專(zhuān)利名稱(chēng)：一種丁酸梭菌的清液發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種丁酸梭菌的清液發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵培養(yǎng)方法，屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
丁酸梭菌iflostridium butyricum)，即丁酸梭狀芽孢桿菌，又名酪酸菌。它是梭狀芽孢菌屬中的一個(gè)種，主要存在于奶酪、天然酸奶、人與動(dòng)物的腸道與糞便中、某些樹(shù)葉、 土壤等自然環(huán)境中。丁酸梭菌是一種直的或彎曲的革蘭氏陽(yáng)性厭氧內(nèi)生芽孢桿菌，對(duì)環(huán)境變化具有一定的抗性，這些特點(diǎn)使丁酸梭菌具有作為優(yōu)良益生菌的潛力。另一方面，丁酸梭菌通過(guò)動(dòng)物腸道時(shí)，能耐胃酸及膽汁酸鹽，很好地保證了其性能的發(fā)揮。在臨床醫(yī)學(xué)和畜牧業(yè)方面廣泛應(yīng)用于整腸藥物、保健食品、飼料添加劑、微生物肥料等，是一種較理想的具有廣泛開(kāi)發(fā)前景的微生態(tài)制劑。1999年2月由聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)聯(lián)合召開(kāi)的第52次食品添加劑專(zhuān)家委員會(huì)強(qiáng)調(diào)指出丁酸梭菌是人的正常腸道菌。此后，人們廣泛的關(guān)注和研究了酪酸梭菌的形態(tài)特征、生理特點(diǎn)、生化特點(diǎn)及其商業(yè)應(yīng)用。1940年，丁酸梭菌在日本實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化生產(chǎn)并被應(yīng)用于臨床。最初，它被用作整腸劑，廣泛用于腸道菌群失調(diào)，急慢性腹瀉，腸易激綜合癥，抗生素相關(guān)性腸炎等疾病的治療，取得了顯著療效。此后，它先后被作為處方藥、非處方藥、獸藥、飼料添加劑、食品添加劑等廣泛使用。在韓國(guó)，酪酸梭菌也已經(jīng)被用于牛、豬及家禽的飼料添加劑，丁酸梭菌能單獨(dú)作為飼料添加劑使用，也能與乳酸菌、 芽孢菌、雙歧桿菌等益生菌復(fù)配使用，能增強(qiáng)其功效。益生菌類(lèi)微生態(tài)制劑在替代抗生素、防治畜禽疾病和改善環(huán)境等方面的積極作用已經(jīng)得到了公認(rèn)，但是目前真正符合生產(chǎn)要求的高質(zhì)量微生態(tài)制劑產(chǎn)品還很少。丁酸梭菌由于生物學(xué)特性，在臨床上具有非常顯著的治療效果，而且因其具有芽孢形態(tài)，有較高的實(shí)用價(jià)值。下述專(zhuān)利CN1144873C、CN1184308C、US5. 292 523 (1994)、US4. 892 731(1990)、 JP63-146825 (1986)、JP61-6625 (1984)、JP06-166825 (1994)、JP05-227898 (1993)涉及到丁酸梭菌的發(fā)酵和制備方法，這些現(xiàn)有技術(shù)存在一些缺點(diǎn)，1、就培養(yǎng)方式而言，大量運(yùn)用復(fù)合培養(yǎng)基，或者其他含有大量不溶性成分培養(yǎng)基，引起后處理困難，成本高昂，單位菌粉活菌含量低，雜質(zhì)較多；2、就培養(yǎng)效果而言，發(fā)酵液菌數(shù)較少，芽孢率較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供一種丁酸梭菌的清液發(fā)酵培養(yǎng)基及其發(fā)酵培養(yǎng)方法，全部添加的是可溶性碳氮源和金屬鹽，無(wú)培養(yǎng)基沉淀，利用率高，菌液后處理簡(jiǎn)單， 菌粉有效含量高，方便保存，從總體上大幅降低處理成本。本發(fā)明的一種丁酸梭菌的清液發(fā)酵培養(yǎng)基的技術(shù)方案，包括下述組份葡萄糖 0. 8 2. 5% (w/v)，胰蛋白胨0. 6 2. 3% (w/v)，酵母浸粉1. 1 2. 8% (w/v)，硫酸銨0. 05 0. 2 % (w/v)，碳酸氫鈉0. 05 0. 25 % (w/v)， 玉米漿粉或谷物漿粉或大豆?jié){粉 0. 2 0. 45% (w /ν) ； PH 值為 7 8。進(jìn)一步的技術(shù)方案是
