專利名稱：采用補(bǔ)料分批發(fā)酵法制備高密度酪酸菌活菌制劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酪酸菌活菌制劑的制備方法，具體是采用補(bǔ)料分批發(fā)酵法制備高密度酪酸菌活菌制劑的方法。㈡
背景技術(shù)：
酪酸菌即丁酸梭菌((Clostridium butyrium)，為革蘭陽性厭氧芽孢桿，是1933年由日本千葉醫(yī)科大學(xué)宮入近治博士首先發(fā)現(xiàn)并報(bào)告的，因此又名宮入菌。該菌存在于土壤、人和動(dòng)物腸道、干酪及自然酸奶中，細(xì)菌學(xué)分類屬于梭菌屬，為革蘭氏陽性厭氧芽孢桿菌，培養(yǎng)后期可變?yōu)殛幮跃?。酪酸菌為梭狀芽孢桿菌，菌體為直或微彎，孢子圓形或橢圓形，為內(nèi)生芽孢，常使菌體中部膨大呈梭形。對(duì)外界環(huán)境有較強(qiáng)的抵抗力，經(jīng)80°C、30min和90°C、10min熱處理后全部存活；加熱90°C、20min后，95 %存活；加熱100°C、5min后30 %存活。耐熱、耐酸，pH值為1. 0 5. 0時(shí)仍能存活； PH值為4.0 9. 8時(shí)能適合其生長。因此，酪酸菌能夠抵抗制粒過程中的高溫、高熱， 與目前廣泛應(yīng)用的非芽孢類活菌制劑相比，更具廣闊的市場(chǎng)前景。酪酸菌是人體腸道內(nèi)正常的有益菌，它能夠拮抗有害菌，促進(jìn)有益菌生長，調(diào)節(jié)人的腸道菌群平衡；能促進(jìn)腸黏膜修復(fù)，維持屏障完整，并能祛除腸黏膜炎癥，阻止腸黏膜腐爛，恢復(fù)腸功能；分泌低聚糖酶，把多糖降解為低聚糖，促進(jìn)腸道內(nèi)有益菌群(雙歧桿菌、 乳酸桿菌等)的繁殖和成長，快速恢復(fù)菌群平衡；對(duì)有害菌具有拮抗作用。調(diào)節(jié)宿主的基因表達(dá)，有效防治腸癌；能恢復(fù)腸道的免疫功能及化學(xué)屏障、生物屏障，健康腸道，恢復(fù)腸功能。正是由于酪酸菌具有的獨(dú)特的生物特點(diǎn)，早在上個(gè)時(shí)間四十年代，日本就已經(jīng)把它開發(fā)成為治療腸道疾病的藥物。近半個(gè)世紀(jì)以來，日本的酪酸菌活菌制劑-米雅系列產(chǎn)品在日本、韓國、中國等亞洲國家和地區(qū)廣泛應(yīng)用于消化系統(tǒng)、小兒、外科、腫瘤、婦產(chǎn)科等種種原因腸道菌群失調(diào)、急慢性腹瀉、抗生素相關(guān)腸炎、便秘等疾病的治療，療效確切。酪酸菌及其制劑主要應(yīng)用于以下幾個(gè)方面
1、作為藥物使用
能夠治療腸菌群紊亂、腹瀉、腸炎，預(yù)防腸癌。另外酪酸菌也可作為腸炎、肝病、化放療造成的免疫力下降、菌群失調(diào)的良好輔助治療藥物；
2、作為獸藥使用
酪酸菌可用以治療動(dòng)物腸道感染和腸功能異常。酪酸菌可增加動(dòng)物腸內(nèi)酪酸、醋酸等短鏈脂肪酸生成量，可促進(jìn)排便，可抑制腸道腐敗產(chǎn)物氨和胺類的產(chǎn)生；可抑制霍亂弧菌、志賀氏菌、沙門氏菌、致病性大腸桿菌、出血性大腸桿菌以及引起偽膜性腸炎的魏氏梭菌的繁殖；
3、用作飼料添加劑
酪酸菌能單獨(dú)作為飼料添加劑使用，也能與乳酸菌、芽孢菌、雙歧桿菌等益生菌復(fù)配使用，能增強(qiáng)該類產(chǎn)品的功效。在提高動(dòng)物免疫力、抗病力及降低豬的料肉比方面都有顯著效果目前。近年來，我國生物制藥方面有著飛速的發(fā)展，乳酸菌種、雙岐桿菌等微生態(tài)制劑國內(nèi)在人藥制劑和獸藥制劑領(lǐng)域都已實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，人用酪酸菌活菌制劑目前國內(nèi)也有多家制藥企業(yè)在進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。但總體來說，酪酸菌產(chǎn)業(yè)項(xiàng)目還存在著生產(chǎn)規(guī)模偏小，冷凍干燥菌粉活菌含量還不夠高，芽孢形成率偏低，生產(chǎn)成本高，產(chǎn)品存放穩(wěn)定性差等問題。酪酸菌微生態(tài)制劑的生產(chǎn)主要是利用其活的芽孢體，獲得大量的酪酸菌芽孢體或活菌體并保持它們的活性是酪酸菌制劑生產(chǎn)的關(guān)鍵，芽孢數(shù)目越多越好。酪酸菌的生產(chǎn)方法都是采用液態(tài)深層發(fā)酵法培養(yǎng)酪酸菌菌體和芽孢，然后分離菌體及芽孢，并將其做成制劑。目前酪酸菌制劑比較流行的生產(chǎn)方法是采用各自取得的酪酸菌生產(chǎn)菌種，使用三級(jí)種子培養(yǎng)的方法，發(fā)酵培養(yǎng)酪酸菌活菌體，采用凍干機(jī)冷凍干燥的方法制備酪酸菌活菌制劑。 現(xiàn)有方法的主要不足是
1.種子培養(yǎng)級(jí)數(shù)過多，總的發(fā)酵周期偏長，所需的設(shè)備多，加大了設(shè)備的投資和增加了染菌機(jī)會(huì)，加大了發(fā)酵風(fēng)險(xiǎn)；
2.發(fā)酵罐裝料系數(shù)為60-80%，設(shè)備利用率不高；
3.發(fā)酵培養(yǎng)的酪酸菌菌落總數(shù)一般在1.0-5. 5 X IO8個(gè)/ml，芽孢率一般小于90%，酪酸菌的培養(yǎng)密度偏低，相應(yīng)的發(fā)酵成本較大；
4.發(fā)酵菌體分離技術(shù)采用的是管式離心機(jī)，單臺(tái)管式離心機(jī)處理發(fā)酵液能力較小，目前國內(nèi)最大規(guī)格的150型管式離心機(jī)發(fā)酵液處理能力為1.0 m3/h，大規(guī)模生產(chǎn)酪酸菌時(shí)受到設(shè)備限制；
5.制劑技術(shù)均采用冷凍干燥技術(shù)，需要使用凍干機(jī)，由于凍干機(jī)的裝料量有限，且設(shè)備投入大，使用成本高，限制了酪酸菌的大規(guī)模生產(chǎn)。曰

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的主要是針對(duì)目前酪酸菌活菌制劑工藝所存在的問題， 提供一種采用補(bǔ)料分批發(fā)酵法制備高密度酪酸菌活菌制劑的方法，該方法生產(chǎn)周期短，酪酸菌的培養(yǎng)密度高，活菌數(shù)目較高，生產(chǎn)成本較低，能夠大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，產(chǎn)品質(zhì)量更穩(wěn)定。本發(fā)明工藝方法的技術(shù)方案步驟如下
