專利名稱：一種微膠囊化增殖培養(yǎng)制備酪酸菌菌粉的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種微膠囊化增殖培養(yǎng)制備酪酸菌菌粉的方法及其應(yīng)用，涉及一種高密度培養(yǎng)耐熱性酪酸菌的方法及其應(yīng)用，本發(fā)明屬于微生物制劑技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
酪酸梭狀芽孢桿菌又名酪酸菌、丁酸梭菌，iflostridium，以下簡稱酪酸菌，是存在于人和畜禽腸道中一種厭氧有益菌，在日本等國廣泛作為調(diào)理人體胃腸功能的整腸藥使用。酪酸梭狀芽孢桿菌的芽孢能耐熱、耐酸、耐膽汁，是作為飼用益生菌的理想菌株。酪酸菌能產(chǎn)生丁酸、乳酸等，促進雙歧桿菌、乳酸菌等腸道有益菌的增殖，抑制葡萄球菌、大腸桿菌、傷寒沙門氏菌、產(chǎn)氣夾膜梭菌等致病菌和腐敗菌的生長，能促進腸道微生態(tài)平衡，降低胺類、吲哚、硫化氫等有害物質(zhì)的產(chǎn)生。酪酸菌產(chǎn)生的丁酸是腸上皮細胞修復和再生的主要營養(yǎng)物質(zhì)，能促進畜禽腸道的發(fā)育，強化其各種功能；酪酸菌還能在腸道內(nèi)產(chǎn)生B族維生素、淀粉酶等代謝產(chǎn)物。通過以上幾種方式，酪酸菌及其代謝產(chǎn)物能夠促進消化，提高飼料利用率和改善畜禽肉質(zhì)，促進畜禽健康，增強畜禽免疫力和抗病力。目前，酪酸菌活菌制劑用于飼用微生物添加劑時，存在菌粉活菌含量低，活性保持能力弱，耐熱性差不利于飼料加工等問題。微膠囊化技術(shù)是將微生物細胞、酶類、抗體及蛋白質(zhì)包埋在某些天然或有機合成材料內(nèi)做成的顆粒，內(nèi)部微生物細胞能在顆粒內(nèi)部進行增殖和催化反應(yīng)。人們利用某些聚合物包埋細菌制成微生物接種劑，應(yīng)用在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，為開發(fā)微生物菌劑的新載體探索出了一條新途徑。微膠囊化技術(shù)的關(guān)鍵是選擇適宜的包埋劑與包埋條件。包埋劑要具備以下條件來源豐富、造價低，具有良好的堅實性和韌性，無毒無害， 能使反應(yīng)的底物和產(chǎn)物易于出入載體，而細胞又不易通過，微生物在載體中增殖快，生長穩(wěn)定，壽命長。本發(fā)明材料采用的包埋劑獲取便利，成本低，包埋后的酪酸菌不僅活菌增殖能力強，活菌數(shù)高，而且，耐熱性、耐胃腸道環(huán)境能力好，利于顆粒飼料加工及以活菌狀態(tài)到達動物腸道，發(fā)揮腸道益生菌的功效，促進養(yǎng)殖動物生長。本發(fā)明涉及微膠囊化技術(shù)包埋酪酸菌及其高密度培養(yǎng)酪酸菌的方法，目前尚無酪酸菌此方面的專利報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種微膠囊化增殖培養(yǎng)制備酪酸菌菌粉的方法及其應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案一種微膠囊化增殖培養(yǎng)制備酪酸菌菌粉的方法，出發(fā)菌株為酪酸梭狀芽孢桿菌{Clostridium butyricum) JSIM-MCB20040312,保藏號CGMCC No. 1647 ； 由酪酸菌種子活化、酪酸菌微膠囊化包埋、微膠囊顆粒增殖、活菌計數(shù)、和酪酸菌菌粉制備工序制得；
酪酸菌種子活化培養(yǎng)基由下述原料及重量配比組成
酵母膏0. 3% 0. 5%，牛肉膏0. 5% 2. 0%，蛋白胨0. 5% 2. 0%,葡萄糖0. 5% 1. 0%, 可溶性淀粉0. 1% 0. 2%，氯化鈉0. 5%，乙酸鈉0. 3% 0. 5%，鹽酸半胱氨酸0. 05% 0. 1%， CaCO3O. 3%，用去離子水配制，pH 6. 0 7. 5 ；酪酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基由下述原料及重量配比組成