所述的丁酸梭菌的清液發(fā)酵培養(yǎng)基的技術(shù)方案，組份是葡萄糖0. 8% (w/v)，胰蛋白胨 0. 6% (w/v)，酵母浸粉1. 1% (w/v)，硫酸銨0. 05 % (w/v)，碳酸氫鈉0. 05 % (w/v)，玉米漿粉或谷物漿粉或大豆?jié){粉0.洲(w /ν) ；PH值7。所述的丁酸梭菌的清液發(fā)酵培養(yǎng)基，組份是葡萄糖2. 5% (w/v)，胰蛋白胨2. 3% (w/v)，酵母浸粉2. 8% (w/v)，硫酸銨0. 2 % (w/v)，碳酸氫鈉0. 25 % (w/v)，玉米漿粉或谷物漿粉或大豆?jié){粉0. 45% (w /ν) ；PH值8。所述的丁酸梭菌的清液發(fā)酵培養(yǎng)基，組份是葡萄糖1. 5% (w/v)，胰蛋白胨1. 3% (w/v)，酵母浸粉1. 8% (w/v)，硫酸銨0. 1 % (w/v)，碳酸氫鈉0. 12% (w/v)，玉米漿粉0. 33% (w /ν) ；PH 值 7. 5。本發(fā)明一種用于丁酸梭菌的清液發(fā)酵培養(yǎng)基促芽孢生成的金屬鹽，包括下述組份硫酸錳 0. 01 0. 1% (w/v)，硫酸鎂 0. 01 0. l%(w/v)，硫酸亞鐵 0. 01 0. 08% (w/v)
ο進(jìn)一步的技術(shù)方案是
所述的丁酸梭菌的清液發(fā)酵培養(yǎng)基促芽孢生成的金屬鹽，組份是硫酸錳0. 05%(W/ ν)，硫酸鎂 0. 05% (w/v)，硫酸亞鐵 0. 03% (w/v)。本發(fā)明一種用于丁酸梭菌的清液發(fā)酵培養(yǎng)基的增殖培養(yǎng)基(RCM)，組成和重量份為酵母浸膏2 4、牛肉浸膏8 12、胰蛋白胨8 12、葡萄糖3 8、可溶性淀粉0.5 2、氯化鈉3 8、三水合乙酸鈉1 6、半胱氨酸鹽酸鹽0. 1 1. 5、0. 5%美藍(lán)0. 1 3mL、蒸溜水 800 1200mL ；調(diào)節(jié) pH7. 1 士 0. 1。進(jìn)一步的技術(shù)方案是
所述的丁酸梭菌的清液發(fā)酵培養(yǎng)基的增殖培養(yǎng)基(RCM)，配方組成為酵母浸膏3g、牛肉浸膏10 g、胰蛋白胨10 g、葡萄糖5 g、可溶性淀粉1 g、氯化鈉5 g、三水合乙酸鈉3 g、 半胱氨酸鹽酸鹽0. 5 g、0. 5%美藍(lán)0. 2mL、蒸餾水IOOOmL ；調(diào)節(jié)ρΗ7· 1 士 0. 1。本發(fā)明一種丁酸梭菌的清液發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵培養(yǎng)方法，包括以下步驟
(1)甘油管冷藏菌種活化取甘油管冷藏菌種接種于裝有增殖培養(yǎng)基(RCM)的試管中， 上覆液體石蠟，培養(yǎng)基提前滅菌，然后靜置培養(yǎng)形成芽孢；
(2)加熱優(yōu)選將上述培養(yǎng)液混勻后置于水浴中處理；
(3)三角瓶一級(jí)種子培養(yǎng)再分別將上述菌液轉(zhuǎn)接到滅過(guò)菌的優(yōu)化后培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期能作為種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中；具有促芽孢生成的金屬鹽的發(fā)酵培養(yǎng)基包括葡萄糖，胰蛋白胨，酵母浸粉，硫酸銨，碳酸氫鈉，玉米漿粉或谷物漿粉或大豆?jié){粉，硫酸錳，硫酸鎂，硫酸亞鐵，并保持一定PH值；
(4)液體發(fā)酵將培養(yǎng)好的三角瓶一級(jí)種子培養(yǎng)基接入發(fā)酵罐中發(fā)酵；
(5)噴霧干燥發(fā)酵液用均質(zhì)機(jī)均質(zhì)，控制噴霧干燥，即可制得高純菌粉。進(jìn)一步的技術(shù)方案是
所述的丁酸梭菌的清液發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵培養(yǎng)方法，在所述步驟中 (1)甘油管冷藏菌種活化取-25 -18°c冷藏的甘油管菌種180 230 μ L接種于裝有6 12mL增殖培養(yǎng)基(RCM)的試管中，上覆1 3cm液體石蠟，培養(yǎng)基提前滅菌，33 38°C條件下靜置培養(yǎng)40 50h以形成芽孢；所述增殖培養(yǎng)基(RCM)包括下述組成重量份 酵母浸膏2 4、牛肉浸膏8 12、胰蛋白胨8 12、葡萄糖3 8、可溶性淀粉0.5 2、 氯化鈉3 8、三水合乙酸鈉1 6、半胱氨酸鹽酸鹽0. 1 1. 5、0. 5%美藍(lán)0. 1 3mL、 蒸餾水 800 1200mL ；調(diào)節(jié) pH7. 1 士0. 1,100 120°C，20 min 滅菌備用；
