一種向聚酮骨架引入氨基酸來源的側(cè)鏈的生物合成方法及相關(guān)基因的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物基因工程領(lǐng)域，具體涉及聚酮合成體系中，向聚酮骨架引入氨 基酸來源的側(cè)鏈的生物合成方法及生物合成相關(guān)的基因。
【背景技術(shù)】
[0002] 聚酮化合物（polyketides，PKs)是一大類重要的天然產(chǎn)物，廣泛來源于細(xì)菌、真 菌、植物等。包括大環(huán)內(nèi)酯類、蒽環(huán)類、聚醚類、四環(huán)素類。聚酮化合物不僅結(jié)構(gòu)多樣，而且 具有很好的生物學(xué)和藥物活性（Angew Chem Int Ed Engl, 2009，48(26): 4688-4716.)。 如抗細(xì)菌藥(如四環(huán)素，利福霉素)、抗真菌藥(如灰黃霉素、兩性霉素)、抗寄生蟲藥(如阿維 霉素、奈馬克丁)、抗癌藥(如多柔比星、烯二炔)、抗膽固醇藥(如洛伐他?。┑染弁獊碓吹乃?物幾乎已用于所有重要疾病的治療（Nat Prod R印，2001，18(4): 380-416.)。
[0003] 天然聚酮化合物盡管種類繁多，其生物合成機(jī)制卻相對保守，從本質(zhì)而言，被酰 基輔酶A (acyl-CoA)活化的前體物(包括起始單元和延伸單元）在聚酮合酶（PKS)的催 化下進(jìn)行反復(fù)的脫羧一縮合反應(yīng)形成一定長度的聚酮碳骨架，然后再經(jīng)過環(huán)化或芳香化， 甲基化，糖基化，氧化還原，脫水等修飾過程，形成各種各樣結(jié)構(gòu)復(fù)雜的聚酮類化合物。根 據(jù)聚酮合酶的結(jié)構(gòu)及其它性質(zhì)，聚酮合酶被分成I -III型PKS( Curr Opin Chem Biol, 2003，7(2): 285-295.)，其中I型PKS，可分為模塊化PKS和重復(fù)型PKS，模塊化即以模塊 的形式形成多功能酶，其中一整套合成聚酮化合物碳骨架的必需的結(jié)構(gòu)域（domain)聚合 在一起組成一個模塊(module),每個結(jié)構(gòu)域只參與整個聚酮碳鏈構(gòu)建中的一步生化反應(yīng) (non-interative)。重復(fù)型I型PKS和模塊化I型PKS核心結(jié)構(gòu)域類似，不同之處在于重 復(fù)型PKS可以重復(fù)利用某個結(jié)構(gòu)域來合成目的產(chǎn)物。合成聚酮碳鏈的核心結(jié)構(gòu)域包括酰 基轉(zhuǎn)移酶（acyltransferase，AT)、醜基載體蛋白（acyl carrier protein，ACP)和 酮 ?；铣擅福╧etosynthase，KS)組成，首先由作為"門衛(wèi)"（gate keeper)的AT結(jié)構(gòu)域 識別并選擇性地將起始單元和延伸單元上載到ACP的來自于輔酶A (CoA)的磷酸泛酰乙 胺巰基臂上，再由KS將不同的單元經(jīng)過一系列脫羧縮合反應(yīng)（claisen condesation)組 裝成碳骨架。I型PKS主要合成大環(huán)內(nèi)酯，聚醚，聚烯類化合物。II型PKS，也稱迭代型 (iterative)或芳香型PKS，其主要合成蒽環(huán)類，四環(huán)素類等芳香族化合物。II型PKS通過 重復(fù)使用一套結(jié)構(gòu)域，多次催化相同延伸單元的脫羧縮合使聚酮碳骨架得到延伸，形成了 鏈狀的中間體，隨后通過環(huán)化酶和芳構(gòu)化酶催化使之形成芳香環(huán)。III型PKS，屬于查爾酮合 成酶（chalconesynthase，CHS)類，主要負(fù)責(zé)單環(huán)或雙環(huán)芳香類聚酮化合物的生物合成。
