專利名稱：羊梭菌病疫苗生產(chǎn)用厭氧產(chǎn)毒培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物培養(yǎng)基，具體涉及羊梭菌病疫苗生產(chǎn)用厭氧產(chǎn)毒培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
梭菌性疾病是由厭氣梭菌屬中多種梭菌引起的一類各種動物的傳染病，如快疫、猝狙、痢疾、腸毒血癥、氣腫疽、黑疫、肉毒梭菌中毒癥、破傷風等。該類疾病以發(fā)病急速、病程短促、來不及治療和病死率高為特征。病原菌多為土壤性細菌，廣泛存在于世界各地，造成很大的經(jīng)濟損失。梭菌性疾病的免疫主要是通過滅活梭菌培養(yǎng)過程中所產(chǎn)生的毒素而實現(xiàn)，毒素為疫苗的主要有效免疫抗原。因此，培養(yǎng)這類細菌，使它們大量繁殖生長，并且分泌表達高效價的毒素，可以制作出免疫效果優(yōu)良的疫苗。羊快疫、猝狙(或羔羊痢疾)、腸毒血癥三聯(lián)滅活疫苗就是其中一種，它可以預防羊的快疫、猝狙、羔羊痢疾和腸毒血癥四種傳染病，稱為羊梭菌病三聯(lián)四防疫苗，在我國廣大農(nóng)牧區(qū)用量很大。除此之外，羊梭菌病多聯(lián)干粉滅活疫苗的全國用量也很大，它可以預防羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、腸毒血癥、黑疫、肉毒梭菌中毒癥和破傷風等。其生產(chǎn)廠家主要有蘭州中牧(原蘭州生物藥品廠)、內(nèi)蒙金宇(原內(nèi)蒙古生物藥品廠)、西藏生物藥品廠和新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司(原新疆生物藥品廠)，疫苗種類包括常規(guī)苗、濃縮苗和干粉苗。
《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》(2000版)中規(guī)定，用于厭氧菌培養(yǎng)生產(chǎn)疫苗的培養(yǎng)基主要有以下幾種厭氧肉肝湯、多蛋白胨牛心湯培養(yǎng)基、厭氧肉肝胃酶消化湯I或II、魚肉胃酶消化湯肉肝湯、豆肝湯、魚肉胃酶消化湯、胰酶消化牛肉湯、破傷風培養(yǎng)基、肉渣培養(yǎng)基、蛋白胨肉肝湯等。培養(yǎng)基類型復雜，制造工藝繁瑣，成本高，并且使用的牛肉會因為肉的質(zhì)量影響到培養(yǎng)基的優(yōu)劣，牛肉中殘留藥物可能導致抑制細菌生長而使培養(yǎng)基質(zhì)量降低甚至報廢，質(zhì)量不穩(wěn)定，不利于生產(chǎn)與檢驗。
目前，羊梭菌病疫苗均用厭氣肉肝胃酶消化湯培養(yǎng)基，由于過去牛肉價格較低，對疫苗的生產(chǎn)成本影響不大。但近十幾年來，牛肉價格不斷上升，生產(chǎn)成本的增加和疫苗銷售價格的下降使得原有的利潤空間進一步減少，牛肉價格在很大程度上決定疫苗生產(chǎn)的經(jīng)濟效益。另一方面，用大量牛肉、肝、胃蛋白酶等動物源性成分來制備，其工藝繁瑣，要剔除脂肪、筋、膜，用絞肉機絞碎，在65℃條件下加胃蛋白酶，再在53--55℃條件下消化24小時(期間需不斷攪拌)，最后，加入其它成份加熱、過濾等程序制成。配制一批生產(chǎn)用的培養(yǎng)基需要6人3天才能完成，成本高，經(jīng)濟效益差。同時還會受到肉品質(zhì)的影響(如抗生素的殘留等)，使得培養(yǎng)基品質(zhì)不穩(wěn)定和質(zhì)量不宜控制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)之不足，提供一種成本低廉、質(zhì)量穩(wěn)定的羊梭菌病疫苗生產(chǎn)用厭氧產(chǎn)毒培養(yǎng)基。
本發(fā)明羊梭菌病疫苗生產(chǎn)用厭氧產(chǎn)毒培養(yǎng)基是由下述重量配比的原料制成(按生產(chǎn)1000ml培養(yǎng)基成品計算)蛋白胨 15-30g 酵母浸出粉 2-3gNaCl1-3g Na2HPO4·12H2O 5-10g粗糊精 5-10g 硫代乙醇酸鈉0.01-0.08g葡萄糖 3-10g ZnSO4·7H2O 0.01-0.1g亞硫酸鈉0.1-0.5g其余為蒸餾水。
