專利名稱：高丁醇比丙酮丁醇梭菌及其培養(yǎng)方法與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種高丁醇比丙酮丁醇梭菌，這種菌株的培養(yǎng)方法及其在溶劑發(fā)酵工業(yè)中的應用。
丁醇是一種極為有用的化工和制藥工業(yè)的重要原料，在化學工業(yè)中，丁醇在油漆、塑料、樹脂等有機合成領域有廣泛的應用，在制藥工業(yè)中，特別在青霉素等抗生素的提煉過程中必須大量使用由丁醇而得到的丁酯類溶劑，丁醇可以由石油化工合或技術取得，但制藥工業(yè)則優(yōu)先采用由生物發(fā)酵生產的丁醇。同時，在石油開采發(fā)生危機(1973-1974)之后，人們對微生物發(fā)酵生產溶劑的興趣重現(xiàn)，特別是在石油資源缺乏或石油化工業(yè)技術較差的國家地區(qū)，以再生資源淀粉質進行溶劑發(fā)酵仍是丁醇生產的重要途徑，最近兩次(1990和1994)的國際工業(yè)微生物遺傳學術會議都有專題討論梭菌遺傳、生化代謝與基因克隆等內容，充分反映了這個傳統(tǒng)生產方法的重要意義。
傳統(tǒng)的發(fā)酵法生產丙酮丁醇是以玉米或玉米加薯干為淀粉質原料，直接接入典型的丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌(Clostridiumacetobutylicum)。其生產工藝是玉米→粉碎→配醪→蒸煮→后熟→醪冷卻→接種→在一定溫度和時間下完成發(fā)酵→蒸餾，得到丁醇、丙酮、乙醇。在發(fā)酵過程中產生的丁醇對菌體生長和產生溶劑有抑制作用，發(fā)酵醪液中溶劑的濃度受到限制。傳統(tǒng)法生產溶劑的主要缺點是溶劑比例不盡人意，丁醇、丙酮、乙醇三種溶劑的比例為6∶3∶1，在國內，此法生產所得到的丁醇，比例還要略低一些，約在57％-60％。
因此如何來提高溶劑中丁醇的比例是廣大研究者的一致目的，但現(xiàn)有技術均采用傳統(tǒng)的丙酮丁醇梭菌Clostridiumacetobutylicum，注重在發(fā)酵工藝上研究改進。如申請?zhí)枮?7103534，名稱為“吸附法固定化細胞直接發(fā)酵淀粉質原料生丙酮丁醇的方法”的一項發(fā)明專利申請，申請人提出用丙酮丁醇梭菌經5％玉米醪培養(yǎng)基中培養(yǎng)和篩選得到對數(shù)生產期的丙酮丁醇菌液，制備吸附法固定化細胞然后采用吸附法固定化細胞直接發(fā)酵淀粉質原料生產丙酮丁醇溶劑。該項發(fā)明所提出的方法目前仍停留在實驗室階段，另外由于這種方法采用傳統(tǒng)的菌種，故肯定不能達到用本發(fā)明的菌種在發(fā)酵生產中所能達到的高丁醇的比例。
本發(fā)明的目的在于提供一種能產生高比例丁醇的新菌株，這種新菌株的包括分離、選育、復壯、保藏的培養(yǎng)方法及其在現(xiàn)有發(fā)酵工業(yè)設備條件下生產溶劑的工藝。