(2)加熱優(yōu)選將上述培養(yǎng)液混勻后置于70 90°C水浴中處理9 12min；
(3)三角瓶一級(jí)種子培養(yǎng)再分別以1 3%的接種量將上述菌液轉(zhuǎn)接到滅過(guò)菌的優(yōu)化后培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)16_20h到對(duì)數(shù)期能作為種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中；
所述具有促芽孢生成的金屬鹽的發(fā)酵培養(yǎng)基，配方組成為葡萄糖0. 8 2. 5% (w/v)， 胰蛋白胨0. 6 2. 3% (w/v)，酵母浸粉1. 1 2. 8% (w/v)，硫酸銨0. 05 0. 2 % (w/v)， 碳酸氫鈉0. 05 0. 25 % (w/v)，玉米漿粉或谷物漿粉或大豆?jié){粉0. 2 0. 45% (w /ν)； PH值為7 8 ；硫酸錳0. 01 0. l%(w/v)，硫酸鎂0. 01 0. l%(w/v)，硫酸亞鐵0. 01 0. 08% (w/v)；
(4)液體發(fā)酵將培養(yǎng)好的三角瓶一級(jí)種子培養(yǎng)基接入發(fā)酵罐中，接種量3% 5%， 控溫33 40°C，攪拌轉(zhuǎn)速45 60rpm，發(fā)酵過(guò)程中PH值降低到6. 5以下，補(bǔ)加18 25% 碳酸鈉控制PH值為6. 5，直到發(fā)酵結(jié)束，且發(fā)酵Mh以?xún)?nèi)流加碳源，流加0. 55 1. 5% (w/ ν)碳源;
(5)噴霧干燥發(fā)酵液用均質(zhì)機(jī)均質(zhì)，控制噴霧干燥中進(jìn)風(fēng)溫度130 160°C，出口溫度 50 75°C，即可制得高純菌粉。所述的丁酸梭菌的清液發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵培養(yǎng)方法，在所述步驟中
(1)甘油管保藏菌種活化取-20°C保藏的甘油管菌種200 μ L接種于裝有9mL增殖培養(yǎng)基(RCM)的試管中，上覆2cm液體石蠟，培養(yǎng)基提前滅菌，37°C條件下靜置培養(yǎng)48h以形成芽孢；所述RCM培養(yǎng)基配方如下酵母浸膏3 g、牛肉浸膏10 g、胰蛋白胨10g、葡萄糖 5g、可溶性淀粉lg、氯化鈉5g、三水合乙酸鈉3g、半胱氨酸鹽酸鹽0. 5g、0. 5%美藍(lán)0. 2mL、蒸餾水 IOOOmL ；調(diào)節(jié) pH7. 1 士0. 1，115°C，20 min 滅菌備用；
(2)加熱優(yōu)選將上述培養(yǎng)液混勻后置于80°C水浴中處理IOmin；加熱可以促進(jìn)芽孢萌發(fā)，有利于菌體生長(zhǎng)一致性和防止雜菌污染；
(3)三角瓶一級(jí)種子培養(yǎng)再分別以3%的接種量將上述菌液轉(zhuǎn)接到滅過(guò)菌的優(yōu)化后培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)16_20h到對(duì)數(shù)期能作為種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖 1.5% (w/v)，胰蛋白胨1.3% (w/v)，酵母浸粉1.8% (w/v)，硫酸銨0.1 % (w/v)，碳酸氫鈉 0. 124% (w/v)，玉米漿粉 0. 33% (w /ν)，硫酸錳 0. 05% (w/v)，硫酸鎂 0. 05% (w/v)，硫酸亞鐵 0. 03% (w/v) ；PH 值 7. 5;
(4)液體發(fā)酵將培養(yǎng)好的三角瓶一級(jí)種子培養(yǎng)基接入發(fā)酵罐中，接種量3% 5%， 控溫37°C，攪拌轉(zhuǎn)速50rpm，發(fā)酵過(guò)程中PH值降低到6. 5以下，補(bǔ)加20%碳酸鈉控制PH值為6. 5，直到發(fā)酵結(jié)束，且發(fā)酵Mh以?xún)?nèi)流加碳源，流加1% (w/v)碳源；
(5)噴霧干燥發(fā)酵液用均質(zhì)機(jī)均質(zhì)，控制噴霧干燥中進(jìn)風(fēng)溫度150°C，出口溫度70°C， 即可制得高純菌粉。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)如下