本發(fā)明培養(yǎng)基的最佳重量配比是(按生產(chǎn)1000ml培養(yǎng)基成品計算)蛋白胨15g 酵母浸出粉2.5gNaCl 2.5g Na2HPO4·12H2O10g粗糊精10g 硫代乙醇酸鈉 0.05g葡萄糖5g ZnSO4·7H2O0.04g亞硫酸鈉 0.5g其余為蒸餾水。
本發(fā)明培養(yǎng)基的配方依據(jù)是根據(jù)厭氧菌自身的生長代謝理論，設(shè)計成本較低的、含有促進其生長和產(chǎn)毒素因子成分的市售原材料(化學和生物試劑)為基礎(chǔ)的規(guī)?；a(chǎn)梭菌疫苗用培養(yǎng)基。將細菌產(chǎn)毒培養(yǎng)基設(shè)計分為三個系統(tǒng)，即厭氧系統(tǒng)(提供較低的氧化還原電勢)、營養(yǎng)系統(tǒng)(提供促進生長代謝的基礎(chǔ)物質(zhì)，碳源、氮源、生長因子等)和輔助系統(tǒng)(即維持良好的厭氧環(huán)境，又提供營養(yǎng)成分)。厭氧系統(tǒng)用添加還原劑亞硫酸鈉、硫乙醇酸鹽、葡萄糖(厭氧與營養(yǎng)雙重作用)等，使培養(yǎng)基保持較低的氧化還原電勢，以保證厭氧生長的良好環(huán)境；營養(yǎng)系統(tǒng)采用添加蛋白胨、酵母浸出粉和礦物質(zhì)等，使培養(yǎng)基含有較豐富的胨、肽、氨基酸、維生素等營養(yǎng)成分，利于細菌生長；輔助系統(tǒng)采用添加糊精起到增加培養(yǎng)基的粘稠度、減少液體培養(yǎng)基中氧的傳遞、并可作為碳源而被利用的作用。所選原料雖為成本較低的市售試劑，完全可以保證其質(zhì)量的穩(wěn)定性。
使用本發(fā)明培養(yǎng)基和厭氣肉肝胃酶消化湯培養(yǎng)基生產(chǎn)羊梭菌病疫苗經(jīng)濟效益比較

本發(fā)明的優(yōu)點是成本低廉、質(zhì)量穩(wěn)定。
為了證明本發(fā)明培養(yǎng)基可用于羊梭菌病疫苗的生產(chǎn)，現(xiàn)將實驗的情況介紹如下1.1菌種 產(chǎn)氣莢膜梭菌B型(C58-2)、D型(C60-2)，腐敗梭菌(C55-1)由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。
1.2培養(yǎng)基 按本發(fā)明本配方自行配制。
1.3實驗動物 昆明(KM)小鼠，16-20g，由新疆天康畜牧生物技術(shù)股份有限公司生物制品事業(yè)部動物室自繁自養(yǎng)；新西蘭白兔，1.5-2.0kg，購于新疆地方病研究所動物中心。
1.4試驗方法1.4.1細菌的培養(yǎng)，按《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》(2000版)介紹的方法接種于本發(fā)明培養(yǎng)基，產(chǎn)氣莢膜梭菌B型、D型接種量為1％，置35℃溫室靜止培養(yǎng)，B型菌培養(yǎng)10-20h，D型菌培養(yǎng)16-24h。腐敗梭菌接種量為2％，37℃靜止培養(yǎng)20-24h。
1.4.2毒素或毒力測定 按《規(guī)程》介紹的方法進行。產(chǎn)氣莢膜梭菌的培養(yǎng)菌液離心取上清液，用明膠緩沖溶液稀釋，尾靜脈注射KM小鼠測其毒力，其最小致死量應(yīng)不低于下列標準B型0.001-0.002ml；D型(經(jīng)胰酶活化)0.0005-0.00075ml。腐敗梭菌培養(yǎng)菌液0.01ml直接肌肉注射KM小鼠。觀察24h，記錄小鼠死亡情況。
1.4.3疫苗配制 按《規(guī)程》介紹的方法將培養(yǎng)測毒合格的菌液加入各菌液量0.5-0.8％的甲醛溶液密封，37-38℃滅活脫毒5-8d，經(jīng)滅活、脫毒檢驗合格后配制疫苗，分裝、檢驗。
1.4.4成品檢驗 按《規(guī)程》進行。
1.4.4.1無菌檢驗 取制備的疫苗1ml接種50ml硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基(T.G)小瓶，37℃培養(yǎng)3天后，分別取0.2ml移植T.G小管和酪胨瓊脂(G.A)斜面各2支，1支置37℃；1支置25℃；另取0.2ml接種1支葡萄糖蛋白胨湯(G.P)小管，置25℃，每天觀察2次，連續(xù)觀察5天。