葡萄糖0. 1% 1. 0%,蛋白胨0. 5% 2. 0%,酵母膏0. 1% 1. 0%, NaCl 0. 5%,乙酸鈉
0.3% 0. 5%, CaCO3 0. 1% 0. 7%,自來水配制，pH6. 0 7. 5 ；
(1)菌種活化
無菌開啟凍干保藏菌種CGMCC No. 1647，接入裝有活化培養(yǎng)基的試管，進行靜置厭氧培養(yǎng)，30 37°C培養(yǎng)18 Mh，然后以體積比1% 10%的接種量轉(zhuǎn)接于新鮮活化培養(yǎng)基， 30 37°C培養(yǎng)20 Mh，鏡檢，超過90%菌體形成芽孢時，即成熟，反復活化2 3次，種子菌懸液以體積比1% 10%接種量接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，三角瓶裝液量為體積比 80% 90%，30 37 °C恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)20 Mh ；
(2)酪酸菌微膠囊化包埋
a.包埋劑的制備
制備含有重量百分比濃度為2. 0% 5. 0%的海藻酸鈉，0.洲 0. 5%的乳酸鈉，0 3. 0% 的明膠，再含有0. 1% 1. 0%的可溶性淀粉或0. 1% 1. 0%纖維素或0. 1% 1. 0%膨潤土三者之一，所使用的溶劑為去離子水，混合制得包埋劑微膠囊壁材；
b.交聯(lián)劑的制備
配制重量百分比濃度為2. 0% 3. 0%的氯化鈣去離子水溶液，滅菌待用；
c.微膠囊顆粒的制備
按體積比為菌液包埋劑=1:3 5配制成壁材與菌液的混合膠液，充分攪勻后，將混合膠液噴霧至磁力攪拌的已滅菌的濃度為2. 0% 3. 0%的氯化鈣去離子水溶液中，形成 2 3mm的微膠囊，靜置固化12 Mh，即得酪酸菌微膠囊顆粒；每ml菌液可制得200-300 粒2 3mm的微膠囊；
(3)微膠囊顆粒增殖將酪酸菌微膠囊顆粒按其制備所需的混合膠液與酪酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基體積比0. 5%-5%接入酪酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，在不通空氣的條件下，攪拌轉(zhuǎn)速 0 80r/min，30 37°C增殖培養(yǎng)18 24h ；
(4)增殖培養(yǎng)后的微膠囊顆粒內(nèi)活菌數(shù)測定0.2mol/L檸檬酸鈉溶液振蕩溶解微膠囊顆粒后，采用MPN法進行活菌計數(shù)；
(5)耐高溫酪酸菌菌粉的制備
將步驟C3)所得增殖培養(yǎng)液高速離心收集濕菌體，濕菌體與干淀粉以質(zhì)量比1:2 10 進行混合，在30 50°C下干燥20-24h，粉碎機粉碎，過0. 9mm篩，獲得的菌粉濃度不低于
1.OXlO11 個 / 克。用所述方法制備的酪酸菌菌粉的應(yīng)用，用作漁業(yè)養(yǎng)殖飼料的添加劑，在飼喂基礎(chǔ)日糧中添加1. 0 1. 5mg -kg"1的酪酸菌菌粉制劑。本發(fā)明的有益效果
酪酸菌經(jīng)微膠囊化包埋后，活菌增殖能力增強，無需采用氮氣或二氧化碳等惰性氣體或石蠟液封來營造嚴格的厭氧環(huán)境，在常規(guī)的發(fā)酵罐中在不通入空氣進行培養(yǎng)即能獲得高濃度的菌體，生產(chǎn)成本低，能滿足飼用微生物添加劑對活菌數(shù)的要求。酪酸菌經(jīng)微膠囊化包埋后，進行高密度培養(yǎng)，獲得的菌體對高溫的耐受性顯著增強，作為微生物飼料添加劑使用時，有利于在經(jīng)過飼料造粒加工過程中的高溫后保持菌體的活性。此外，還具有良好的耐酸性、耐膽鹽性以及對人工腸液具有良好的溶出性，適宜用作動物腸道益生菌，有效預防畜禽漁等養(yǎng)殖動物的腸道疾病，促進養(yǎng)殖動物生長。與國內(nèi)外相關(guān)專利的比較