(1)本發(fā)明丁酸梭菌的清液發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵培養(yǎng)方法中，添加可溶性碳氮源和金屬鹽，無(wú)培養(yǎng)基沉淀，利用率高，菌液后處理簡(jiǎn)單，菌粉有效含量高，方便保存，從總體上大大降低成本。厭氧發(fā)酵通過(guò)在培養(yǎng)基上覆石蠟，石蠟可重復(fù)循環(huán)利用，不需要通入惰性氣體， 環(huán)保節(jié)約。(2)分段流加培養(yǎng)方式，進(jìn)一步提高丁酸菌含量，進(jìn)而提高芽孢形成率，采用本發(fā)明生產(chǎn)丁酸梭菌，大大提高發(fā)酵菌數(shù)和芽孢得率，發(fā)酵液菌數(shù)可達(dá)2. 3 X 109CfU/ml，芽孢得率95%以上。(3)加熱優(yōu)選種子培養(yǎng)基方式，使得菌體生長(zhǎng)一致。(4)發(fā)酵結(jié)束后用噴霧干燥方式，能快速高效獲得大量高含量菌粉。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 本發(fā)明的丁酸梭菌的清液發(fā)酵培養(yǎng)基組份是葡萄糖1. 5% (w/v)，胰蛋白胨1. 3% (w/v)，酵母浸粉1. 8% (w/v)，硫酸銨0. 1 % (w/v)，碳酸氫鈉0. 12% (w/v)，玉米漿粉 0.33% (w /ν) ；PH 值 7. 5。實(shí)施例2 本發(fā)明的丁酸梭菌的清液發(fā)酵培養(yǎng)基組份是葡萄糖0. 8% (w/v)，胰蛋白胨0. 6% (w/v)，酵母浸粉1. 1% (w/v)，硫酸銨0. 05 % (w/v)，碳酸氫鈉0. 05 % (w/v)，玉米漿粉或谷物漿粉或大豆?jié){粉0.洲(w /ν) ；PH值7。實(shí)施例3 本發(fā)明的丁酸梭菌的清液發(fā)酵培養(yǎng)基組份是葡萄糖2. 5% (w/v)，胰蛋白胨2. 3% (w/v)，酵母浸粉2. 8% (w/v)，硫酸銨0. 2 % (w/v)，碳酸氫鈉0. 25 % (w/v)，玉米漿粉或谷物漿粉或大豆?jié){粉0. 45% (w /ν) ；PH值8。實(shí)施例4 本發(fā)明一種用于丁酸梭菌的清液發(fā)酵培養(yǎng)基促芽孢生成的金屬鹽，包括下述組份硫酸錳0. 01 0. l%(w/v)，硫酸鎂0. 01 0. l%(w/v)，硫酸亞鐵0. 01 0. 08% (w/v)。本實(shí)施例組份是硫酸錳0. 05% (w/v)，硫酸鎂0. 05% (w/v)，硫酸亞鐵 0. 03% (w/v)。實(shí)施例5 本發(fā)明一種用于丁酸梭菌的清液發(fā)酵培養(yǎng)基的增殖培養(yǎng)基(RCM)，組成和重量份為酵母浸膏2 4、牛肉浸膏8 12、胰蛋白胨8 12、葡萄糖3 8、可溶性淀粉0. 5 2、氯化鈉3 8、三水合乙酸鈉1 6、半胱氨酸鹽酸鹽0. 1 1. 5,0. 5%美藍(lán) 0. 1 3mL、蒸餾水800 1200mL ；調(diào)節(jié)pH7. 1 士0. 1。本實(shí)施例配方組成為酵母浸膏3g、 牛肉浸膏10 g、胰蛋白胨10 g、葡萄糖5 g、可溶性淀粉1 g、氯化鈉5 g、三水合乙酸鈉3 g、半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g、0. 5%美藍(lán)0. 2mL、蒸餾水IOOOmL;調(diào)節(jié)pH7. 1 士0. 1。實(shí)施例6 本發(fā)明一種丁酸梭菌的清液發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵培養(yǎng)方法，有以下步驟
(1)甘油管冷藏菌種活化取甘油管冷藏菌種接種于裝有增殖培養(yǎng)基(RCM)的試管中， 上覆液體石蠟，培養(yǎng)基提前滅菌，然后靜置培養(yǎng)形成芽孢；
(2)加熱優(yōu)選將上述培養(yǎng)液混勻后置于水浴中處理；加熱可以促進(jìn)芽孢萌發(fā)，有利于菌體生長(zhǎng)一致性和防止雜菌污染；
(3)三角瓶一級(jí)種子培養(yǎng)再分別將上述菌液轉(zhuǎn)接到滅過(guò)菌的優(yōu)化后培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期作為種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中；具有促芽孢生成的金屬鹽的發(fā)酵培養(yǎng)基包括葡萄糖，胰蛋白胨，酵母浸粉，硫酸銨，碳酸氫鈉，玉米漿粉或谷物漿粉或大豆?jié){粉，硫酸錳，硫酸鎂，硫酸亞鐵，并保持一定PH值；