本發(fā)明的目的就是結合本研究所承擔的國家重點科技攻關項目的任務，經過近十年的由實驗室至工業(yè)規(guī)模大生產的不懈研究，終于圓滿完成任務。根據(jù)本發(fā)明人對丙酮丁醇梭菌的生理生化和代謝途徑的研究以及在菌種化學誘變與選育方面的經驗積累，提出本發(fā)明的技術方案是采集大豆種植區(qū)大豆根際的土樣為分離新菌株的來源，以新鮮馬鈴薯塊莖作為培養(yǎng)物的載體，厭氧、37℃水浴保溫培養(yǎng)，產生氣泡時把培養(yǎng)物移種到玉米醪試管中，在37-39℃高溫條件下進行厭氧培養(yǎng)，將培養(yǎng)物移到固體平板上在37-39℃高溫條件下厭氧培養(yǎng)出單菌落，再接種于玉米醪試管中在上述條件下進行初篩，選擇較優(yōu)菌株用誘變劑作誘變處理并在加拮抗劑的條件下選育得到丙酮丁醇梭菌的突變菌株EA2018。為保持菌種優(yōu)良性狀，取發(fā)酵醪液對EA2018菌株進行復壯，冷凍保藏菌株以供生產備用。
根據(jù)上述技術方案所培養(yǎng)出來的菌株，命名為丙酮丁醇梭菌EA2018菌株(Clostridium acetobutylicum EA2018)，屬于丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)，是丙酮丁醇梭菌的突變菌株，該菌株保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期是1994年11月18日，保藏編號是CCTCC NOM94061，該培養(yǎng)物(株)的存活性經該保藏中心于1994年12月10日檢測完畢，結果為存活。該菌株具有在發(fā)酵生產所得的溶劑中丁醇比例高達67-72％的特性。
具體的做法是在7-8月份，從上海郊縣的大豆種植區(qū)采集根際土樣共64份。在馬鈴薯塊莖上用打孔器形成1.0-1.5厘米深的小洞，放入適量土樣，石臘封口并將其放入水缽中，37℃保溫培養(yǎng)。新鮮馬鈴薯的淀份質營養(yǎng)即可支持土樣中的某些微生物進行厭氧生長。當浸沒在水中的馬鈴薯塊的小洞封口處產生氣泡時，將薯塊取出、打開封口，并把培養(yǎng)物移種到5-7％的玉米醪試管(15×150毫米)中，玉米醪裝量7毫升，37℃靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)中，玉米醪液內不斷產氣并有絮狀物出現(xiàn)，即醪蓋逐漸形成，經40-48小時的37℃培養(yǎng)，取少量醪液涂布在固體平板上，平板置于干燥器中，抽除空氣，37℃培養(yǎng)4-5天，平板表面出現(xiàn)單菌落。
固體平板的培養(yǎng)基配方(克/升)為牛肉膏5、蛋白胨10、酵母膏5、葡萄糖5、氯化鈉5、瓊脂25、調節(jié)酸堿度至PH6.5。
產溶劑菌株的篩選分別將上述單菌按常規(guī)技術接入5-6％玉米醪試管(規(guī)格15×150毫米)中，每支試管裝料7毫升，37℃培養(yǎng)48小時，從64個土樣中共分離純化得到產溶劑的菌株1200余株。對這些菌株的發(fā)酵醪液進行氣相色譜分析，以比較各菌株的溶劑總量和丙酮、丁醇、乙醇三種成份的相對比例。經多次發(fā)酵篩選，從中選出較優(yōu)的5個菌株4號、11號、12號、17號和19號，進一步發(fā)酵篩選證明4號菌株的丁醇產量較高，即以4號菌為出發(fā)菌進行誘變育種。
表14號菌株的溶劑產量(克/升)和丁醇比例丙酮 丁醇 乙醇 總溶劑丁醇比例2.6437.9320.43711.01372％2.6737.9630.60611.24270.8％4號菌株經誘變選育得20號菌株，該菌株在7％玉米醪中發(fā)酵，總溶劑產量13.0克/升，其中丁醇占67.2％，20號菌株進一步多次誘變，經平板篩選而得EA2018、EA2019。選育過程見表2。