CN 101032527A涉及酪酸菌活菌制劑制備方法，酪酸菌經(jīng)四級培養(yǎng)，高速離心收集菌體，以1 2 10的比例加入脫脂奶液，真空冷凍干燥，獲得的冷凍干燥粉劑活菌數(shù) 1.0X109 1. OX 101°個/克，根據(jù)其技術(shù)方案推算，其發(fā)酵培養(yǎng)16-24h后菌體濃度低于 1.0X IO9個/mL。專利CN 1995330A涉及一種丁酸梭菌活菌制劑的生產(chǎn)方法，發(fā)酵培養(yǎng)時加入液體石蠟厚度為l_2cm，以營造厭氧環(huán)境，發(fā)酵培養(yǎng)45-70h，菌液濃度為15-25億個/ mL,即1. 5X IO9 2. 5X IO9個/mL。綜上所述，發(fā)酵培養(yǎng)活菌數(shù)均顯著低于本發(fā)明，且專利CN 1995330A發(fā)酵培養(yǎng)周期長，需外加液體石蠟厚度為l-2cm，以營造厭氧環(huán)境。本發(fā)明通過微膠囊化技術(shù)包埋酪酸菌，增殖能力顯著增加且對厭氧條件不嚴格，在發(fā)酵培養(yǎng)過程中只需不通空氣，菌體即增殖生長，18h 24h發(fā)酵培養(yǎng)活菌濃度能夠達到1. OX 101° 2.0X1010CFU/mL,且耐高溫性能顯著增強。采用淀粉直接吸附菌體，30°C 50°C干燥，獲得的酪酸菌菌粉濃度不低于1. OX IO11個/mL。生物材料樣品保藏酪酸梭狀芽孢桿菌(C/osirii/i butyricum) JSIM-MCB 20040312，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，保藏編號CGMCC No. 1647，保藏日期2006年3月10日。


圖1酪酸菌微膠囊顆粒在人工腸胃液中的透光率變化。
具體實施例方式實施例1 酪酸菌微膠囊顆粒的制備方法(一)
(1)菌種活化及擴大培養(yǎng)無菌開啟凍干保藏菌種CGMCC No. 1647，接入裝有活化培養(yǎng)基的試管，進行靜置厭氧培養(yǎng)，37°C培養(yǎng)18h，然后以體積比m的接種量轉(zhuǎn)接于新鮮活化培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)Mh。鏡檢，超過90%菌體形成芽孢時，即成熟，反復活化2 3次。種子菌懸液以1%-10% (V/V)接種量接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，三角瓶裝液量為90% (V/V), 37 °C恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)22 Mh。酪酸菌種子活化培養(yǎng)基由下述原料及重量配比組成
酵母膏0. 3% 0. 5%,牛肉膏0. 5% 2. 0%,蛋白胨0. 5% 2. 0%,葡萄糖0. 5% 1. 0%, 可溶性淀粉0. 1% 0. 2%，氯化鈉0. 5%，乙酸鈉0. 3% 0. 5%，鹽酸半胱氨酸0. 05% 0. 1%， CaCO3O. 3%，用去離子水配制，pH 6. 0 7. 5 ；
酪酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基由下述原料及重量配比組成
葡萄糖0. 1% 1. 0%,蛋白胨0. 5% 2. 0%,酵母膏0. 1% 1. 0%, NaCl 0. 5%,乙酸鈉 0. 3% 0. 5%, CaCO3 0. 1% 0. 7%,自來水配制，pH6. 0 7. 5 ；
(2)微膠囊化包埋制備重量百分比濃度為4. 0%的海藻酸鈉，0. 2%的乳酸鈉，2. 0%的明膠，0. 2%的纖維素，混合制得微膠囊壁材，所使用的溶劑均為去離子水。配制重量百分比濃度為2. 0%的氯化鈣去離子水溶液，滅菌待用。按體積比為菌液壁材=1:4配制成壁材與菌液的混合膠液，充分攪勻后，利用高壓靜電成囊裝置，將混合液噴霧至磁力攪拌的已滅菌的濃度為2. 0%的氯化鈣去離子水溶液中，靜置固化22 Mh，每mL菌液可制得250粒2 3mm的微膠囊。(3)微膠囊顆粒內(nèi)活菌數(shù)測定將上述ImL菌液制得的微膠囊顆粒加入到9mL 0. 2mol/L檸檬酸鈉溶液振蕩溶解微膠囊顆粒，采用MPN法進行活菌計數(shù)。按上述方法制得的酪酸菌微膠囊顆粒的活菌數(shù)> 5X108CFU/mL。