1.4.4.2安全檢驗 用體重1.5-2.0kg新西蘭白兔4只，各肌肉注射疫苗5ml。每天觀察2次，觀察10天。
1.4.4.3效力試驗 將每批疫苗接種1.5-2.0kg的新西蘭白兔4只，每只肌肉注射3ml，注射后14-21天進行檢驗。產(chǎn)氣莢膜梭菌采用中和試驗方法測定免疫動物血清效價；腐敗梭菌采用直接攻毒法。中和法是家兔免疫14-21天后采血，分離血清，將4只兔血清等量混合，分別取0.1ml與被檢疫苗相應(yīng)的毒素混合，B型和C型中和1個致死量毒素(1MLD)，D型中和3MLD，置37℃中和40分鐘，然后靜脈注射體重16-20g KM小鼠各2只；同時各用同批KM小鼠2只，分別注射1MLD相同的毒素作對照，觀察24h，記錄小鼠死亡情況。直接攻毒法是家兔免疫14-21天采血以備中和檢驗后，連同條件相同的2只空白對照家兔，直接肌肉注射致死量的腐敗梭菌菌液，觀察14天，記錄結(jié)果，判定菌苗效力。
使用本發(fā)明培養(yǎng)基培養(yǎng)的毒力合格的細菌菌液按《規(guī)程》配制3批疫苗，并進行檢驗，3批疫苗的無檢、安檢和效檢均達到《中華人民共和國獸用生物制品質(zhì)量標準》[2]的標準。檢驗結(jié)果詳見表1。
2結(jié)論 本發(fā)明培養(yǎng)基對產(chǎn)氣莢膜梭菌B型、D型和腐敗梭菌的培養(yǎng)試驗證明，所有培養(yǎng)物所產(chǎn)毒素結(jié)果均達到規(guī)程規(guī)定的0.0005ml致死KM小鼠的高標準，完全可以達到厭氣肉肝胃酶消化湯的培養(yǎng)水平，而成本僅為其21％。實驗試制的三批疫苗經(jīng)檢驗，均達到《中華人民共和國獸用生物制品質(zhì)量標準》的標準，本發(fā)明培養(yǎng)基培養(yǎng)的產(chǎn)氣莢膜梭菌和腐敗梭菌所產(chǎn)毒素等抗原成分的免疫原性良好。
表1 本發(fā)明培養(yǎng)基培養(yǎng)細菌菌液配制的三聯(lián)四防苗效力檢驗結(jié)果

注中和試驗動物為KM小鼠，攻毒試驗動物為家兔，對照均2/2死亡；腐敗梭菌1MLD為0.6ml四具體實施方式
生產(chǎn)1000ml本發(fā)明培養(yǎng)基選取蛋白胨 20g 酵母浸出粉 3gNaCl2g Na2HPO4·12H2O 8g粗糊精 8g 硫代乙醇酸鈉 0.05g葡萄糖 5g ZnSO4·7H2O 0.04g亞硫酸鈉0.2g其余為蒸餾水制作方法是將蛋白胨、酵母浸出粉、NaCl、Na2HPO4·12H2O、粗糊精、硫代乙醇酸鈉、葡萄糖、亞硫酸鈉和ZnSO4·7H2O，加適量的蒸餾水依次混合溶解，121℃滅菌30分鐘，即得到本發(fā)明培養(yǎng)基。
權(quán)利要求
1.羊梭菌病疫苗生產(chǎn)用厭氧產(chǎn)毒培養(yǎng)基，其特征在于它由下述重量配比的原料制成(按生產(chǎn)1000ml培養(yǎng)基成品計算)蛋白胨15-30g酵母浸出粉2-3gNaCl 1-3g Na2HPO4·12H2O5-10g粗糊精5-10g 硫代乙醇酸鈉 0.01-0.08g葡萄糖3-10g ZnSO4·7H2O0.01-0.1g亞硫酸鈉 0.1-0.5g其余為蒸餾水。
2.如權(quán)利要求1所述的羊梭菌病疫苗生產(chǎn)用厭氧產(chǎn)毒培養(yǎng)基，其中各原料重量配比是(按生產(chǎn)1000ml培養(yǎng)基成品計算)蛋白胨15g 酵母浸出粉2.5gNaCl 2.5g Na2HPO4·12H2O10g粗糊精10g 硫代乙醇酸鈉 0.05g葡萄糖5gZnSO4·7H2O0.04g亞硫酸鈉 0.5g其余為蒸餾水。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種羊梭菌病疫苗生產(chǎn)用厭氧產(chǎn)毒培養(yǎng)基，它由蛋白胨、酵母浸出粉、NaCl、Na
文檔編號C12N1/20GK1696282SQ20041004422
公開日2005年11月16日 申請日期2004年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月13日
發(fā)明者黃炯, 張讀樸, 符子華 申請人:新疆維吾爾自治區(qū)畜牧科學院獸醫(yī)研究所