①一級(jí)種子培養(yǎng)取酪酸菌種子凍干管菌種，接種于酪酸菌三角瓶一級(jí)種子培養(yǎng)基
中，在34-38°C厭氧培養(yǎng)12 16h;所用培養(yǎng)基的原料及用量為葡萄糖0. 5%_2. 5 %、牛肉膏 0. 5% -2. 0%、酵母浸膏 0. 3% -0. 5%、磷酸氫二鉀 0. 01% -0. 05%、氯化鈉 0. 1%-0. 2 %、 水 94. 75-98. 59%,培養(yǎng)基的 pH 6. 0-7. 0 ；
2)二級(jí)種子培養(yǎng)將一級(jí)種子接種于酪酸菌二級(jí)種子培養(yǎng)基中，接種量為酪酸菌二級(jí)
種子培養(yǎng)基體積的3 9% ；在34-38°C厭氧培養(yǎng)12 16h;所用培養(yǎng)基的原料及用量為葡萄糖 1. 5%-2. 5 %、蛋白胨 1. 0% -1. 5%、酵母粉 0. 5% -1. 5%、磷酸氫二鉀 0. 02% -0. 05%、氯化鈉 0. 1%-0. 2 %、硫酸鎂 0. 02%-0. 1%、水 94. 15-96. 86%,培養(yǎng)基的 pH 6. 0-7. 2 ；
3)發(fā)酵將二級(jí)種子接種于酪酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為酪酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基體積的
3 9% ；以氮?dú)饪刂乒迚?. 02MPa -0. 04MPa,在;M_46°C厭氧培養(yǎng)32_38h ；所用培養(yǎng)基的原料及用量為葡萄糖3. 0%-5. 0%、酵母粉1. 0% -2. 5%、黃豆粉2. 0% -3. 5%、磷酸氫二鉀 0. 05% -0. 1%、硫酸鎂 0. 05%-0. 1%、碳酸鈣 0. 3%-0. 6%、硫酸猛 0. 002%、水 88. 2%-93. 6%, 培養(yǎng)基的PH 5. 8-7. 5 ；當(dāng)發(fā)酵至12-14 h開始流加由葡萄糖10%-20%、水80%-90%配制成的碳源葡萄糖補(bǔ)料培養(yǎng)基，至發(fā)酵結(jié)束前8小時(shí)；
當(dāng)發(fā)酵至13-15 h開始流加由豆粉水解液5.0%-10.0%、磷酸二氫鉀0. 1%、硫酸鎂0. 1%、 水89. 8-94. 8%配制成的氮源豆粉水解液補(bǔ)料培養(yǎng)基，至發(fā)酵結(jié)束前10小時(shí)；
當(dāng)發(fā)酵至12h開始使用重量百分濃度17. 0%-24. 0%的氨水流加調(diào)節(jié)pH，使發(fā)酵液控制 PH6. 4-6. 8 ；發(fā)酵過程中采用間歇式攪拌，保持培養(yǎng)基濃度均衡；
發(fā)酵過程中碳源葡萄糖補(bǔ)料培養(yǎng)基與氮源豆粉水解液補(bǔ)料培養(yǎng)基的加入體積比為1 1，但總補(bǔ)料量控制在初始發(fā)酵培養(yǎng)基體積的20-4096，最終發(fā)酵液裝料系數(shù)為80-9 ； 發(fā)酵結(jié)束前4- 逐步將發(fā)酵溫度提高至42-46 °C，直至芽抱形成率> 96%，結(jié)束發(fā)酵；
④菌體收集經(jīng)檢驗(yàn)合格的發(fā)酵菌液，采用碟片式離心機(jī)收集菌體，獲得濕菌泥并使
用純化水反復(fù)沖洗菌泥；
D添加保護(hù)劑將所得的濕菌泥稱重，按濕菌泥保護(hù)劑=1: 4-30的重量比，加入由脫
脂奶粉5%-15%、海藻糖2%-5%、淀粉5%-15%、甘油2%_3%、維生素CO. 5%_1%、水61%_85. 5%配制的保護(hù)劑，混合均勻；
噴霧干燥制粉將混合好的配有保護(hù)劑的菌泥，噴霧干燥，即得酪酸菌干燥菌粉活
菌制劑；其中進(jìn)風(fēng)溫度控制在85-120°C ；
2)菌粉檢驗(yàn)每克菌粉含酪酸菌活菌數(shù)不少于1.0X 101°個(gè)；
上述各級(jí)種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基、補(bǔ)料培養(yǎng)基、保護(hù)劑均需要經(jīng)過110_123°C，15-30 分鐘的蒸汽濕熱實(shí)罐滅菌，滅菌后，培養(yǎng)基要迅速降至36-37°C ；
上述各級(jí)種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基、補(bǔ)料培養(yǎng)基中的原料用量均為重量百分比；配制時(shí)保證所用原料的重量百分比之和為100%。
本發(fā)明工藝方法的優(yōu)選技術(shù)方案步驟如下
2)—級(jí)種子培養(yǎng)取酪酸菌種子凍干管菌種，接種于酪酸菌三角瓶一級(jí)種子培養(yǎng)基
中，在36°C厭氧培養(yǎng)14h;所用培養(yǎng)基的原料及用量為葡萄糖2.0%、牛肉膏1.0%、酵母浸膏0. 3%、磷酸氫二鉀0. 02%、氯化鈉0. 1%、水96. 58%，培養(yǎng)基的pH 6. 5 ；！) 二級(jí)種子培養(yǎng)將一級(jí)種子接種于酪酸菌二級(jí)種子培養(yǎng)基中，接種量為酪酸菌二級(jí)
種子培養(yǎng)基體積的5% ；在35°C厭氧培養(yǎng)13h;所用培養(yǎng)基的原料及用量為葡萄糖2. 3 %、 蛋白胨1. 4%、酵母粉1. 2%、磷酸氫二鉀0. 03%、氯化鈉0. 15%、硫酸鎂0. 04%、水94. 88%，培養(yǎng)基的PH 6. 7 ；
3)發(fā)酵將二級(jí)種子接種于酪酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為酪酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基體積的 9% ；以氮?dú)饪刂乒迚?. 04MPa，在46°C厭氧培養(yǎng)38h ；所用培養(yǎng)基的原料及用量為葡萄糖3. 9%、酵母粉1. 7%、黃豆粉3. 496，磷酸氫二鉀0. 05%、硫酸鎂0. 05%、碳酸鈣0. 5%、硫酸錳 0. 002%、水 90. 45%,培養(yǎng)基的 pH6. 8 ；