表2高丁醇比菌株選育譜系
↓↓丙4.835g/L 丙5.372g/L乙0.665g/L 乙0.713g/L丁12.767g/L 丁13.g73g/L總18.267g/L 總20.058g/L丁69.9％丁69.7％表中數(shù)據(jù)是典型發(fā)酵結果誘變育種的方法如下誘變劑采用EMS(甲基磺酸乙酯)或NTG(亞硝基胍)，拮抗劑選用丙烯醇。
出發(fā)菌菌液過濾去醪蓋后，取5毫升菌液加入5毫升0.2M的EMS溶液于PH6.0-7.5、0.2M磷酸緩沖溶液中，充分混合并置于37℃的往復式搖床以100次/分的速率振蕩處理2小時然后取出，加入適量硫代硫酸納使反應終止，取菌液涂布到加有丙烯醇(2毫升/300毫升培養(yǎng)基)的固體平板上，置于干燥器內，抽去空氣，37℃培養(yǎng)48-72小時后，挑單菌到玉米醪中進行篩選?；蚍Q取NTG溶于PH6.0-7.5磷酸緩沖液中，使?jié)舛葹?毫克/毫升，在6毫升菌液中加入NTG溶液2毫升，搖勻后37℃保溫半小時，稀釋涂在加有丙烯醇的平板上，將平板置于干燥內，37℃厭氧培養(yǎng)48-72小時，即可挑單菌到玉米醪中進行篩選。
高丁醇比丙酮丁醇梭菌菌株的復壯及保藏技術。
與其他的工業(yè)發(fā)酵菌株一樣，對于高丁醇比菌種也需要經常進行菌種的選育、復壯，以保證優(yōu)良性狀得以保存，與常規(guī)的丙酮丁醇菌相比，本發(fā)明高丁醇比菌株不采用高溫處理去除弱孢子的方法，其復壯技術是將發(fā)酵醪液用紗布過濾，取0.1毫升濾液涂平板后置于干燥器內，37℃厭氧培養(yǎng)5天，得到單菌落，接入5-6％玉米醪試管37℃培養(yǎng)48小時，再接7％-8％玉米醪250毫升三角燒瓶，37℃發(fā)酵48小時，氣相色譜測定溶劑總量和丁醇比例，擇優(yōu)保藏。
其保藏方法是復壯后菌液用紗布過濾去廢醪后，以3000～4000轉/分速率離心5分鐘，去上清液，將沉淀(孢子)懸浮于20％甘油中，-30℃冷凍保藏。
高丁醇比丙酮丁醇梭菌的工業(yè)生產工藝及其監(jiān)控方法傳統(tǒng)的丙酮丁醇梭菌工業(yè)生產的工藝流程是試管醪(菌種)→按試管醪在100℃加熱1.5分鐘以去除弱孢子，然后在37-39℃下培養(yǎng)→6公升種子瓶→種母罐→發(fā)酵罐。
本發(fā)明保藏之菌種經復壯后，于固體平板上作單菌落分離并接種于5％-6％玉米醪試管，37℃培養(yǎng)40小時，然后同步分別轉接7％玉米醪的試管和250毫升三角瓶(裝醪150毫升)，37℃培養(yǎng)48小時，醪液作氣相色譜分析，擇發(fā)酵性能良好者接入6公升醪液種子瓶，37℃培養(yǎng)36小時，轉入50噸種母罐擴種后進入發(fā)酵罐連續(xù)發(fā)酵，整個生產流程見表3。
表3工業(yè)生產規(guī)模的工藝流程甘油管→涂平板→置于干燥器抽真空，37℃培養(yǎng)5天↓挑單菌到5％玉米醪37℃培養(yǎng)，40小時↓傳一代試管↓250毫升三角瓶↓溶劑三成份分析，擇優(yōu)接種↓六公升種子瓶↓種母罐———————→發(fā)酵罐本生產工藝中設計了在種子進入6公升種子瓶前對種子質量監(jiān)控的技術，保證了高質菌種入罐發(fā)酵。
混合發(fā)酵原料的應用。