實施例2 酪酸菌微膠囊顆粒的制備方法(二) (1)菌種活化及擴大培養(yǎng)，同實施例1。(2)微膠囊化包埋制備重量百分比濃度為4. 0%的海藻酸鈉，0. 3%的乳酸鈉，0% 的明膠，0. 5%的可溶性淀粉，混合制得微膠囊壁材，所使用的溶劑均為去離子水。配制重量百分比濃度為3. 0%的氯化鈣去離子水溶液，滅菌待用。按體積比為菌液壁材=1:3. 5配制成壁材與菌液的混合膠液，充分攪勻后，利用高壓靜電成囊裝置，將混合液噴霧至磁力攪拌的已滅菌的濃度為3. 0%的氯化鈣去離子水溶液中，靜置固化22 Mh，每ml菌液可制得200粒2 3mm的微膠囊。(3)微膠囊顆粒內(nèi)活菌數(shù)測定將上述ImL菌液制得的微膠囊顆粒加入到9mL 0. 2mol/L檸檬酸鈉溶液振蕩溶解微膠囊顆粒，采用MPN法進行活菌計數(shù)。按上述方法制得的酪酸菌微膠囊顆粒的活菌數(shù)> 5X108CFU/mL。實施例3 酪酸菌微膠囊顆粒的制備方法(三) (1)菌種活化及擴大培養(yǎng)，同實施例1。(2)微膠囊化包埋制備重量百分比濃度為2. 0%的海藻酸鈉，0. 5%的乳酸鈉，1. 0% 的明膠，0. 5%的膨潤土，混合制得微膠囊壁材，所使用的溶劑均為去離子水。配制重量百分比濃度為2. 5%的氯化鈣去離子水溶液，滅菌待用。按體積比為菌液壁材=1:5配制成壁材與菌液的混合膠液，充分攪勻后，利用高壓靜電成囊裝置，將混合液噴霧至磁力攪拌的已滅菌的濃度為2. 5%的氯化鈣去離子水溶
液中，形成2 3mm的微膠囊，靜置固化22 Mh，每ml菌液可制得300粒2 3mm的微膠 ；
(3)微膠囊顆粒內(nèi)活菌數(shù)測定將上述ImL菌液制得的微膠囊顆粒加入到9mL 0. 2mol/L檸檬酸鈉溶液振蕩溶解微膠囊顆粒，采用MPN法進行活菌計數(shù)，所制得的酪酸菌微膠囊顆粒的活菌數(shù)彡5X108CFU/mL。實施例4 酪酸菌微膠囊顆粒的增殖
取實施例1中制備的酪酸菌微膠囊顆粒按其制備所需的混合膠液與酪酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基體積比0. 5%-5%接入酪酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵罐不通空氣，攪拌轉(zhuǎn)速0 80r/min，37°C 培養(yǎng)18 Mh。0. 2mol/L檸檬酸鈉溶液里振蕩溶解酪酸菌微膠囊顆粒后，采用MPN法進行活菌計數(shù)。同時取酪酸菌微膠囊顆粒增殖前的活菌數(shù)計數(shù)作為對照，結(jié)果如表1所示。表1酪酸菌微膠囊顆粒增殖前后活菌數(shù)的比較
權(quán)利要求
1.一種微膠囊化增殖培養(yǎng)制備酪酸菌菌粉的方法，其特征在于出發(fā)菌株為酪酸梭狀芽孢桿菌(C/osirii/i toi^ricw )JSIM-MCB20040312,保藏號 CGMCC No. 1647 ；由酪酸菌種子活化、酪酸菌微膠囊化包埋、微膠囊顆粒增殖、活菌計數(shù)、和酪酸菌菌粉制備工序制得；酪酸菌種子活化培養(yǎng)基由下述原料及重量配比組成酵母膏0. 3% 0. 5%，牛肉膏0. 5% 2. 0%，蛋白胨0. 5% 2. 0%,葡萄糖0. 5% 1. 0%, 可溶性淀粉0. 1% 0. 2%，氯化鈉0. 5%，乙酸鈉0. 3% 0. 5%，鹽酸半胱氨酸0. 05% 0. 1%， CaCO3 0. 3%，用去離子水配制，pH 6. 0 7. 5 ；酪酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基由下述原料及重量配比組成葡萄糖0. 1% 1. 0%,蛋白胨0. 5% 2. 0%,酵母膏0. 1% 1. 0%, NaCl 0. 5%,乙酸鈉 0. 3% 0. 5%, CaCO3 0. 1% 0. 7%,自來水配制，pH6. 0 7. 