當(dāng)發(fā)酵至14 h開始流加由葡萄糖15%，水85%配制成的碳源葡萄糖補(bǔ)料培養(yǎng)基，至發(fā)酵結(jié)束前8小時(shí)；
當(dāng)發(fā)酵至Hh開始流加由豆粉水解液8. 0%、磷酸二氫鉀0. 1%、硫酸鎂0. 1%、水91.洲配制成的氮源豆粉水解液補(bǔ)料培養(yǎng)基，至發(fā)酵結(jié)束前10小時(shí)；
當(dāng)發(fā)酵至1 開始使用重量百分濃度23. 0%的氨水流加調(diào)節(jié)pH，使發(fā)酵液控制pH6. 5 ； 發(fā)酵過程中采用間歇式攪拌，保持培養(yǎng)基濃度均衡；
發(fā)酵過程中碳源葡萄糖補(bǔ)料培養(yǎng)基與氮源豆粉水解液補(bǔ)料培養(yǎng)基的加入體積比為1 1，但總補(bǔ)料量控制在初始發(fā)酵培養(yǎng)基體積的3096，最終發(fā)酵液裝料系數(shù)為90% ；
發(fā)酵結(jié)束前證逐步將發(fā)酵溫度提高至42°C，直至芽抱形成率> 96%，結(jié)束發(fā)酵；
3)菌體收集經(jīng)檢驗(yàn)合格的發(fā)酵菌液，采用碟片式離心機(jī)收集菌體，獲得濕菌泥并使
用純化水反復(fù)沖洗菌泥；！)添加保護(hù)劑將所得的濕菌泥稱重，按濕菌泥保護(hù)劑=1: 9的重量比，加入由脫脂
奶粉10%、海藻糖3%、10%淀粉、甘油2%、維生素CO. 5%、水74. 5%配制的保護(hù)劑，混合均勻；
噴霧干燥制粉將混合好的配有保護(hù)劑的菌泥，噴霧干燥，即得酪酸菌干燥菌粉活
菌制劑；其中進(jìn)風(fēng)溫度控制在85-95°C ；
2)菌粉檢驗(yàn)每克菌粉含酪酸菌活菌數(shù)不少于1.0X 101°個(gè)。本發(fā)明所涉及的酪酸菌種子凍干管菌種，又名丁酸梭菌，拉丁學(xué)名Clostridium butyricum,是申請(qǐng)人從位于北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學(xué)院微生物研究所內(nèi)的“中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”購得，菌種編號(hào)1. 2709，菌種名稱Clostridium butyricum (“菌種購買證明”原件隨申請(qǐng)文件一起提供)。本發(fā)明具有如下特點(diǎn)
1、本發(fā)明酪酸菌發(fā)酵種子培養(yǎng)技術(shù)采用二級(jí)種子培養(yǎng)方法，比其它技術(shù)少一級(jí)種子罐培養(yǎng)?？s短了總發(fā)酵周期，降低了染菌機(jī)會(huì)，減少了發(fā)酵風(fēng)險(xiǎn)和設(shè)備投資；
2、通過補(bǔ)料的方法，本發(fā)明的發(fā)酵罐裝料系數(shù)達(dá)到85-9 ，提高了設(shè)備利用率和單罐產(chǎn)量；
3、通過發(fā)酵中間調(diào)控，本發(fā)明酪酸菌的培養(yǎng)密度較高，放罐發(fā)酵液的菌落總數(shù)大于 2. 0 X IO9個(gè)/ml，芽孢率大于96%，增加了單位體積的酪酸菌菌體產(chǎn)量，相應(yīng)的降低了發(fā)酵生產(chǎn)成本；
4、本發(fā)明酪酸菌發(fā)酵菌體分離技術(shù)采用的是碟片式離心機(jī)，單臺(tái)機(jī)器處理發(fā)酵液能力較大，處理量一般為l-30m3/h，能夠滿足大規(guī)模發(fā)酵時(shí)設(shè)備要求；
5、本發(fā)明采用噴霧干燥技術(shù)，料液處理量大，能夠滿足大規(guī)模生產(chǎn)要求，且設(shè)備投入相對(duì)要節(jié)約很多。達(dá)到同樣的產(chǎn)能，使用噴霧干燥技術(shù)要比使用凍干干燥技術(shù)設(shè)備投資要少 2-5倍，噴霧干燥設(shè)備使用成本也低；6、本發(fā)明制備的酪酸菌活菌制劑，活菌含量高，每克菌粉含酪酸菌活菌數(shù)不少于 1. OXIOici個(gè)。能夠部分取代抗生素，用于各種原因引起的人體和動(dòng)物腸道菌群失調(diào)、急慢性腹瀉、腸易激綜合癥、與抗生素相關(guān)性腸炎、便秘或腹瀉便秘交替癥等疾病的治療。


圖1是本發(fā)明工藝方框圖。具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1 (以2m3發(fā)酵罐為例)
本發(fā)明酪酸菌活菌制劑的制備方法依次由下述工藝步驟組成
1、一級(jí)種子培養(yǎng)在5000ml三角瓶中裝有一級(jí)種子培養(yǎng)基3000ml，121°C濕熱滅菌 30min后，培養(yǎng)基迅速降至36-37°C。取酪酸菌種子凍干管菌種，接種于酪酸菌三角瓶一級(jí)種子培養(yǎng)基中，在35-36°C厭氧培養(yǎng)12 h。經(jīng)檢查，本次培養(yǎng)的菌種未見染菌、菌體形態(tài)較好；
2、二級(jí)種子培養(yǎng)在200升發(fā)酵罐中裝有二級(jí)種子培養(yǎng)基100升，121°C滅菌20min，培養(yǎng)基迅速降至36-37°C，接入長好的一級(jí)種子3000毫升，在36_37°C厭氧培養(yǎng)16 h。經(jīng)檢查，本次培養(yǎng)的菌種未見染菌、菌體形態(tài)較好；
3、發(fā)酵在2m3發(fā)酵罐中裝有發(fā)酵培養(yǎng)基1200升，121°C滅菌20min，培養(yǎng)基迅速降至 36-37°C。接入長好的二級(jí)種子100升。以氮?dú)饪刂乒迚?. 02MPa -0. (MMI^a，在34_46°C 厭氧培養(yǎng)至38h。檢驗(yàn)放罐發(fā)酵液的菌落總數(shù)為2. 2X IO9個(gè)/ml，芽孢率97% ；
4、發(fā)酵過程中采用以下中間控制方法
4. 1發(fā)酵至1 開始流加碳源葡萄糖培養(yǎng)基，至30h結(jié)束，補(bǔ)入葡萄糖培養(yǎng)基總體積為 200 升；
4. 2發(fā)酵至14 h開始流加氮源豆粉水解液培養(yǎng)基，至2 結(jié)束，補(bǔ)入豆粉水解液培養(yǎng)基總體積為200升；
4. 3發(fā)酵至12h開始使用氨水流加調(diào)節(jié)pH，使發(fā)酵液控制pH6. 4-6. 6 ；