可供發(fā)酵法生產溶劑所使用的淀粉質原料種類很多，如糖蜜、大米、玉米、薯干。為適應不同地區(qū)的原料不同、價格差異、運輸?shù)纫蛩兀陮υ系倪m應性很重要。本發(fā)明提供的高丁醇比菌種除能適用單一玉米發(fā)酵外，亦能用于玉米/薯干，玉米/高梁混合發(fā)酵，當以玉米醪濃度為7％，其中可用20％薯干替代玉米，即玉米5.6％，薯干1.4％進行發(fā)酵，結果見表4表4以玉米/薯干為原料，高丁醇比菌種發(fā)酵溶劑總量及比例表菌號 丙酮 丁醇 乙醇 總溶劑丁醇比例EB20184.612.9541.01418.57869.7EB20194.291 12.9611.03118.28570.8所產溶劑量以及丁醇所占比例與7％純玉米醪發(fā)酵結果相似。
當以玉米/高梁為混合原料發(fā)酵作規(guī)模生產時，也得到理想結果。玉米醪濃度為7％時，高梁的替代比例可高達48％左右，詳見表5。表5玉米/高梁混料發(fā)酵中溶劑月產量(噸)和三成份所占幾例(％)
本發(fā)明的優(yōu)點十分明顯突出，這種高丁醇比丙酮丁醇梭菌生產高丁醇溶劑性狀穩(wěn)定、對高溫的耐受性強、對發(fā)酵原料的適應性好、發(fā)酵效率高，是一種適合工業(yè)生產的優(yōu)良菌株。
1、生產溶劑性狀穩(wěn)定，所產正丁醇比例比現(xiàn)有技術高10％。在溶劑廠培菌室進行6公升發(fā)酵試驗以考察高丁比菌株的穩(wěn)定性，對EA2018和EA2019兩菌株進行了多次發(fā)酵和溶劑分析測試，結果見表6表6高丁醇比菌株多批發(fā)酵中的溶劑產量(克/升)和丁醇比例(％)(7％玉米醪，37℃，48小時)菌株 實驗批號丙酮丁醇 乙醇總溶劑丁醇比例EA2018 14.4411.690.5316.69 70.024.4711.810.5716.96 70.034.4911.860.6416.99 69.944.8412.770.6718.29 69.855.3414.240.7520.37 70.165.4314.520.7320.70 70.2菌株 實驗批號丙酮丁醇 乙醇總溶劑丁醇比例EA2019 14.4211.600.6416.66 69.624.7212.240.6517.61 69.535.3713.970.7120.06 69.745.1413.120.6418.90 69.4
54.6512.210.6617.5169.764.9913.230.6618.8970.1對EA2018菌株做連續(xù)傳代試驗，同一菌株在7％玉米醪液中，連續(xù)轉換傳代，對每一代的發(fā)酵醪液作溶劑總量和三成分的測定，證明高丁比性狀在十五次傳代中仍較穩(wěn)定。
2、高丁醇比菌種對溫度的適應性好一般而言，丙酮丁醇梭菌的最適發(fā)酵溫度為37℃，但在工業(yè)生產操作中.有時因進醪溫度偏高，而影響發(fā)酵正常進行，因此，菌種以能對溫度有一定耐受性為佳，溫度對EA2018發(fā)酵影響見表7表7高丁比菌株EA2018的耐溫性發(fā)酵溫度 溶劑產量(克/升)丙酮 丁醇乙醇總溶劑丁醇比例(％)37℃ 4.8412.600.6718.1169.939℃ 4.4513.050.8618.3671.140℃ 4.4511.901.3017.6867.4由此可見，EA2018在39℃，發(fā)酵完全正常，當溫度升到40℃時，總溶劑量和丁醇比例均略有下降，但并不嚴重，因此，這一菌種能適于工業(yè)生產應用。