(4)液體發(fā)酵將培養(yǎng)好的三角瓶一級(jí)種子培養(yǎng)基接入發(fā)酵罐中發(fā)酵；
(5)噴霧干燥發(fā)酵液用均質(zhì)機(jī)均質(zhì)，控制噴霧干燥，即可制得高純菌粉。本發(fā)明所述的丁酸梭菌的清液發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵培養(yǎng)方法，在所述步驟中，參數(shù)選值范圍為
(1)甘油管冷藏菌種活化取-25 _18°C冷藏的甘油管菌種180 230μ L接種于裝有6 12mL增殖培養(yǎng)基(RCM)的試管中，上覆1 3cm液體石蠟，培養(yǎng)基提前滅菌，33 38°C條件下靜置培養(yǎng)40 50h以形成芽孢；所述增殖培養(yǎng)基(RCM)組成重量份如下酵母浸膏2 4、牛肉浸膏8 12、胰蛋白胨8 12、葡萄糖3 8、可溶性淀粉0. 5 2、氯化鈉3 8、三水合乙酸鈉1 6、半胱氨酸鹽酸鹽0. 1 1. 5、0. 5%美藍(lán)0. 1 3mL、蒸溜水 800 1200mL ；調(diào)節(jié) pH7. 1 士0. 1，100 120°C，20 min 滅菌備用；
(2)加熱優(yōu)選將上述培養(yǎng)液混勻后置于70 90°C水浴中處理9 12min；
(3)三角瓶一級(jí)種子培養(yǎng)再分別以1 3%的接種量將上述菌液轉(zhuǎn)接到滅過(guò)菌的優(yōu)化后培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)16_20h到對(duì)數(shù)期能作為種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中；
所述具有促芽孢生成的金屬鹽的發(fā)酵培養(yǎng)基，包括下述組份葡萄糖0. 8 2. 5% (w/ ν)，胰蛋白胨0. 6 2. 3% (w/v)，酵母浸粉1. 1 2. 8% (w/v)，硫酸銨0. 05 0. 2 % (w/ ν)，碳酸氫鈉0.05 0.25 % (w/v)，玉米漿粉或谷物漿粉或大豆?jié){粉0. 2 0. 45% (w / ν)，PH值為7 8 ；硫酸錳0. 01 0. 1% (w/v)，硫酸鎂0. 01 0. 1% (w/v)，硫酸亞鐵0.01-0. 08% (w/v)；
(4)液體發(fā)酵將培養(yǎng)好的三角瓶一級(jí)種子培養(yǎng)基接入發(fā)酵罐中，接種量3% 5%， 控溫33 40°C，攪拌轉(zhuǎn)速45 60rpm，發(fā)酵過(guò)程中PH值降低到6. 5以下，補(bǔ)加18 25% 碳酸鈉控制PH值為6. 5，直到發(fā)酵結(jié)束，且發(fā)酵Mh以?xún)?nèi)流加碳源，流加0.55 1.5% (w/ ν)碳源;
(5)噴霧干燥發(fā)酵液用均質(zhì)機(jī)均質(zhì)，控制噴霧干燥中進(jìn)風(fēng)溫度130 160°C，出口溫度 50 75°C，即可制得高純菌粉。 具體實(shí)施方案是所述的丁酸梭菌的清液發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵培養(yǎng)方法，在所述步驟中
(1)甘油管保藏菌種活化取-20°C保藏的甘油管菌種200 μ L接種于裝有9mL增殖培養(yǎng)基(RCM)的試管中，上覆2cm液體石蠟隔絕空氣，石蠟和培養(yǎng)基提前滅菌(115°C滅菌 20分)，制備四管，37°C條件下靜置培養(yǎng)48h以形成芽孢；所述增殖培養(yǎng)基(RCM)配方組成如下酵母浸膏3 g、牛肉浸膏10 g、胰蛋白胨10g、葡萄糖5g、可溶性淀粉lg、氯化鈉5g、三水合乙酸鈉3g、半胱氨酸鹽酸鹽0. 5g、0. 5%美藍(lán)0. 2mL、蒸餾水IOOOmL ；調(diào)節(jié)ρΗ7· 1 士0. 1 ；
(2)加熱優(yōu)選選生長(zhǎng)健壯樣本，將上述培養(yǎng)液各自混勻后置于80°C水浴中處理 IOmin ；加熱可以促進(jìn)芽孢萌發(fā)，有利于菌體生長(zhǎng)一致性和防止雜菌污染；
(3)三角瓶一級(jí)種子培養(yǎng)再分別以3%的接種量(即6ml)將上述菌液轉(zhuǎn)接到裝有200ml 已滅過(guò)菌的優(yōu)化后培養(yǎng)基的250ml三角瓶中(上覆液體石蠟)，共接種3瓶，37°C培養(yǎng)16_20h 到對(duì)數(shù)期能作為種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖1.5% (w/v)，胰蛋白胨1.3% (w/v), 酵母浸粉1. 8% (w/v)，硫酸銨0. 1 % (w/v)，碳酸氫鈉0. 124% (w/v)，玉米漿粉0. 33% (w / ν)，硫酸錳 0. 05% (w/v)，硫酸鎂 0. 05% (w/v)，硫酸亞鐵 0. 03% (w/v) ；PH 值 7. 5 ；