4. 4發(fā)酵過程中采用間歇式攪拌，每隔30分鐘開啟攪拌3分鐘，保持培養(yǎng)基濃度均衡；
4. 5本實(shí)施例發(fā)酵過程中總補(bǔ)料量為400升；
4、6發(fā)酵結(jié)束前他逐步將發(fā)酵溫度提高至46°C，直至芽抱形成率> 96%結(jié)束發(fā)酵；
5、本實(shí)施例中，碳源葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)基經(jīng)過110°C，15分鐘的蒸汽濕熱實(shí)罐滅菌，氮源豆粉水解液培養(yǎng)基經(jīng)過121°C，20分鐘的蒸汽濕熱實(shí)罐滅菌以保證純種培養(yǎng)；
6、菌體收集經(jīng)檢驗(yàn)合格的發(fā)酵菌液，采用碟片式離心機(jī)收集菌體，獲得濕菌泥并使用純化水反復(fù)沖洗菌泥；
7、添加保護(hù)劑保護(hù)劑配制好后需經(jīng)過110°C，15分鐘的蒸汽濕熱實(shí)罐消毒。濕菌泥稱重，按濕菌泥保護(hù)劑=1: 6的重量比，加入保護(hù)劑，并且混合均勻；
8、噴霧干燥制粉將混合好的配有保護(hù)劑的菌泥，噴霧干燥，即得酪酸菌干燥粉活菌制劑；其中進(jìn)風(fēng)溫度控制在88-92°C ；
9、菌粉檢驗(yàn)本實(shí)施例所制得的酪酸菌干燥粉活菌制劑，經(jīng)檢驗(yàn)每克菌粉含酪酸菌活菌數(shù)不少于1. OX IOltl個(gè)。本實(shí)施例所說各種酪酸菌培養(yǎng)基配方及保護(hù)劑配方由下述原料及重量百分比組成
一級(jí)種子培養(yǎng)基配方
葡萄糖2. 0%、牛肉膏1. 0%、酵母浸膏0. 3%、磷酸氫二鉀0. 02%、氯化鈉0. 1%、水 96. 58%，培養(yǎng)基的 pH 6. 5。二級(jí)種子培養(yǎng)基配方
葡萄糖2. 5 %、蛋白胨1. 5%、酵母粉1. 5%、磷酸氫二鉀0. 04%、氯化鈉0. 1%、硫酸鎂0. 05%、水 94. 31%,培養(yǎng)基的 pH 6. 6。發(fā)酵培養(yǎng)基配方
葡萄糖3. 3%、酵母粉1. 5%、黃豆粉3. 0%、磷酸氫二鉀0. 05%、硫酸鎂0. 05%、碳酸鈣 0. 5%、硫酸錳0. 00 、水91. 6%，培養(yǎng)基的pH6. 5。流加碳源葡萄糖培養(yǎng)基配方葡萄糖10%，水90%，培養(yǎng)基的PH自然。流加氮源豆粉水解液培養(yǎng)基配方
豆粉水解液5. 0%、磷酸二氫鉀0. 1%、硫酸鎂0. 1%、水94. 8%，培養(yǎng)基的pH自然。流加氨水重量百分濃度為24. 0%。添加的保護(hù)劑配方
脫脂奶粉10%、海藻糖3%、10%淀粉、甘油2%、維生素CO. 5%、水74. 5%，培養(yǎng)基的pH自然。
實(shí)施例2 (以2m3發(fā)酵罐為例)
酪酸菌活菌制劑的制備方法依次由下述工藝步驟組成
1、一級(jí)種子培養(yǎng)在5000ml三角瓶中裝有一級(jí)種子種子培養(yǎng)基3000ml，121°C濕熱滅菌30min后，培養(yǎng)基迅速降至36°C。取酪酸菌種子凍干管菌種，接種于酪酸菌三角瓶一級(jí)種子培養(yǎng)基中，在;34-35°C厭氧培養(yǎng)14 h。經(jīng)檢查，本次培養(yǎng)的菌種未見染菌、菌體形態(tài)較好；
2、二級(jí)種子培養(yǎng)在200升發(fā)酵罐中裝有二級(jí)種子培養(yǎng)基100升，121°C滅菌20min，培養(yǎng)基迅速降至36-37°C，接入長好的一級(jí)種子9000毫升，在35-36°C厭氧培養(yǎng)12 h。經(jīng)檢查，本次培養(yǎng)的菌種未見染菌、菌體形態(tài)較好；
3、發(fā)酵在2m3發(fā)酵罐中裝有發(fā)酵培養(yǎng)基1200升，121°C滅菌20min，培養(yǎng)基迅速降至 36-37°C。接入長好的二級(jí)種子100升。以氮?dú)饪刂乒迚?. 03MPa -0. 04MPa，在;35_42°C 厭氧培養(yǎng)至32h。本次檢驗(yàn)放罐發(fā)酵液的菌落總數(shù)為2. 6X IO9個(gè)/ml，芽孢率97% ；
4、發(fā)酵過程中采用以下中間控制方法
4. 1發(fā)酵至1 開始流加碳源葡萄糖培養(yǎng)基，至24h結(jié)束，補(bǔ)入葡萄糖培養(yǎng)基總體積為 240 升;
4. 2發(fā)酵至14 h開始流加氮源豆粉水解液培養(yǎng)基，至2 結(jié)束，補(bǔ)入氮源豆粉水解液培養(yǎng)基總體積為240升；
4. 3發(fā)酵至12h開始使用氨水流加調(diào)節(jié)pH，使發(fā)酵液控制PH6. 5-6. 6 ；
4. 4發(fā)酵過程中采用間歇式攪拌，每隔30分鐘開啟攪拌3分鐘，保持培養(yǎng)基濃度均衡；
4. 5本實(shí)施例發(fā)酵過程中總補(bǔ)料量為480升；4、6發(fā)酵結(jié)束前4h逐步將發(fā)酵溫度提高至42°C，直至芽抱形成率> 96%結(jié)束發(fā)酵；
5、本實(shí)施例中碳源葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)基經(jīng)過110°C，15分鐘的蒸汽濕熱實(shí)罐滅菌，氮源豆粉水解液培養(yǎng)基經(jīng)過121°C，20分鐘的蒸汽濕熱實(shí)罐滅菌以保證純種培養(yǎng)；
6、菌體收集經(jīng)檢驗(yàn)合格的發(fā)酵菌液，采用碟片式離心機(jī)收集菌體，獲得濕菌泥并使用純化水反復(fù)沖洗菌泥；
7、添加保護(hù)劑保護(hù)劑配制好后需經(jīng)過110°C，15分鐘的蒸汽濕熱實(shí)罐消毒。濕菌泥稱重，按濕菌泥保護(hù)劑=1: 9的重量比，加入保護(hù)劑，并且混合均勻；
8、噴霧干燥制粉將混合好的配有保護(hù)劑的菌泥，噴霧干燥，即得酪酸菌干燥粉活菌制劑；其中進(jìn)風(fēng)溫度控制在86-88°C ；
9、菌粉檢驗(yàn)本實(shí)施例所制得的酪酸菌干燥粉活菌制劑，經(jīng)檢驗(yàn)每克菌粉含酪酸菌活菌數(shù)不少于1. OX IOltl個(gè)；
10、成品包裝將干燥后的菌粉使用鋁箔塑料袋真空包裝。本實(shí)施例所說各種酪酸菌培養(yǎng)基配方及保護(hù)劑配方由下述原料及重量百分比組成
