一種重組大腸桿菌高密度培養(yǎng)生產(chǎn)四氫嘧啶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵工程領(lǐng)域，具體涉及一種微生物發(fā)酵生產(chǎn)四氫嘧啶的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 四氫啼陡（1，4, 5, 6-tetrahydr〇-2-methyl-4-pyrimidineca;rboxylic acid ; ectoine)是一種在耐鹽及嗜鹽微生物中應(yīng)用最為廣泛的滲透壓調(diào)節(jié)物。四氫嘧啶分子具有 高度水溶性、不帶電荷的特點(diǎn)，在高鹽環(huán)境下細(xì)胞可通過四氫嘧啶的高濃度積累提高胞內(nèi) 滲透壓，卻不會(huì)影響胞內(nèi)生物大分子正常的生理功能。研究表明在高鹽、高溫、冷凍和干燥 等逆境下四氫嘧啶對(duì)核酸、蛋白質(zhì)、細(xì)胞膜及整個(gè)細(xì)胞可提供保護(hù)作用，因此在生物制劑、 化妝品生產(chǎn)和制藥等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0003] 四氫嘧啶的生產(chǎn)傳統(tǒng)工藝是利用嗜鹽或耐鹽微生物在高鹽環(huán)境下合成積累四氫 嘧啶，而在低鹽環(huán)境下釋放四氫嘧啶的特性，采用"細(xì)菌擠奶（Bacterial milking)"的方 法，通過滲透壓多次循環(huán)沖擊實(shí)現(xiàn)四氫嘧啶的高效分泌合成。該方法使用高鹽培養(yǎng)基易對(duì) 設(shè)備造成腐蝕，而且發(fā)酵產(chǎn)物成份復(fù)雜，增加了下游純化工藝的難度，使得四氫嘧啶的生產(chǎn) 成本居高不下，嚴(yán)重制約了四氫嘧啶的大規(guī)模應(yīng)用。
[0004] 目前現(xiàn)有的生產(chǎn)方法嚴(yán)重制約了四氫嘧啶的工業(yè)化生產(chǎn)和大規(guī)模應(yīng)用，因此開發(fā) 一種高效的四氫嘧啶生產(chǎn)方法從而降低其生產(chǎn)成本，對(duì)四氫嘧啶的應(yīng)用有重要的實(shí)踐意 義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種重組大腸桿菌高密度培養(yǎng)生產(chǎn)四氫嘧啶的方法。
[0006] 本發(fā)明提供的一種制備四氫嘧啶的方法，包括在含L-天冬氨酸鈉的溶液中加入 重組大腸桿菌，經(jīng)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)后即得；其中，所述重組大腸桿菌是表達(dá)了 SEQ ID N2:2所 示蛋白、SEQ ID Ns :3所示蛋白和SEQ ID Ns :4所示蛋白的；
[0007] 所述重組大腸桿菌為含有具有下述任一核苷酸序列的核酸片段的重組大腸桿 菌：
[0008] 1)序列表中SEQ ID Ns :1所示的核苷酸序列；
[0009] 2)編碼序列表中SEQ ID Ns :2、SEQ ID Ns :3和/或SEQ ID Ns :4所示蛋白質(zhì)序 列的多核苷酸序列；
[0010] 3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID N2 :1限定的DNA序列雜交的核苷酸序 列；
[0011] 4)與1)或2)或3)限定的核苷酸序列具有90%以上同源性，且編碼相同功能蛋 白質(zhì)的DNA序列；具體的，所述同源性為95%以上；再具體的為96%以上；再具體的為97%以 上；再具體的為98%以上；再具體的為99%以上。
[0012] 所述方法中，所述重組大腸桿菌具體為將重組載體導(dǎo)入出發(fā)大腸桿菌后得到的重 組菌；所述重組載體具體為在出發(fā)載體pBAD/HisA的多克隆位點(diǎn)插入具有SEQ ID Ns :1所 示核酸序列的DNA片段所得的質(zhì)粒；具體的，所述出發(fā)大腸桿菌為帶有AaraBAD阿拉伯糖 代謝缺陷性狀的大腸桿菌；再具體的，所述出發(fā)大腸桿菌為大腸桿菌BW25113(rrnB3Al ac Z4787hsdR514 A (araBAD)567 A (rhaBAD)568rph-l)。
[0013] 所述重組載體具體為口8八04(^48(：，其核苷酸序列如序列表中的3￡〇10施.5所 /_J、i〇
[0014] 所述方法中，所述重組大腸桿菌具體為大腸埃希氏菌Escherichia coli Bff-pBAD-ectABC CGMCC NO. 8334〇
[0015] 所述方法中，所述含L-天冬氨酸鈉的溶液由溶質(zhì)和溶劑組成，溶質(zhì)及其在所述含 L-天冬氨酸鈉的溶液中的濃度如下：
[0016] L-天冬氨酸鈉 2M; 葡萄糖 l〇〇g/L; 甘油 l〇〇g/L; KC1 100g/L； 溶劑為水。
[0017] 所述方法中，所述生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的條件包括：轉(zhuǎn)化溫度為30°C，控制生物轉(zhuǎn)化反 應(yīng)體系的溶氧在20%以上，和維持pH至7. 0。