3、本發(fā)明的菌種對發(fā)酵原料的適應性好，不僅可采用玉米為原料還可以部分更為價廉的高梁來替代玉米。
4、發(fā)酵效率較現(xiàn)有水平高0.5％-1％。
綜上所述，我所微生物代謝調節(jié)研究室，通過土樣篩選、菌種選育、誘變處理、發(fā)酵優(yōu)化、獲得了可供工業(yè)規(guī)模應用的高丁比丙酮丁醇發(fā)酵菌株。在不改變國內現(xiàn)有發(fā)酵生產設備的條件下，發(fā)揮菌種優(yōu)勢，以6-7％玉米醪或同樣醪濃度的玉米(52％)高梁(48％)混料發(fā)酵，控制37-39℃罐溫，氣相色譜分析結果總溶劑17-18克/升，丙酮(A)/丁醇(B)/乙醇(E)之比為23％∶70％∶7％。該高丁醇比菌種經某溶劑廠工業(yè)規(guī)模7只100噸罐連續(xù)發(fā)酵近一年的生產考察，實際生產成品入庫率的ABE之比為21.0％∶71.4％∶7.6％。發(fā)酵平均效率在24.5％和25.5％之間。該菌種大大提高了工業(yè)生產的經濟效益。
權利要求
1.一種高丁醇比丙酮丁醇梭菌，其特征在于該菌株命名為丙酮丁醇梭菌EA2018菌株(Clostridium.acetobutylicumEA2018)，屬于丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)，是丙酮丁醇梭菌的突變菌株，該菌株保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期是1994年11月18日，保藏編號是CCTCCNOM94061，它具有在發(fā)酵生產所得的溶劑中丁醇比例高達67-72％的特性。
2.一種高丁醇比丙酮丁醇梭菌的培養(yǎng)方法，其特征在于(1)采集大豆種植區(qū)大豆根標土樣為分離新菌株的來源(2)以新鮮馬鈴薯塊莖作為培養(yǎng)物的載體、厭氧、37℃水浴保溫培養(yǎng)，產生氣泡時把培養(yǎng)物移種到玉米醪試管中在37-39℃高溫條件下進行厭氧培養(yǎng)，將培養(yǎng)物移到固體平板上在37-39℃高溫條件下厭氧培養(yǎng)出單菌落，再接種于玉米醪試管中在上述條件下進行初篩、選擇優(yōu)質菌株以甲基磺酸乙酯(EMS)或亞硝基胍(NTG)為誘變劑和以丙烯醇為拮抗劑進行多次誘變、選育，得到可應用于發(fā)酵工業(yè)的高丁醇比丙酮丁醇EA2018菌株(3)取發(fā)酵醪液進行菌株的復壯(4)冷凍保藏菌株。
3.根據(jù)權利要求2所述的一種高丁醇比丙酮丁醇梭菌的培養(yǎng)方法，其特征在于該方法的具體步驟是(1)采集大豆種植區(qū)大豆根標土樣；(2)在馬鈴薯塊莖上用打孔器形成一個小洞，放入適量土樣，以石臘封口后將薯塊置入水缽中，37℃保溫培養(yǎng)；當浸沒在水中的馬鈴薯塊的小洞封口處產生氣泡時，取出薯塊，打開封口，把培養(yǎng)物移種到5-7％的玉米醪試管，37℃、40-48小時靜置培養(yǎng)，醪蓋逐漸形成，取少量醪液涂布于固體平板，平板置于干燥器中，37℃厭氧培養(yǎng)4-5天，平板表面出現(xiàn)單菌落(3)將單菌落接入若干個5％-6％的玉米醪試管中，37℃培養(yǎng)48小時，選擇溶劑總量和丁醇比例相對高的菌株作為誘變育種的出發(fā)菌株(4)誘變育種的出發(fā)菌株經化學誘變劑和拮抗劑多次誘變和選育，選擇溶劑總量和丁醇比例高的菌株進一步用誘變劑處理，經平板篩選得EA2018菌株。
