT位點(diǎn)序列（實(shí)現(xiàn)了 rfaH基因的敲除），使得sp i C基因和rfaH基因都不表達(dá)，成功獲得了雞白痢沙門菌sp i C-rfaH雙基因敲除減毒株。
[0077] 2 · 3S06004 Δ SpiC Δ rfaH的生化特性鑒定
[0078]細(xì)菌轉(zhuǎn)接葡萄糖、鼠李糖、木糖、麥芽糖、甘露醇、衛(wèi)矛醇、山梨醇、乳糖、蔗糖、賴氨 酸脫氫酶、氰化鉀、尿素、乙酰胺、七葉苷、硫化氫、蛋白胨水、側(cè)金花醇等生化鑒定管，37°C 過夜培養(yǎng)，生化鑒定結(jié)果(表2)表明突變株與野生株細(xì)菌生化特性一致。
[0079] 表2雞白痢沙門菌30