[0018] 具體的，通過調(diào)整攪拌速度和通氣量控制生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系的溶氧在20%以上， 所述攪拌速度為500轉(zhuǎn)/分鐘，通氣量為2L/min ;具體的，通過2. 7M氨水和1M檸檬酸水溶 液維持pH至7.0。
[0019] 所述方法中，所述生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的過程包括：將所述重組大腸桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)， 得到含有表達(dá)了 SEQ ID Ns :2所示蛋白、SEQ ID Ns :3所示蛋白和SEQ ID Ns :4所示蛋白 的重組大腸桿菌的誘導(dǎo)培養(yǎng)液；向所述誘導(dǎo)培養(yǎng)液中加入所述含L-天冬氨酸鈉的溶液至 L-天冬氨酸鈉終濃度為200mM ;轉(zhuǎn)化培養(yǎng)至葡萄糖被消耗完，開始補(bǔ)加所述含L-天冬氨酸 鈉的溶液，所述含L-天冬氨酸鈉的溶液的流加速度為40mL/h，繼續(xù)進(jìn)行轉(zhuǎn)化培養(yǎng)，繼續(xù)轉(zhuǎn) 化培養(yǎng)過程中一直補(bǔ)加所述含L-天冬氨酸鈉的溶液；轉(zhuǎn)化培養(yǎng)結(jié)束即得四氫嘧啶轉(zhuǎn)化液。
[0020] 所述方法中，所述"將所述重組大腸桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到含有表達(dá)了 SEQ ID Ns :2所示蛋白、SEQ ID Ns :3所示蛋白和SEQ ID Ns :4所示蛋白的重組大腸桿菌的誘導(dǎo)培 養(yǎng)液"的方法包括下述1)和2):
[0021] 1)菌體培養(yǎng)過程：將300mL所述重組大腸桿菌的種子液接種于2. 7L含100 y g/ ml氨芐青霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌培養(yǎng)至葡萄糖消耗完時(shí)流加補(bǔ)料培養(yǎng)基，補(bǔ)料培養(yǎng)基 的流加速度為50mL/h，流加至菌體密度0D600達(dá)到50,菌體培養(yǎng)過程結(jié)束，進(jìn)入誘導(dǎo)培養(yǎng)階 段；
[0022] 2)誘導(dǎo)培養(yǎng)過程：將上述菌體培養(yǎng)后的發(fā)酵液的溫度降至30°C，加入L-阿拉伯 糖，使得L-阿拉伯糖終濃度為lg/L，進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)；誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中要一直流加補(bǔ)料培養(yǎng) 基，補(bǔ)料培養(yǎng)基的流加速度調(diào)至20mL/h ;當(dāng)重組蛋白EctABC的表達(dá)量不再增加時(shí)，誘導(dǎo)培 養(yǎng)過程結(jié)束；
[0023] 所述菌體培養(yǎng)的條件為：培養(yǎng)溫度為37°C，控制菌體培養(yǎng)體系的溶氧在20%以 上，和維持pH至7.0 ;
[0024] 具體的，通過調(diào)整攪拌速度和通氣量控制菌體培養(yǎng)體系的溶氧在20%以上，所述 攪拌速度為500 - 800轉(zhuǎn)/分鐘，通氣量為3L/min ;具體的，通過2. 7M氨水和1M磷酸維持 pH 至 7. 0 ;
[0025] 所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件為：培養(yǎng)溫度為30°C，控制誘導(dǎo)培養(yǎng)體系的溶氧在20%以 上，和維持pH至7.0 ;
[0026] 具體的，通過調(diào)整攪拌速度和通氣量控制誘導(dǎo)培養(yǎng)體系的溶氧在20%以上，所述 攪拌速度為500 - 800轉(zhuǎn)/分鐘，通氣量為3L/min ;具體的，通過2. 7M氨水和1M磷酸維持 pH 至 7. 0 ;
[0027] 每 1L發(fā)酵培養(yǎng)基的配制：葡萄糖 10g，（NH4)2HP048g，KH2P0 413. 3g，MgS04.7H201. 2g， 檸檬酸1. 7g，微量鹽溶液10mL，用水定溶至1L，5M NaOH調(diào)至pH7. 0 ;
[0028] 每1L補(bǔ)料培養(yǎng)基的配制：葡萄糖400g，MgS04 WHWlOg，微量鹽溶液20mL，用水定 容至1L ;
[0029] 每 1L微量鹽溶液的配制：FeS04 WHWlOg，ZnS04.7H2〇2. 25g，CuS04.511201& MnS04 4 H200. 5g，Na2B407 .lOKOO. 23g，CaCl2 .2112028,（NH4)6M〇70 240. lg，用 5M鹽酸水溶液定容，定容至 lL〇