一級(jí)種子培養(yǎng)基配方
葡萄糖2. 2%、牛肉膏1. 2%、酵母浸膏0. 5%、磷酸氫二鉀0. 03%、氯化鈉0. 15%、水 95. 92%，培養(yǎng)基的 pH 6. 6。二級(jí)種子培養(yǎng)基配方
葡萄糖2. 3 %、蛋白胨1. 4%、酵母粉1. 2%、磷酸氫二鉀0. 03%、氯化鈉0. 15%、硫酸鎂0. 04%、水 94. 88%,培養(yǎng)基的 pH 6. 7。發(fā)酵培養(yǎng)基配方
葡萄糖3. 5%、酵母粉1. 8%、黃豆粉3. 2%、磷酸氫二鉀0. 1%、硫酸鎂0. 1%、碳酸鈣 0. 4%、硫酸錳0. 00 、水90. 89%，培養(yǎng)基的pH6. 6。流加碳源葡萄糖培養(yǎng)基配方葡萄糖15%，水85%，培養(yǎng)基的pH自然。流加氮源豆粉水解液培養(yǎng)基配方
豆粉水解液8. 0%、磷酸二氫鉀0. 1%、硫酸鎂0. 1%、水91. 2%，培養(yǎng)基的pH自然。流加氨水重量百分濃度為17. 0%。添加的保護(hù)劑配方
脫脂奶粉12%、海藻糖3%、15%淀粉、甘油2%、維生素CO. 5%、水67. 5 %，培養(yǎng)基的pH自然。
實(shí)施例3 (以5m3發(fā)酵罐為例)
酪酸菌活菌制劑的制備方法依次由下述工藝步驟組成
1、一級(jí)種子培養(yǎng)在5000ml三角瓶中裝有一級(jí)種子培養(yǎng)基3000ml，裝3瓶，121°C濕熱滅菌30min后，培養(yǎng)基迅速降至37°C。取酪酸菌種子凍干管菌種，分別接種于酪酸菌三角瓶一級(jí)種子培養(yǎng)基中，在34-38°C厭氧培養(yǎng)13 h。經(jīng)檢查，本次培養(yǎng)的菌種未見染菌、菌體形態(tài)較好；
2、二級(jí)種子培養(yǎng)在500升發(fā)酵罐中裝有二級(jí)種子培養(yǎng)基250升，121°C滅菌20min，培養(yǎng)基迅速降至36-37°C，接入長好的一級(jí)種子9000毫升，在35_38°C厭氧培養(yǎng)12h。經(jīng)檢查， 本次培養(yǎng)的菌種未見染菌、菌體形態(tài)較好；
3、發(fā)酵在5m3發(fā)酵罐中裝有發(fā)酵培養(yǎng)基3500升，121°C滅菌20min，培養(yǎng)基迅速降至 36-37°C。接入長好的二級(jí)種子250升。以氮?dú)饪刂乒迚?. 03MPa -0. 04MPa，在;M_46°C 厭氧培養(yǎng)至38h。本次檢驗(yàn)放罐發(fā)酵液的菌落總數(shù)為2. 6X IO9個(gè)/ml，芽孢率98% ；
4、發(fā)酵過程中采用以下中間控制方法
4. 1發(fā)酵至1 開始流加碳源葡萄糖培養(yǎng)基，至30h結(jié)束，補(bǔ)入葡萄糖培養(yǎng)基總體積為 400 升；
4. 2發(fā)酵至14 h開始流加氮源豆粉水解液培養(yǎng)基，至2 結(jié)束，補(bǔ)入豆粉水解液培養(yǎng)基總體為400升；
4. 3發(fā)酵至12h開始使用氨水流加調(diào)節(jié)pH，使發(fā)酵液控制PH6. 4-6. 8 ；
4. 4發(fā)酵過程中采用間歇式攪拌，每隔30分鐘開啟攪拌3分鐘，保持培養(yǎng)基濃度均衡；
4. 5本實(shí)施例發(fā)酵過程中總補(bǔ)料量為800升；
4、6發(fā)酵結(jié)束前證逐步將發(fā)酵溫度提高至42°C，直至芽抱形成率> 96%結(jié)束發(fā)酵；
5、本實(shí)施例中碳源葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)基經(jīng)過110°C，15分鐘的蒸汽濕熱實(shí)罐滅菌，氮源豆粉水解液培養(yǎng)基經(jīng)過121°C，20分鐘的蒸汽濕熱實(shí)罐滅菌以保證純種培養(yǎng)；
6、菌體收集經(jīng)檢驗(yàn)合格的發(fā)酵菌液，采用碟片式離心機(jī)收集菌體，獲得濕菌泥并使用純化水反復(fù)沖洗菌泥；
7、添加保護(hù)劑保護(hù)劑配制好后需經(jīng)過110°C，15分鐘的蒸汽濕熱實(shí)罐消毒。濕菌泥稱重，按濕菌泥保護(hù)劑=1:7的重量比，加入保護(hù)劑，并且混合均勻；
8、噴霧干燥制粉將混合好的配有保護(hù)劑的菌泥，通過噴霧塔進(jìn)行噴霧干燥，即得酪酸菌干燥粉活菌制劑；其中進(jìn)風(fēng)溫度控制在87-90°C ；
、菌粉檢驗(yàn)本實(shí)施例所制得的酪酸菌干燥粉活菌制劑，經(jīng)檢驗(yàn)每克菌粉含酪酸菌活菌數(shù)不少于1. OX IOltl個(gè)；
10、成品包裝將干燥后的菌粉使用鋁箔塑料袋真空包裝。本實(shí)施例所說各種酪酸菌培養(yǎng)基配方及保護(hù)劑配方由下述原料及重量百分比組成
一級(jí)種子培養(yǎng)基配方
葡萄糖2. 5%、牛肉膏2. 0%、酵母浸膏0. 5%、磷酸氫二鉀0. 05%、氯化鈉0. 20%、水 94. 75%，培養(yǎng)基的 pH 6. 0。二級(jí)種子培養(yǎng)基配方
葡萄糖1. 5 %、蛋白胨1. 0%、酵母粉0. 5%、磷酸氫二鉀0. 05%、氯化鈉0. 2%、硫酸鎂0. 1%、水 96. 65%,培養(yǎng)基的 pH 6. 7。發(fā)酵培養(yǎng)基配方
葡萄糖4. 5%、酵母粉2. 0%、黃豆粉2. 0%、磷酸氫二鉀0. 05%、硫酸鎂0. 04%、碳酸鈣 0. 3%、硫酸錳0. 00 、水91. 11%，培養(yǎng)基的pH5. 8。流加碳源葡萄糖培養(yǎng)基配方葡萄糖15%，水85%，培養(yǎng)基的pH自然。流加氮源豆粉水解液培養(yǎng)基配方豆粉水解液9. 0%、磷酸二氫鉀0. 1%、硫酸鎂0. 1%、水90. 8%，培養(yǎng)基的pH自然。流加氨水重量百分濃度為23. 0%。添加的保護(hù)劑配方
脫脂奶粉13%、海藻糖3%、14%淀粉、甘油2%、維生素CO. 5%、水67. 5 %，培養(yǎng)基的pH自然。
實(shí)施例4 (以5m3發(fā)酵罐為例)
酪酸菌活菌制劑的制備方法依次由下述工藝步驟組成
1、一級(jí)種子培養(yǎng)在5000ml三角瓶中裝有一級(jí)種子培養(yǎng)基3000ml，裝3瓶，121°C濕熱滅菌30min后，培養(yǎng)基迅速降至36-37°C。取酪酸菌生產(chǎn)種子凍干管菌種，分別接種于酪酸菌三角瓶一級(jí)種子培養(yǎng)基中，在37°C厭氧培養(yǎng)12h。經(jīng)檢查，本次培養(yǎng)的菌種未見染菌、 菌體形態(tài)較好；