5 ； (1)菌種活化無菌開啟凍干保藏菌種CGMCC No. 1647，接入裝有活化培養(yǎng)基的試管，進行靜置厭氧培養(yǎng)，30 37°C培養(yǎng)18 Mh，然后以體積比1% 10%的接種量轉(zhuǎn)接于新鮮活化培養(yǎng)基， 30 37°C培養(yǎng)20 Mh，鏡檢，超過90%菌體形成芽孢時，即成熟，反復活化2 3次，種子菌懸液以體積比1% 10%接種量接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，三角瓶裝液量為體積比 80% 90%，30 37 °C恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)20 Mh ；(2)酪酸菌微膠囊化包埋a.包埋劑的制備制備含有重量百分比濃度為2. 0% 5. 0%的海藻酸鈉，0.洲 0. 5%的乳酸鈉，0 3. 0% 的明膠，再含有0. 1% 1. 0%的可溶性淀粉或0. 1% 1. 0%纖維素或0. 1% 1. 0%膨潤土三者之一，所使用的溶劑為去離子水，混合制得包埋劑微膠囊壁材；b.交聯(lián)劑的制備配制重量百分比濃度為2. 0% 3. 0%的氯化鈣去離子水溶液，滅菌待用；c.微膠囊顆粒的制備按體積比為菌液包埋劑=1:3 5配制成菌液與壁材的混合膠液，充分攪勻后，將混合膠液噴霧至磁力攪拌的已滅菌的濃度為2. 0% 3. 0%的氯化鈣去離子水溶液中，形成 2 3mm的微膠囊，靜置固化12 Mh，即得酪酸菌微膠囊顆粒，每mL菌液可制得200-300 粒2 3mm的微膠囊；(3)微膠囊顆粒增殖將酪酸菌微膠囊顆粒以其制備所需的混合膠液與酪酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基體積比0. 5%-5%接入酪酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，在不通空氣的條件下，攪拌轉(zhuǎn)速 0 80r/min，30 37°C增殖培養(yǎng)18 24h ；(4)增殖培養(yǎng)后的微膠囊顆粒內(nèi)活菌數(shù)測定0.2mol/L檸檬酸鈉溶液振蕩溶解微膠囊顆粒后，采用MPN法進行活菌計數(shù)；(5)酪酸菌菌粉的制備將步驟C3)所得增殖培養(yǎng)液高速離心收集濕菌體，濕菌體與干淀粉以質(zhì)量比1:2 10 進行混合，在30 50°C下干燥20-24h，粉碎機粉碎，過0. 9mm篩，獲得酪酸菌菌粉制劑，酪酸菌菌粉制劑的菌粉濃度不低于1. OX IO11個/克。
2.用權(quán)利要求1方法制備的酪酸菌菌粉的應(yīng)用，其特征在于用作漁業(yè)養(yǎng)殖飼料的添加劑，在飼喂基礎(chǔ)日糧中添加1. 0 1. 5mg -kg"1的酪酸菌菌粉制劑。
全文摘要
一種微膠囊化增殖培養(yǎng)制備酪酸菌菌粉的方法及其應(yīng)用，屬于微生物制劑技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明出發(fā)菌株為酪酸梭狀芽孢桿菌JSIM-MCB20040312,保藏號CGMCCNo.1647；由酪酸菌種子活化、酪酸菌微膠囊化包埋、微膠囊顆粒增殖、活菌計數(shù)、和酪酸菌菌粉制備工序制得，獲得的菌粉濃度不低于1.0×1011個/克。酪酸菌經(jīng)微膠囊化包埋后，活菌增殖能力增強，無需采用氮氣或二氧化碳等惰性氣體或石蠟液封來營造嚴格的厭氧環(huán)境，在常規(guī)的發(fā)酵罐中不通入空氣進行培養(yǎng)即能獲得高濃度的菌體，生產(chǎn)成本低，能滿足飼用微生物添加劑對活菌數(shù)的要求；還具有良好的耐熱性、耐酸性及腸溶性好的特點，適宜用作動物腸道益生菌，有效預防雞、豬等畜禽漁養(yǎng)殖動物的腸道疾病，促進養(yǎng)殖動物生長。
文檔編號C12N11/04GK102199590SQ201110083328
公開日2011年9月28日 申請日期2011年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月2日
發(fā)明者何義進, 匡群, 史濟筠, 孫梅, 張維娜, 施大林, 謝駿, 鄒益東, 陳秋紅 申請人:中國水產(chǎn)科學研究院淡水漁業(yè)研究中心, 宜興市天石飼料有限公司, 江蘇省蘇微微生物研究有限公司