(4)液體發(fā)酵將培養(yǎng)1 左右三角瓶一級(jí)種子培養(yǎng)基接入發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐裝液系數(shù)70%，上覆2 ml左右液體石蠟，隔絕空氣，接種量350 ml ( 3% 5%)，控溫37°C，攪拌轉(zhuǎn)速50rpm，發(fā)酵過(guò)程中PH值降低到6. 5以下，補(bǔ)加20%碳酸鈉(質(zhì)量分?jǐn)?shù))控制PH值為 6. 5，直到發(fā)酵結(jié)束，且發(fā)酵Mh以?xún)?nèi)流加碳源，流加1%(w/v)碳源，即葡萄糖70g，30h以后，每隔池鏡檢染色，觀察芽孢形成95%以上，放罐；
(5)噴霧干燥發(fā)酵液用均質(zhì)機(jī)均質(zhì)預(yù)處理，控制噴霧干燥中進(jìn)風(fēng)溫度150°C，出口溫度70°C，即可制得高純菌粉，收集菌粉保存。
本發(fā)明權(quán)利要求保護(hù)范圍不僅限于上述實(shí)施例。
權(quán)利要求
1.一種丁酸梭菌的清液發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，包括下述組份葡萄糖0. 8 2. 5% (w/v)，胰蛋白胨 0. 6 2. 3% (w/v)，酵母浸粉 1. 1 2. 8% (w/v)，硫酸銨 0. 05 0. 2 % (w/ ν)，碳酸氫鈉0. 05 0. 25 % (w/v)，玉米漿粉或谷物漿粉或大豆?jié){粉0. 2 0. 45% (w / ν) ； PH值為7 8。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的丁酸梭菌的清液發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，組份是葡萄糖 0. 8% (w/v)，胰蛋白胨0. 6% (w/v)，酵母浸粉1. 1% (w/v)，硫酸銨0. 05 % (w/v)，碳酸氫鈉 0. 05 % (w/v)，玉米漿粉或谷物漿粉或大豆?jié){粉0.洲(w /ν) ；PH值7。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的丁酸梭菌的清液發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，組份是葡萄糖 2.5% (w/v)，胰蛋白胨2. 3% (w/v)，酵母浸粉2. 8% (w/v)，硫酸銨0.2 % (w/v)，碳酸氫鈉0.25 % (w/v)，玉米漿粉或谷物漿粉或大豆?jié){粉0. 45% (w /ν) ；PH值8。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的丁酸梭菌的清液發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于，組份是葡萄糖1.5% (w/v)，胰蛋白胨1. 3% (w/v)，酵母浸粉1. 8% (w/v)，硫酸銨0. 1 % (w/v)，碳酸氫鈉 0. 12% (w/v)，玉米漿粉 0. 33% (w /ν) ；PH 值 7. 5。
5.一種用于權(quán)利要求1所述的丁酸梭菌的清液發(fā)酵培養(yǎng)基促芽孢生成的金屬鹽，其特征在于，包括下述組份硫酸錳0. 01 0. 1%(w/v)，硫酸鎂0. 01 0. l%(w/v)，硫酸亞鐵 0. 01 0. 08% (w/v)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的丁酸梭菌的清液發(fā)酵培養(yǎng)基促芽孢生成的金屬鹽，其特征在于，組份是硫酸錳0. 05% (w/v)，硫酸鎂0. 05% (w/v)，硫酸亞鐵0. 03% (w/v)。