[0004] 聚酮衍生的藥物每年涉及的銷售額達(dá)到了數(shù)千億美元，對聚酮天然產(chǎn)物的開 發(fā)是當(dāng)前新藥研發(fā)領(lǐng)域的一個重要方向，所以獲得多樣化聚酮結(jié)構(gòu)類似物是新藥研發(fā)的 首要條件。決定聚酮天然產(chǎn)物多樣性的環(huán)節(jié)基本相同，主要為：1)起始單元，2)延伸 單元和修飾方式，3)骨架解離及4)后修飾（Drug Discov Today, 2009，14(21-22): 1011-1020.)。其中，起始單元和延伸單元作為合成砌塊構(gòu)成了聚酮碳骨架的主鏈和側(cè)鏈； 解離方式?jīng)Q定了碳骨架的環(huán)合或線性化；延伸單元的修飾以及后修飾通常是對碳骨架上的 一些羥基、羰基等活潑基團(tuán)的修飾。對于后修飾產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)變化，通?？梢杂苫瘜W(xué)方法較好 的互補(bǔ)，但對于由起始單元和延伸單元縮合生成的碳骨架，選擇性化學(xué)改造基本無法實現(xiàn)。 不過，通過合成生物學(xué)手段，將PKS中負(fù)責(zé)縮合單元上載的AT模塊替換成識別不同單元的 AT，或通過定點突變的方法改變AT結(jié)構(gòu)域的選擇性，再配以新縮合單元的生物合成途徑， 可以實現(xiàn)在聚酮的碳骨架上選擇性的引入不同的側(cè)鏈，獲得一系列聚酮類似物。這種AT模 塊替換（AT swapping)方法已經(jīng)成為目前創(chuàng)造碳骨架多樣性的最為有效的手段（Nat Rev Micro, 2005. 3(12): 925-36; Curr Opin Microbiol, 2007. 10(3): 238-45; Curr. Opin. Struct. Biol. 2013，23，603-612)。盡管理論上通過這種方法，可以任意修改聚 酮碳骨架，但事實上，通過改變延伸單元得到的衍生物卻很少。其主要原因在于1)天然的 延伸單元結(jié)構(gòu)類型單一；2)聚酮催化模塊，特別是識別延伸單元的?；D(zhuǎn)移蛋白-AT的底 物選擇性較高。
[0005]自然界中存在兩類聚酮延伸單元，輔酶A(CoA)承載和ACP承載的延伸單元（圖1)。 CoA承載的延伸單元應(yīng)用最為普遍，一般通過?；o酶的a羧化（Nat. Prod. R印.2009， 26，90-114)、丙二酸與 CoA連接（Eur. J. Biochem. 1998，257，395-402)、a不飽和 脂肪酸-CoA 的還原羧化（Nat. Prod. R印? 2012，29，72-86; J. Am. Chem. Soc. 2009， 131, 10376-10377 ；J. Am. Chem. Soc. 2010, 133, 976-985 ；J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 1971-1977 ;Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 4667-4670)而合成。ACP 承載的延 伸單元，應(yīng)用范圍較窄，只存在于極少數(shù)的PKS體系（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006， 103, 14349-14354 ；Chem. Biol. 2006, 13, 575-585 ；J. Am. Chem. Soc. 2013, 135, 18032-18035)。CoA承載的延伸單元主要來源于脂肪酸代謝，因此，他們的C-a側(cè)鏈大多屬 于簡單脂肪族化合物。相應(yīng)地，AT結(jié)構(gòu)域的特異性與延伸單元嚴(yán)格一致，僅限于簡單的化學(xué) 結(jié)構(gòu)。由于有限的延伸單元和AT結(jié)構(gòu)域的選擇特異性，目前，能夠引入延伸單元的化學(xué)空 間范圍多限于簡單的脂肪族化合物。盡管延伸單元的體外合成（J. Am. Chem. Soc. 2001， 123，5822-5823)和用?；?NAC硫酯作為延伸單元替代品（Nat. Prod. R印.2008，25， 25-34)可以稍微減輕這種困境，但是高昂的制備成本和極低的摻入效率仍然限制了它們的 應(yīng)用。
