本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)標記的標記與修飾領(lǐng)域，特別涉及一種同一體系中同時對兩個蛋白進行特異性標記或修飾的方法。

背景技術(shù)：

蛋白質(zhì)標記的標記與修飾，在蛋白質(zhì)研究應(yīng)用領(lǐng)域具有重要的位置。如對蛋白質(zhì)進行可視化標記可用于蛋白質(zhì)示蹤，觀察蛋白質(zhì)的動態(tài)變化，以對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能進行探索；對蛋白質(zhì)藥物類進行功能化修飾可用于維持蛋白質(zhì)藥物的穩(wěn)定性，延長其半衰期等。傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)標記或修飾手段主要是通過化學反應(yīng)，利用待標記物與蛋白質(zhì)中氨基酸殘基側(cè)鏈基團反應(yīng)，從而將待標記物添加于目標蛋白上。但是上述方法往往不具有特異性，因為蛋白質(zhì)中可能會存在多個相同的氨基酸殘基，造成標記多個位點，影響目標蛋白質(zhì)的標記效果。

為了解決這一問題，蛋白質(zhì)內(nèi)含子介導的蛋白質(zhì)標記技術(shù)得到深入的研究與應(yīng)用，可以通過反式剪接技術(shù)實現(xiàn)目標蛋白質(zhì)的特異性標記。尤其是新型蛋白質(zhì)內(nèi)含子s1與s11型的出現(xiàn)，使蛋白質(zhì)的特異性標記技術(shù)得到進一步深入。s1型intein的n-intein片段僅含有11個氨基酸，s11型intein的c-intein片段僅含有6個氨基酸，如此短的intein片段可以通過人工化學合成，而可以在合成的過程中，引入待標記物，通過后續(xù)的蛋白質(zhì)反式剪接將待標記物標記于目標蛋白質(zhì)上。

已有研究報道，可通過新型蛋白質(zhì)內(nèi)含子將標記物位點特異性的標記于目標蛋白的n端或c端，用于目標蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能等研究，但往往僅是在體外實現(xiàn)單一目標蛋白的標記，具有一定的局限性。蛋白質(zhì)往往是通過各個蛋白間協(xié)同作用來發(fā)揮某種功能，如信號通路中的蛋白相互作用、抗原抗體相互作用等，這種情況下需要同時研究兩個甚至是多個目標蛋白，以探索整個通路或體系。因此，同一體系中同時標記多個目標蛋白對于探索蛋白質(zhì)間的相互作用等研究顯得尤為重要。若兩個或多個新型intein，可在同一體系中能夠發(fā)生剪接反應(yīng)，且互不影響剪接效果，則可借助不同intein的反式剪接實現(xiàn)多個目標蛋白的特異性位點標記。這為同一體系實現(xiàn)多個目標蛋白的特異性位點標記提供一種有效的新方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種同一體系中同時對兩個蛋白進行特異性標記或修飾的方法，該方法操作簡單，且標記效率高，在蛋白質(zhì)標記領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值。

本發(fā)明的一種同一體系中同時對兩個蛋白進行特異性標記或修飾的方法，包括：

(1)將目標蛋白1與s1型intein的c-intein片段相連構(gòu)建融合蛋白1；將目標蛋白2與s11型intein的n-intein片段相連構(gòu)建融合蛋白2；

(2)化學合成s1型intein的n-intein片段同時在其n端加入linker序列g(shù)gg，在linker的首個氨基酸g引入特異性標記1或修飾1，得到合成片段1；化學合成s11型intein的c-intein片段同時在其c端加入linker序列cfnk，在linker的最末氨基酸k引入特異性標記2或修飾2，得到合成片段2；

(3)將融合蛋白1、合成片段1、融合蛋白2及合成片段2混合于同一體系中；通過s1型intein的反式剪接，融合蛋白1的n端被標記上特異性標記1或修飾1，通過s11型intein的反式剪接，融合蛋白2的c端被標記上特異性標記2或修飾2。

所述步驟(1)中的目標蛋白1和目標蛋白2為蛋白酶類、多肽類、蛋白藥物或抗體。均可以通過基因克隆構(gòu)建融合表達質(zhì)粒，將目標蛋白與intein的大片段相連進行融合表達。

所述s1型intein的n-intein片段包含11個氨基酸，易進行人工化學合成；s1型intein的c-intein片段在其內(nèi)部含有6his-tag用于融合蛋白1的純化；s11型intein的c-intein片段包含6個氨基酸，易進行人工化學合成；s11型intein的n-intein片段含有6his-tag用于融合蛋白2的純化。

s1型intein和s11型intein能夠在同一體系中獨立進行剪接反應(yīng)，無交叉反應(yīng)，互不影響剪接效果；且能夠在高度混合復雜的體系(如細胞裂解液)中發(fā)生剪接。