[0030] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基置于NBS Biof 1〇30006L發(fā)酵罐中。
[0031] 所述方法中，所述種子液的制備過程為：挑取所述重組大腸桿菌單菌落接入20ml 含有100 U g/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，于37°C、200rpm培養(yǎng)12小時(shí)；然后將20ml培 養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至300ml含有100ii g/ml氨芐青霉素的種子培養(yǎng)基中，37°C、200rpm振蕩培養(yǎng)12 小時(shí)，即得種子液；
[0032] 所述種子培養(yǎng)基的配制：蛋白胨16g,酵母膏10g,氯化鈉5g,用水定容至1L， pH7. 0。
[0033] 所述方法中，所述生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)完后，還包括胞內(nèi)或胞外四氫嘧啶的抽提過程；
[0034] 所述胞內(nèi)四氫嘧啶的抽提過程包括：
[0035] 取1ml所述四氫嘧啶轉(zhuǎn)化液，8000rpm，20分鐘離心收集菌體，菌體加入500 ill抽 提液，所述抽提液由體積比為10:5:4的甲醇：氯仿：水組成，震蕩1小時(shí)，13000rpm離心 20分鐘促進(jìn)分相；上清轉(zhuǎn)移至新離心管中，加入等體積的體積比為1:1的氯仿：水，振蕩1 小時(shí)，再次13000rpm離心20分鐘，取上層水相至新離心管中，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行干燥， 得到含有四氫嘧啶的干粉；
[0036] 所述胞外四氫嘧啶的抽提過程包括：
[0037] 取所述四氫嘧啶轉(zhuǎn)化液8000rpm離心20分鐘，取上清1ml置于離心管中，加入1ml 氯仿振蕩1小時(shí)，13000rpm離心20分鐘，上清移至新離心管中并置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行干 燥，得到含有四氫嘧啶的干粉。
[0038] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種菌體多批次重復(fù)使用合成四氫嘧啶的方法，所述 方法包括：將每3L按照權(quán)利要求1-8任一所述的方法得到的四氫嘧啶轉(zhuǎn)化液，按照下述步 驟1)和2)操作：
[0039] 1 )8000rpm，20分鐘離心收集菌體，用3L連續(xù)轉(zhuǎn)化液重懸菌體后置于發(fā)酵罐中，轉(zhuǎn) 化培養(yǎng)至葡萄糖消耗完，開始補(bǔ)加轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的流加速度為40mL/h，繼續(xù)進(jìn)行 轉(zhuǎn)化培養(yǎng)，繼續(xù)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)過程中一直補(bǔ)加轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基；轉(zhuǎn)化培養(yǎng)結(jié)束即獲得四氫嘧啶轉(zhuǎn)化 液2 ;
[0040] 所述連續(xù)轉(zhuǎn)化液由溶質(zhì)和溶劑組成，溶質(zhì)及其在所述連續(xù)轉(zhuǎn)化液中的濃度如下：
[0041] L-天冬氨酸鈉 200mM; 葡萄糖 i〇g/L; 甘油 l()g/L; KCl 10 g/L； 溶劑為lOOmM、pH 7.0的PBS緩沖液；
[0042] 所述100mM PBS緩沖液由380ml0. 1M磷酸二氫鈉溶液加入620ml0. 1M磷酸氫二鈉 溶液配置而成；
[0043] 所述轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基由溶質(zhì)和溶劑組成，溶質(zhì)及其在所述轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中的濃度如下：
[0044] L-天冬氨酸鈉 2M; 葡萄糖 l〇〇g/L; 甘油 l〇〇g/L; KCl 100g/L； 溶劑為水；
[0045] 所述轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的條件包括：培養(yǎng)溫度為30°C，控制轉(zhuǎn)化培養(yǎng)體系的溶氧在20%以 上，和維持pH至7.0 ;
[0046] 具體的，通過調(diào)整攪拌速度和通氣量控制生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系的溶氧在20 %以上， 所述攪拌速度為500轉(zhuǎn)/分鐘，通氣量為2L/min ;具