2、二級(jí)種子培養(yǎng)在500升發(fā)酵罐中裝有二級(jí)種子培養(yǎng)基250升，121°C滅菌20min，培養(yǎng)基迅速降至36-37°C，接入長好的一級(jí)種子9000毫升，在37°C厭氧培養(yǎng)12 h。經(jīng)檢查，本次培養(yǎng)的菌種未見染菌、菌體形態(tài)較好；
3、發(fā)酵在5m3發(fā)酵罐中裝有發(fā)酵培養(yǎng)基3000升，121°C滅菌20min，培養(yǎng)基迅速降至 36-37°C。接入長好的二級(jí)種子250升。以氮?dú)饪刂乒迚?. 03MPa -0. 04MPa，在36_44°C 厭氧培養(yǎng)至37h。本次檢驗(yàn)放罐發(fā)酵液的菌落總數(shù)為2. 3X IO9個(gè)/ml，芽孢率97% ；
4、發(fā)酵過程中采用以下中間控制方法
4. 1發(fā)酵至1 開始流加碳源葡萄糖培養(yǎng)基，至29h結(jié)束，補(bǔ)入葡萄糖培養(yǎng)基總體積為 600 升；
4. 2發(fā)酵至14 h開始流加氮源豆粉水解液培養(yǎng)基，至2 結(jié)束，補(bǔ)入豆粉水解液培養(yǎng)基總體積為600升；
4. 3發(fā)酵至12h開始使用氨水流加調(diào)節(jié)pH，使發(fā)酵液控制PH6. 5-6. 6 ；
4. 4發(fā)酵過程中采用間歇式攪拌，每隔30分鐘開啟攪拌3分鐘，保持培養(yǎng)基濃度均衡；
4. 5本實(shí)施例發(fā)酵過程中總補(bǔ)料量為1200升；
4、6發(fā)酵結(jié)束前他逐步將發(fā)酵溫度提高至44°C，直至芽抱形成率> 96%結(jié)束發(fā)酵；
5、本實(shí)施例碳源葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)基經(jīng)過110°C，15分鐘的蒸汽濕熱實(shí)罐滅菌，氮源豆粉水解液培養(yǎng)基經(jīng)過121°C，20分鐘的蒸汽濕熱實(shí)罐滅菌以保證純種培養(yǎng)；
6、菌體收集經(jīng)檢驗(yàn)合格的發(fā)酵菌液，采用碟片式離心機(jī)收集菌體，獲得濕菌泥并使用純化水反復(fù)沖洗菌泥；
7、添加保護(hù)劑濕菌泥稱重，按濕菌泥保護(hù)劑=1:13的重量比，加入保護(hù)劑，并且混合均勻；
8、噴霧干燥制粉將混合好的配有保護(hù)劑的菌泥，通過噴霧塔進(jìn)行噴霧干燥，即得酪酸菌干燥粉活菌制劑；其中進(jìn)風(fēng)溫度控制在87-89°C ；
9、菌粉檢驗(yàn)本實(shí)施例所制得的酪酸菌干燥粉活菌制劑，經(jīng)檢驗(yàn)每克菌粉含酪酸菌活菌數(shù)不少于1. OX IOltl個(gè)；
10、成品包裝將干燥后的菌粉使用鋁箔塑料袋真空包裝。本實(shí)施例所說各種酪酸菌培養(yǎng)基配方及保護(hù)劑配方由下述原料及重量百分比組成
一級(jí)種子培養(yǎng)基配方
葡萄糖2. 4%、牛肉膏1. 3%、酵母浸膏0. 5%、磷酸氫二鉀0. 04%,氯化鈉0. 1%、水 95. 66%、培養(yǎng)基的 pH 6. 8。二級(jí)種子培養(yǎng)基配方
葡萄糖2. 5%、蛋白胨1. 4%,酵母粉1. 5%、磷酸氫二鉀0. 05%、氯化鈉0. 15%、硫酸鎂0. 05%、水 94. 35%,培養(yǎng)基的 pH 6. 5。發(fā)酵培養(yǎng)基配方
葡萄糖3. 9%、酵母粉1. 7%、黃豆粉3. 4%,磷酸氫二鉀0. 05%、硫酸鎂0. 05%、碳酸鈣0. 5%、硫酸錳0. 00 、水90. 4%，培養(yǎng)基的pH6. 8。流加碳源葡萄糖培養(yǎng)基配方葡萄糖15%，水85%，培養(yǎng)基的pH自然。流加氮源豆粉水解液培養(yǎng)基配方
豆粉水解液6. 0%、磷酸二氫鉀0. 1%、硫酸鎂0. 1%、水93. 8%，培養(yǎng)基的pH自然。流加氨水重量百分濃度為22. 0%。添加的保護(hù)劑配方
脫脂奶粉11%、海藻糖3%、12%淀粉、甘油2%、維生素CO. 5%、水71. 5 %，培養(yǎng)基的pH自然。實(shí)施例5 (以2m3發(fā)酵罐為例)
—級(jí)種子培養(yǎng)在5000ml三角瓶中裝有一級(jí)種子培養(yǎng)基3000ml，分裝兩瓶，121°C
濕熱滅菌30min后，培養(yǎng)基迅速降至36-37°C。取酪酸菌種子凍干管菌種，分別接種于酪酸菌三角瓶一級(jí)種子培養(yǎng)基中，在36°C厭氧培養(yǎng)14h;所用培養(yǎng)基的原料及用量為葡萄糖 2. 0%、牛肉膏1. 0%、酵母浸膏0. 3%、磷酸氫二鉀0. 02%、氯化鈉0. 1%、水96. 58%，培養(yǎng)基的 pH 6. 5。2) 二級(jí)種子培養(yǎng)在200升發(fā)酵罐中裝有二級(jí)種子培養(yǎng)基120升，121°C滅菌
20min，培養(yǎng)基迅速降至36-37°C，接入長好的一級(jí)種子6000毫升。在35°C厭氧培養(yǎng)13h; 所用培養(yǎng)基的原料及用量為葡萄糖2. 3 %、蛋白胨1. 4%、酵母粉1. 2%、磷酸氫二鉀0. 03%、 氯化鈉0. 15%、硫酸鎂0. 04%、水94. 88%，培養(yǎng)基的PH 6. 7。③發(fā)酵在2m3發(fā)酵罐中裝有發(fā)酵培養(yǎng)基1330升，121°C滅菌20min，培養(yǎng)基迅速
降至36-37°C。接入長好的二級(jí)種子119. 7升。以氮?dú)饪刂乒迚?. 04MPa，在46°C厭氧培養(yǎng)38h ；所用培養(yǎng)基的原料及用量為葡萄糖3. 9%、酵母粉1. 7%、黃豆粉3. 4%,磷酸氫二鉀 0. 05%、硫酸鎂0. 05%、碳酸鈣0. 5%、硫酸錳0. 00 、水90. 4%，培養(yǎng)基的pH6. 8。當(dāng)發(fā)酵至14 h開始流加由葡萄糖15%，水85%配制成的碳源葡萄糖補(bǔ)料培養(yǎng)基，至發(fā)酵結(jié)束前8小時(shí)；檢驗(yàn)放罐發(fā)酵液的菌落總數(shù)為2. 9X IO9個(gè)/ml，芽孢率97%.