所述s1型intein為rbs1intein，具體序列如seqidno.1(n-intein)和seqidno.2(c-intein)所示；或者sgs1intein，具體序列如seqidno.5(n-intein)和seqidno.6(c-intein)所示。

所述s11型intein為te3s11intein，具體序列如seqidno.3(n-intein)和seqidno.4(c-intein)所示；或者sgs11intein，具體序列如seqidno.7(n-intein)和seqidno.8(c-intein)所示。

所述步驟(2)中的特異性標記1和特異性標記2為多肽或熒光標記；修飾1和修飾2為磷酸化修飾或乙?；揎棥?/p>

所述linker序列g(shù)gg僅有3個氨基酸，長度極短，且首個g存在的游離的氨基，便于與化學修飾相連；linker序列cfnk最后一個氨基酸k具有游離的氨基，可與化學修飾相連；linker序列可根據(jù)標記的需要進行長度的增加，可在化學合成的過程中在其上引入不同的修飾，后續(xù)通過intein的反式剪接將化學修飾標記于目標蛋白上。

有益效果

本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)同一體系兩個目標蛋白的特異性標記，且rbs1和te3s11intein的剪接效率可達50％以上，因此具有較好標記效率；且兩intein的小片段非常短，極易進行人工化學合成，因此可以在合成的過程中引入多種標記或修飾物，為目標蛋白的標記提供了更多的可選擇性；兩個目標蛋白可經(jīng)本發(fā)明方法進行不同的特異性位點標記，為蛋白質(zhì)的相互作用研究、結(jié)構(gòu)功能研究等提供可行的方法或途徑。

附圖說明

圖1a為剪接反應(yīng)體系中前體蛋白和剪接產(chǎn)物示意圖；

圖1b為剪接反應(yīng)體系的sds-page和熒光掃描檢測結(jié)果；

圖1c為剪接反應(yīng)體系的sds-page和western-blot檢測結(jié)果。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

實施例1

在同一體系中分別對trx和mbp目標蛋白(具體序列如seqidno.9(mbp)和seqidno.10(trx)所示)進行特異性的fitc和rhodamineb熒光標記：

以修飾后的pet-32a為載體，插入片段rbs1的c-intein和trx，構(gòu)建融合表達質(zhì)粒pmrbs1c，用于表達融合蛋白rbs1c-trx；同時以修飾后的pmal為載體，插入片段mbp和te3s11的n-intein，構(gòu)建融合表達質(zhì)粒pmte3s11n，用于表達融合蛋白mbp-te3s11n；

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主大腸桿菌bl21，培養(yǎng)于氨芐青霉素抗性的平板，37℃培養(yǎng)過夜；后挑取單克隆接種于3mllb培養(yǎng)基(含終濃度100ug/ml的氨芐青霉素)中，37℃、200rpm培養(yǎng)過夜；后以1:100比例轉(zhuǎn)接于50mllb培養(yǎng)基(含終濃度100ug/ml的氨芐青霉素)中，37℃、200rpm培養(yǎng)至od600為0.6～0.8時，加入終濃度0.3mm的iptg，誘導蛋白表達，20℃、200rpm培養(yǎng)過夜；4000rpm收集過夜培養(yǎng)后的菌體，加入10mllysisbuffer(20mmtris,300mmnacl,ph8.0)重懸菌體；將重懸的菌體進行超聲破碎，10000rpm、4℃離心收集上清；參照鎳柱純化方法純化目標蛋白備用；

化學合成rbs1intein的n-intein小片段同時在其n端加入linker序列g(shù)gg，在linker的首個氨基酸g引入fitc標記，得到攜帶fitc標記的rbs1n；化學合成tes311的c-intein小片段同時在其c端加入linker序列cfnk，在linker的最末氨基酸k引入rhodamineb標記，得到攜帶rhodamineb標記的te3s11c；

將純化后的目標蛋白與合成的攜帶熒光的多肽(攜帶fitc標記的rbs1n和攜帶rhodamineb標記的te3s11c)混合進行剪接反應(yīng)，以標記目標蛋白，在剪接反應(yīng)中均包含2mm的dtt；然后對剪接反應(yīng)體系進行sds-page、western-blot和熒光掃描檢測；通過rbs1和te3s11intein的特異性剪接反應(yīng)，目標蛋白trx的n端標記上fitc熒光基團，而mbp的c端則特異性的標記上rhodamineb熒光基團，如圖1所示。由圖1b可知，目標蛋白mbp的c端被特異性的標記上rhodamineb，trx的n端被特異性的標記上fitc。由圖1c可知，與熒光掃描結(jié)果相對應(yīng)，通過特異性抗體(抗trx和mbp)成功檢測到剪接產(chǎn)物mbp-rhodamineb和fitc-trx。

sequencelisting

<110>東華大學

<120>一種同一體系中同時對兩個蛋白進行特異性標記或修飾的方法

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