7.一種用于權(quán)利要求1所述的丁酸梭菌的清液發(fā)酵培養(yǎng)基的增殖培養(yǎng)基(RCM)，其特征在于，組成和重量份為酵母浸膏2 4、牛肉浸膏8 12、胰蛋白胨8 12、葡萄糖3 8、可溶性淀粉0. 5 2、氯化鈉3 8、三水合乙酸鈉1 6、半胱氨酸鹽酸鹽0. 1 1. 5、 0. 5% 美藍(lán) 0. 1 3mL、蒸溜水 800 1200mL ；調(diào)節(jié) pH7. 1 士 0. 1。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的丁酸梭菌的清液發(fā)酵培養(yǎng)基的增殖培養(yǎng)基(RCM)，其特征在于，配方組成為酵母浸膏3g、牛肉浸膏10 g、胰蛋白胨10 g、葡萄糖5 g、可溶性淀粉1 g、 氯化鈉5 g、三水合乙酸鈉3 g、半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g、0.5%美藍(lán)0.2mL、蒸餾水IOOOmL ； 調(diào)節(jié) pH7. 1 士 0. 1。
9.一種丁酸梭菌的清液發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟(1)甘油管冷藏菌種活化取甘油管冷藏菌種接種于裝有增殖培養(yǎng)基(RCM)的試管中， 上覆液體石蠟，培養(yǎng)基提前滅菌，然后靜置培養(yǎng)形成芽孢；(2)加熱優(yōu)選將上述培養(yǎng)液混勻后置于水浴中處理；(3)三角瓶一級(jí)種子培養(yǎng)再分別將上述菌液轉(zhuǎn)接到滅過(guò)菌的優(yōu)化后培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期能作為種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中；具有促芽孢生成的金屬鹽的發(fā)酵培養(yǎng)基包括葡萄糖，胰蛋白胨，酵母浸粉，硫酸銨，碳酸氫鈉，玉米漿粉或谷物漿粉或大豆?jié){粉，硫酸錳，硫酸鎂，硫酸亞鐵，并保持一定PH值；(4)液體發(fā)酵將培養(yǎng)好的三角瓶一級(jí)種子培養(yǎng)基接入發(fā)酵罐中發(fā)酵；(5)噴霧干燥發(fā)酵液用均質(zhì)機(jī)均質(zhì)，控制噴霧干燥，即可制得高純菌粉。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的丁酸梭菌的清液發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于， 在所述步驟中(1)甘油管冷藏菌種活化取-25 _18°C冷藏的甘油管菌種180 230 μ L接種于裝有6 12mL增殖培養(yǎng)基(RCM)的試管中，上覆1 3cm液體石蠟，培養(yǎng)基提前滅菌，33 38°C條件下靜置培養(yǎng)40 50h以形成芽孢；所述增殖培養(yǎng)基(RCM)組成和重量份為酵母浸膏2 4、牛肉浸膏8 12、胰蛋白胨8 12、葡萄糖3 8、可溶性淀粉0.5 2、氯化鈉3 8、三水合乙酸鈉1 6、半胱氨酸鹽酸鹽0. 1 1. 5、0. 5%美藍(lán)0. 1 3mL、蒸餾水 800 1200mL ；調(diào)節(jié) ρΗ7· 1 士0. 1，100 120°C，20 min 滅菌備用；(2)加熱優(yōu)選將上述培養(yǎng)液混勻后置于70 90°C水浴中處理9 12min；(3)三角瓶一級(jí)種子培養(yǎng)再分別以1 3%的接種量將上述菌液轉(zhuǎn)接到滅過(guò)菌的優(yōu)化后培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)16_20h到對(duì)數(shù)期能作為種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中；所述具有促芽孢生成的金屬鹽的發(fā)酵培養(yǎng)基，組份為葡萄糖0.8 2. 5% (w/v)，胰蛋白胨0. 6 2. 3% (w/v)，酵母浸粉1. 1 2. 8% (w/v)，硫酸銨0. 05 0. 2 % (w/v)，碳酸氫鈉0. 05 0. 25 % (w/v)，玉米漿粉或谷物漿粉或大豆?jié){粉0. 2 0. 45% (w /ν) ； PH值為7 8 ；硫酸錳0. 01 0. 1% (w/v)，硫酸鎂0. 01 0. 1% (w/v)，硫酸亞鐵0. 01 0. 08% (w/ ν)；(4)液體發(fā)酵將培養(yǎng)好的三角瓶一級(jí)種子培養(yǎng)基接入發(fā)酵罐中，接種量3% 5%， 控溫33 40°C，攪拌轉(zhuǎn)速45 60rpm，發(fā)酵過(guò)程中PH值降低到6. 5以下，補(bǔ)加18 25% 碳酸鈉控制PH值為6. 5，直到發(fā)酵結(jié)束，且發(fā)酵Mh以?xún)?nèi)流加碳源，流加0. 55 1. 