當(dāng)發(fā)酵至Hh開始流加由豆粉水解液8. 0%、磷酸二氫鉀0. 1%、硫酸鎂0. 1%、水91.洲配制成的氮源豆粉水解液補(bǔ)料培養(yǎng)基，至發(fā)酵結(jié)束前10小時(shí)；當(dāng)發(fā)酵至1 開始使用重量百分濃度23. 0%的氨水流加調(diào)節(jié)pH，使發(fā)酵液控制PH6. 5 ； 發(fā)酵過程中采用間歇式攪拌，保持培養(yǎng)基濃度均衡；
發(fā)酵過程中碳源葡萄糖補(bǔ)料培養(yǎng)基與氮源豆粉水解液補(bǔ)料培養(yǎng)基的加入體積比為1 1，本實(shí)施例發(fā)酵過程中總補(bǔ)料量為340升；
發(fā)酵結(jié)束前證逐步將發(fā)酵溫度提高至42°C，直至芽抱形成率> 96%，結(jié)束發(fā)酵。④菌體收集經(jīng)檢驗(yàn)合格的發(fā)酵菌液，采用碟片式離心機(jī)收集菌體，獲得濕菌泥并使用純化水反復(fù)沖洗菌泥。2)添加保護(hù)劑將所得的濕菌泥稱重，按濕菌泥保護(hù)劑=1: 9的重量比，加入由
脫脂奶粉10%、海藻糖3%、10%淀粉、甘油2%、維生素CO. 5%、水74. 5%配制的保護(hù)劑，混合均勻。⑥噴霧干燥制粉將混合好的配有保護(hù)劑的菌泥，噴霧干燥，即得酪酸菌干燥菌粉活菌制劑；其中進(jìn)風(fēng)溫度控制在85-95°C。3)菌粉檢驗(yàn)每克菌粉含酪酸菌活菌數(shù)不少于1. OX 101°個(gè)。上述實(shí)施例1-實(shí)施例5中所涉及的酪酸菌種子凍干管菌種，是申請(qǐng)人從位于北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學(xué)院微生物研究所內(nèi)的“中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心”購得，菌種編號(hào)1. 2709，菌種名稱Clostridium butyricum。
權(quán)利要求
1.采用補(bǔ)料分批發(fā)酵法制備高密度酪酸菌活菌制劑的方法，其特征在于包括下述步驟①一級(jí)種子培養(yǎng)取酪酸菌種子凍干管菌種，接種于酪酸菌三角瓶一級(jí)種子培養(yǎng)基中， 在34-38°C厭氧培養(yǎng)12 16h;所用培養(yǎng)基的原料及用量為葡萄糖0. 5%_2. 5 %、牛肉膏 0. 5% -2. 0%、酵母浸膏 0. 3% -0. 5%、磷酸氫二鉀 0. 01% -0. 05%、氯化鈉 0. 1%-0. 2 %、水 94. 75-98. 59%，培養(yǎng)基的 pH 6. 0-7. 0 ；②二級(jí)種子培養(yǎng)將一級(jí)種子接種于酪酸菌二級(jí)種子培養(yǎng)基中，接種量為酪酸菌二級(jí)種子培養(yǎng)基體積的3 9% ；在34-38°C厭氧培養(yǎng)12 16h;所用培養(yǎng)基的原料及用量為葡萄糖 1. 5%-2. 5 %、蛋白胨 1. 0% -1. 5%、酵母粉 0. 5% -1. 5%、磷酸氫二鉀 0. 02% -0. 05%、氯化鈉 0. 1%-0. 2 %、硫酸鎂 0. 02%-0. 1%、水 94. 15-96. 86%，培養(yǎng)基的 pH 6. 0-7. 2 ；③發(fā)酵將二級(jí)種子接種于酪酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為酪酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基體積的 3 9%;以氮?dú)饪刂乒迚?. 02MPa -0. 04MPa，在;M_46°C厭氧培養(yǎng)32_38h ；所用培養(yǎng)基的原料及用量為葡萄糖3. 0%-5. 0%、酵母粉1. 0% -2. 5%、黃豆粉2. 0% -3. 5%、磷酸氫二鉀 0. 05% -0. 1%、硫酸鎂 0. 05%-0. 1%、碳酸鈣 0. 3%-0. 6%、硫酸猛 0. 002%、水 88. 2%-93. 6%, 培養(yǎng)基的PH 5. 8-7. 5 ；當(dāng)發(fā)酵至12-14 h開始流加由葡萄糖10%-20%、水80%-90%配制成的碳源葡萄糖補(bǔ)料培養(yǎng)基，至發(fā)酵結(jié)束前8小時(shí)；當(dāng)發(fā)酵至13-15 h開始流加由豆粉水解液5.0%-10.0%、磷酸二氫鉀0. 1%、硫酸鎂0. 1%、 水89. 8-94. 8%配制成的氮源豆粉水解液補(bǔ)料培養(yǎng)基，至發(fā)酵結(jié)束前10小時(shí)；當(dāng)發(fā)酵至1 開始使用重量百分濃度17. 0%-24. 0%的氨水流加調(diào)節(jié)pH，使發(fā)酵液控制 PH6. 4-6. 8 ；發(fā)酵過程中采用間歇式攪拌，保持培養(yǎng)基濃度均衡；發(fā)酵過程中碳源葡萄糖補(bǔ)料培養(yǎng)基與氮源豆粉水解液補(bǔ)料培養(yǎng)基的加入體積比為1 1，但總補(bǔ)料量控制在初始發(fā)酵培養(yǎng)基體積的20-4096，最終發(fā)酵液裝料系數(shù)為80-9 ； 發(fā)酵結(jié)束前4- 逐步將發(fā)酵溫度提高至42-46 °C，直至芽抱形成率> 96%，結(jié)束發(fā)酵； Φ菌體收集經(jīng)檢驗(yàn)合格的發(fā)酵菌液，采用碟片式離心機(jī)收集菌體，獲得濕菌泥并使用純化水反復(fù)沖洗菌泥；⑤添加保護(hù)劑將所得的濕菌泥稱重，按濕菌泥保護(hù)劑=1: 4-30的重量比，加入由脫脂奶粉5%-15%、海藻糖2%-5%、淀粉5%-15%、甘油2%_3%、維生素CO. 5%_1%、水61%_85. 