4.根據(jù)權利要求2所述的一種高丁醇比丙酮丁醇梭菌的培養(yǎng)方法，其特征在于誘變育種的技術是誘變劑采用EMS(甲基磺酸乙酯)或NTG(亞硝基胍)，拮抗劑選用丙烯醇；(1)出發(fā)菌菌液過濾去醪蓋，取過濾液5毫升，加入5毫升0.2M的EMS溶液于PH6.0-7.5、0.2M磷酸緩沖溶液中充分混合后，37℃下用搖床使其充分反應，然后取出，加入適量硫代硫酸鈉終止反應，取菌液涂布到加有丙烯醇的固體平板上，置于干燥器內，37℃厭氧培養(yǎng)48-72小時后，挑單菌到玉米醪中進行篩選(2)或稱取NTG溶于PH6.0-7.5磷酸緩沖液中，使?jié)舛葹?毫克/毫升，在6毫升菌液中加入NTG溶液2毫升，搖勻后37℃保溫半小時，稀釋涂在加有丙烯醇的平板上，將平板置于干燥器內，37℃厭氧培養(yǎng)48-72小時，即可挑單菌到玉米醪中進行篩選。
5.根據(jù)權利要求2所述的一種高丁醇比丙酮丁醇梭菌的培養(yǎng)方法，其特征在于該菌種的復壯技術是發(fā)酵醪液經紗布過濾，取0.1毫升濾液涂于固體平板于干燥器中37℃厭氧培養(yǎng)5天得到單菌落，單菌接入5-6％玉米醪試管，37℃培養(yǎng)48小時，再接7％-8％玉米醪250毫升三角瓶，37℃發(fā)酵48小時，測定溶劑總量和丁醇比例，擇優(yōu)保藏以備生產用。
6.根據(jù)權利要求1所述的一種高丁醇比丙酮丁醇梭菌的培養(yǎng)方法，其特征在于該菌種的保藏技術是復壯后菌種的菌液用紗布過濾，離心后去上清液，將沉淀(孢子)懸浮于20％甘油中-30℃冷藏保藏。
7.一種高丁醇比丙酮丁醇梭菌的應用，其特征在于工業(yè)生產規(guī)模的工藝流程是保藏之菌種經復壯后，于固體平板上作單菌落分離并接種到5％-6％玉米醪試管37℃培養(yǎng)40小時后，同步分別轉接7％玉米醪試管和250毫升三角瓶，37℃培養(yǎng)48小時，分析溶劑總量和三種成份的比例，擇優(yōu)者接入6公升玉米醪種子瓶，37℃培養(yǎng)36小時，轉入50噸種母灌擴種后進入發(fā)酵罐連續(xù)發(fā)酵。
8.根據(jù)權利要求7所述的一種高丁醇比丙酮丁醇梭菌的應用，其特征在于發(fā)酵原料中可用高梁替代部分玉米，替代比例是6-7％的醪中玉米占52％、高梁占48％，作為混合發(fā)酵原料。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種丙酮丁醇梭菌EA2018菌株，它是丙酮丁醇梭菌的突變菌株，具有在發(fā)酵生產溶劑中丁醇比高達67-72％的特性。本發(fā)明還提供了包括分離、選育、復壯、保藏的培養(yǎng)方法以及工業(yè)生產工藝，工藝中設計了種子質量監(jiān)控方法，本菌株高丁比性狀穩(wěn)定，耐溫性好，可以48％高粱替代玉米發(fā)酵，發(fā)酵效率高，是一種適合工業(yè)生產的優(yōu)良菌種。
文檔編號C12N1/20GK1143677SQ9511173
公開日1997年2月26日 申請日期1995年8月23日 優(yōu)先權日1995年8月23日
發(fā)明者張益棻, 楊蘊劉, 陳軍, 焦瑞身 申請人:中國科學院上海植物生理研究所