5% (w/ ν)碳源;(5)噴霧干燥發(fā)酵液用均質(zhì)機(jī)均質(zhì)，控制噴霧干燥中進(jìn)風(fēng)溫度130 160°C，出口溫度 50 75°C，即可制得高純菌粉。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的丁酸梭菌的清液發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵培養(yǎng)方法，其特征在于，在所述步驟中(1)甘油管保藏菌種活化取-20°C保藏的甘油管菌種200 μ L接種于裝有9mL增殖培養(yǎng)基(RCM)的試管中，上覆2cm液體石蠟，培養(yǎng)基提前滅菌，37°C條件下靜置培養(yǎng)48h以形成芽孢；所述增殖培養(yǎng)基(RCM)配方組成如下酵母浸膏3 g、牛肉浸膏10 g、胰蛋白胨 10g、葡萄糖5g、可溶性淀粉lg、氯化鈉5g、三水合乙酸鈉3g、半胱氨酸鹽酸鹽0. 5g、0. 5%美藍(lán) 0. 2mL、蒸餾水 IOOOmL ；調(diào)節(jié) pH7. 1 士0. 1，115°C，20 min 滅菌備用；(2)加熱優(yōu)選將上述培養(yǎng)液混勻后置于80°C水浴中處理IOmin；加熱可以促進(jìn)芽孢萌發(fā)，有利于菌體生長(zhǎng)一致性和防止雜菌污染；(3)三角瓶一級(jí)種子培養(yǎng)再分別以1 3%的接種量將上述菌液轉(zhuǎn)接到滅過(guò)菌的優(yōu)化后培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)16_20h到對(duì)數(shù)期能作為種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖 1.5% (w/v)，胰蛋白胨1.3% (w/v)，酵母浸粉1.8% (w/v)，硫酸銨0.1 % (w/v)，碳酸氫鈉 0. 124% (w/v)，玉米漿粉 0. 33% (w /ν)，硫酸錳 0. 05% (w/v)，硫酸鎂 0. 05% (w/v)，硫酸亞鐵 0. 03% (w/v) ；PH 值 7. 5 ；(4)液體發(fā)酵將培養(yǎng)好的三角瓶一級(jí)種子培養(yǎng)基接入發(fā)酵罐中，接種量3% 5%， 控溫37°C，攪拌轉(zhuǎn)速50rpm，發(fā)酵過(guò)程中PH值降低到6. 5以下，補(bǔ)加20%碳酸鈉控制PH值為6. 5，直到發(fā)酵結(jié)束，且發(fā)酵Mh以?xún)?nèi)流加碳源，流加1% (w/v)碳源；(5)噴霧干燥發(fā)酵液用均質(zhì)機(jī)均質(zhì)，控制噴霧干燥中進(jìn)風(fēng)溫度150°C，出口溫度70°C， 即可制得高純菌粉。
全文摘要
本發(fā)明涉及丁酸梭菌的清液發(fā)酵培養(yǎng)基，有葡萄糖，胰蛋白胨，酵母浸粉，硫酸銨，碳酸氫鈉，玉米漿粉等，PH值為7～8。用于丁酸梭菌的清液發(fā)酵培養(yǎng)基促芽孢生成的金屬鹽有硫酸錳，硫酸鎂，硫酸亞鐵。用于丁酸梭菌的清液發(fā)酵培養(yǎng)基的增殖培養(yǎng)基有酵母浸膏、牛肉浸膏、胰蛋白胨、葡萄糖、可溶性淀粉、氯化鈉、三水合乙酸鈉、半胱氨酸鹽酸鹽、0.5%美藍(lán)、蒸餾水；調(diào)節(jié)pH7.1。丁酸梭菌的清液發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵培養(yǎng)方法步驟包括甘油管冷藏菌種活化、加熱優(yōu)選、三角瓶一級(jí)種子培養(yǎng)、液體發(fā)酵、噴霧干燥。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)是生產(chǎn)丁酸梭菌具有操作簡(jiǎn)單、發(fā)酵菌數(shù)和芽孢得率高，后處理簡(jiǎn)單，菌粉樣品雜質(zhì)少，有效活菌數(shù)高，總體上節(jié)約成本等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102363754SQ20111011692
公開(kāi)日2012年2月29日 申請(qǐng)日期2011年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月7日
發(fā)明者彭楠, 梁運(yùn)祥, 王績(jī), 葛向陽(yáng), 趙旭冬, 趙述淼 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)