5%配制的保護(hù)劑，混合均勻；⑧噴霧干燥制粉將混合好的配有保護(hù)劑的菌泥，噴霧干燥，即得酪酸菌干燥菌粉活菌制劑；其中進(jìn)風(fēng)溫度控制在85-120°C ；⑦菌粉檢驗(yàn)每克菌粉含酪酸菌活菌數(shù)不少于1.0X 101°個(gè)；上述各級(jí)種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基、補(bǔ)料培養(yǎng)基、保護(hù)劑均需要經(jīng)過110_123°C，15-30 分鐘的蒸汽濕熱實(shí)罐滅菌，滅菌后，培養(yǎng)基要迅速降至36-37°C ；上述各級(jí)種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基、補(bǔ)料培養(yǎng)基中的原料用量均為重量百分比；配制時(shí)保證所用原料的重量百分比之和為100%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用補(bǔ)料分批發(fā)酵法制備高密度酪酸菌活菌制劑的方法，其特征在于包括下述步驟①一級(jí)種子培養(yǎng)取酪酸菌種子凍干管菌種，接種于酪酸菌三角瓶一級(jí)種子培養(yǎng)基中， 在36°C厭氧培養(yǎng)14h;所用培養(yǎng)基的原料及用量為葡萄糖2. 0%、牛肉膏1. 0%、酵母浸膏 0. 3%、磷酸氫二鉀0. 02%、氯化鈉0. 1%、水96. 58%，培養(yǎng)基的pH 6. 5 ；②二級(jí)種子培養(yǎng)將一級(jí)種子接種于酪酸菌二級(jí)種子培養(yǎng)基中，接種量為酪酸菌二級(jí)種子培養(yǎng)基體積的5% ；在35°C厭氧培養(yǎng)13h;所用培養(yǎng)基的原料及用量為葡萄糖2. 3 %、 蛋白胨1. 4%、酵母粉1. 2%、磷酸氫二鉀0. 03%、氯化鈉0. 15%、硫酸鎂0. 04%、水94. 88%，培養(yǎng)基的PH 6. 7 ；③發(fā)酵將二級(jí)種子接種于酪酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為酪酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基體積的 9% ；以氮?dú)饪刂乒迚?. 04MPa，在46°C厭氧培養(yǎng)38h ；所用培養(yǎng)基的原料及用量為葡萄糖 3.9%、酵母粉1.7%、黃豆粉3. 496，磷酸氫二鉀0. 05%、硫酸鎂0. 05%、碳酸鈣0. 5%、硫酸錳 0. 002%、水 90. 45%,培養(yǎng)基的 pH6. 8 ；當(dāng)發(fā)酵至14 h開始流加由葡萄糖15%，水85%配制成的碳源葡萄糖補(bǔ)料培養(yǎng)基，至發(fā)酵結(jié)束前8小時(shí)；當(dāng)發(fā)酵至Hh開始流加由豆粉水解液8. 0%、磷酸二氫鉀0. 1%、硫酸鎂0. 1%、水91.洲配制成的氮源豆粉水解液補(bǔ)料培養(yǎng)基，至發(fā)酵結(jié)束前10小時(shí)；當(dāng)發(fā)酵至1 開始使用重量百分濃度23. 0%的氨水流加調(diào)節(jié)pH，使發(fā)酵液控制pH6. 5 ； 發(fā)酵過程中采用間歇式攪拌，保持培養(yǎng)基濃度均衡；發(fā)酵過程中碳源葡萄糖補(bǔ)料培養(yǎng)基與氮源豆粉水解液補(bǔ)料培養(yǎng)基的加入體積比為1 1，但總補(bǔ)料量控制在初始發(fā)酵培養(yǎng)基體積的3096，最終發(fā)酵液裝料系數(shù)為90% ；發(fā)酵結(jié)束前證逐步將發(fā)酵溫度提高至42°C，直至芽抱形成率> 96%，結(jié)束發(fā)酵；④菌體收集經(jīng)檢驗(yàn)合格的發(fā)酵菌液，采用碟片式離心機(jī)收集菌體，獲得濕菌泥并使用純化水反復(fù)沖洗菌泥；⑤添加保護(hù)劑將所得的濕菌泥稱重，按濕菌泥保護(hù)劑=1:9的重量比，加入由脫脂奶粉10%、海藻糖3%、10%淀粉、甘油2%、維生素CO. 5%、水74. 5%配制的保護(hù)劑，混合均勻；⑥噴霧干燥制粉將混合好的配有保護(hù)劑的菌泥，噴霧干燥，即得酪酸菌干燥菌粉活菌制劑；其中進(jìn)風(fēng)溫度控制在85-95°C ；⑦菌粉檢驗(yàn)每克菌粉含酪酸菌活菌數(shù)不少于1.0X101°個(gè)。
全文摘要
本發(fā)明公開了采用補(bǔ)料分批發(fā)酵法制備高密度酪酸菌活菌制劑的方法，該方法是由酪酸菌在酪酸菌種子培養(yǎng)基中經(jīng)二級(jí)種子擴(kuò)大培養(yǎng)和在酪酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，在發(fā)酵過程中通過補(bǔ)充碳源、氮源以及用氨水來調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值等代謝調(diào)控措施，來增加酪酸菌的菌體數(shù)、芽孢體的轉(zhuǎn)化率以及發(fā)酵罐裝料系數(shù)，再經(jīng)菌體收集、添加保護(hù)劑、噴霧干燥制粉、菌粉檢驗(yàn)、包裝工序制得;本發(fā)明方法生產(chǎn)周期短，酪酸菌的培養(yǎng)密度高，活菌數(shù)目較高，生產(chǎn)成本較低，能夠大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。
文檔編號(hào)A61K35/74GK102319270SQ20111028780
公開日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月26日
發(fā)明者丁立, 胡軍, 蔡翔, 陳從富 申請(qǐng)人:湖北綠雪生物產(chǎn)業(yè)有限公司