[0006] 和脂肪酸一樣，氨基酸常被廣泛用作聚肽和生物堿的生物合成裝配單元，是另一 大類生物大分子合成的碳源。然而，在聚酮的生物合成過程中，卻只有絲氨酸和脯氨酸被 用于合成氨基丙二酰單酰輔酶A (aminomalonyl-ACP)(圖1 (1))和二氯批咯丙基丙二 醜單醜 _ACP (dichloropyrrolypropylmalonyl-ACP)(圖 1 (2))參與 了兩個 PKS 合成體 系（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006，103，14349-14354 ;J. Am. Chem. Soc. 2013， 135，18032-18035.)。和脂肪酸不一樣的是，氨基酸含有豐富的功能基團(tuán)，像氨基和硫 醇，能進(jìn)一步作為化學(xué)半合成的靶點。此外，通過現(xiàn)有的生物合成機(jī)制，如苯丙氨酸羥化酶 (Nature 2010，468，461-464)和色氨酸鹵化酶（Mol. BioSyst. 2011，7，852-861)進(jìn) 一步增加氨基酸芳香基團(tuán)的多樣性，從而增加藥物分子的親脂性和與靶蛋白之間的 堆積力，提高藥物分子的生物利用度和生物活性（Expert Opin. Drug Discov. 2014，9， 995-1003)。將氨基酸轉(zhuǎn)化為延伸單元，可以在極大程度上拓展聚酮的化學(xué)和結(jié)構(gòu)多樣性。 但是，目前，氨基酸來源的聚酮延伸單元極少，只有上述絲氨酸和脯氨酸來源的兩種，由于 兩者都為ACP承載的延伸單元，不能廣泛應(yīng)用于聚酮合成體系，此外，其生物合成途徑較為 復(fù)雜，難以用于改造聚酮骨架，且不能普遍適用于將其他氨基酸引入聚酮骨架，所以找到一 個將氨基酸轉(zhuǎn)化為聚酮延伸單元的通用方法是目前亟待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對上述情況，本發(fā)明的目的是提供一種向聚酮骨架中引入氨基酸來源側(cè)鏈的生 物合成方法，其包括如下步驟： 1、 將氨基酸經(jīng)氨基酸裂解酶催化形成a，不飽和的羧酸； 2、 輔酶A連接酶催化a，不飽和的羧酸，形成a，不飽和的羧酸輔酶A ; 3、 由巴豆酰輔酶A還原羧化酶催化a，不飽和的羧酸輔酶A形成取代的丙二酰單 酰輔酶A ; 4、 聚酮合成酶中的AT模塊選擇并上載取代的丙二酰單酰輔酶A進(jìn)入聚酮合成過程，實 現(xiàn)將氨基酸來源的側(cè)鏈引入至聚酮化合物的碳骨架中。
[0008] 進(jìn)一步的，本發(fā)明提供一種向聚酮骨架中引入苯丙氨酸來源側(cè)鏈芳香型芐基的生 物合成方法，其包括如下步驟： 1、 苯丙氨酸裂解酶EnCcP催化苯丙氨酸發(fā)生還原脫氨生成肉桂酸； 2、 肉桂酸輔酶A連接酶EnqH的催化下生成肉桂酸輔酶A ; 3、 巴豆酰輔酶A還原羧化酶SpnE催化發(fā)生還原羧化反應(yīng)生成芐基丙二酰單酰輔酶A ; 4、 聚酮合成酶SpnD中的特殊AT結(jié)構(gòu)域識別芐基丙二酰單酰輔酶A并上載至聚酮骨 架。
[0009] 所述途徑中相關(guān)基因來源于海洋鏈霉菌Streptomyces sp. CNQ431中的 splenocin(SPNs)和 enterocin (ENC)生物合成基因族，包括基因 八
[0010] 抗霉素（antimycin ANTs)是一類具有優(yōu)異的抑制由過敏原引起的過敏性哮喘活