專利名稱：利用高密度發(fā)酵制備重組人心鈉肽(rhANP)的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物發(fā)酵技術領域，特別是利用高密度發(fā)酵制備重組人心鈉肽(rhANP)的方法。
背景技術：
人心鈉肽(ANP)是由心房肌細胞產(chǎn)生和分泌的一種多肽激素，有α、β、γ三種形式。α-ANP生物活性最強，由28個氨基酸組成，其結構如下 ANP的生物學作用主要有四方面排鈉利尿；擴張血管；降低血壓；抗心率失常。在臨床上，ANP目前主要用于治療急性心率衰竭。
1986年，我國正式將重組人心鈉肽項目列入國家重點攻關項目。但由于ANP的表達和純化比較困難，因而限制了ANP的產(chǎn)業(yè)化應用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用高密度發(fā)酵批量化制備重組人心鈉肽(rhANP)的方法，該方法成本低，操作簡單，重復性好，完全適合于rhANP在制藥領域的應用。
本發(fā)明的制備方法的整體技術構思是該制備方法包括如下工藝步驟A、將斜面菌種經(jīng)擴大培養(yǎng)制成種子液；B、將A步驟中制備的種子液按種子液發(fā)酵培養(yǎng)基按2-5％的比例接種于發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵，其中發(fā)酵培養(yǎng)基包括下列組分(g/L)甘油3-8g/L，胰蛋白胨4-10g/L，酵母粉2-6g/L，KH2PO44-10g/L，K2HPO46-12g/L，(NH4)2SO41-4g/L，MgCl20.5-2g/L，微量元素1ml/L；
培養(yǎng)溫度為28-32℃，培養(yǎng)15-20小時后誘導，誘導溫度為41-43℃，誘導時間4-6小時；升溫誘導之前，將菌體的平均比生長速率控制在0.2～0.4；發(fā)酵過程中細菌增殖階段的pH值控制在6.9-7.1，在目的基因表達階段的pH值為7.1-7.3，通氣量為0.5～1.5VVM，發(fā)酵過程的溶解氧濃度為15％-50％，并進行補料，控制補料速率與菌體的消耗速率相當，使發(fā)酵液中的甘油濃度維持在1.0～3.0g/L；發(fā)酵液經(jīng)離心(3500-5000rpm，4-10℃，15-20分鐘)收集菌體，發(fā)酵周期為19-26小時；C、純化(1)包涵體的提取將B步驟中收集的菌體按1∶5-10的比例用緩沖液(150-250mM NaC1，10-50mM Tris-HC1，1mM EDTA-Na2，PH7.5-9.0)重懸，冰水浴，用均質機以600-700bar壓力勻漿，離心，收集沉淀(包涵體)；用緩沖液(2M尿素，150-250mM NaCl，10-50mM Tris-HCl，1mM EDTA-Na2，PH7.5-9.0)洗滌包涵體1-2次，使其SDS-PAGE純度達到60％以上；將包涵體按1∶20-40的比例加入裂解液，室溫攪拌5-8小時，離心(8000-11000rpm，4-25℃，15-30分鐘)，棄沉淀，取上清；(2)融合蛋白提取用Sepharose 6FF(GE Healthcare)疏水層析提取融合蛋白，將(1)步驟中的上清液直接上樣或用2.2M(NH4)2SO4，10-50mMTris-HCl，PH8.0-9.0稀釋一倍后上樣，以2M尿素，0.4M(NH4)2SO4，10-50mMTris-HCl，PH8.0-9.0洗脫，280nm紫外檢測，收集目標峰(第一峰)；(3)rhANP初步純化將步驟(2)中的疏水層析收集物用緩沖液(10-50mMTris-HC1，150-250mM NaCl，PH8.0-9.0)稀釋，按每毫克融合蛋白用1-5單位凝血酶的用量加入凝血酶，于28-35℃反應4-10小時；以0.1M乙酸-乙酸胺，150-250mM NaCl，0-25％乙腈為流動相，用Superdex 30pg(GE Heal thcare)分離，收集目標峰；(4)rhANP精細純化采用高效液相色譜柱，流動相A為6％乙腈，0.05％-0.1％TFA(三氟乙酸)，流動相B為30％乙腈，0.05％-0.1％TFA(三氟乙酸)，進行洗脫；收集目標峰，去除乙腈和TFA，即為純化的rhANP；
發(fā)酵菌種選用大腸桿菌遺傳工程菌株(pCW112-ANP/DH5α)。
本發(fā)明各工藝步驟中具體的工藝條件和工藝參數(shù)是B步驟中所述的微量元素由下列成份組成FeSO4·7H2O 1-3g/L，CoCl2·6H2O2-4g/L，MnCl2·4H2O 1-3g/L，CuSO43-8g/L，ZnSO41-4g/L，EDTA 2-5g/L，H3BO33-6g/L，Na2MoO4·2H2O 1.5-5g/L。
A步驟中所述的將斜面菌種經(jīng)二級擴大培養(yǎng)制備成種子液，其中第一級擴大培養(yǎng)中發(fā)酵培養(yǎng)基組成為胰蛋白胨6-15g/L，酵母粉3-8g/L，氯化鈉4-6g/L，氨芐青霉素50-200mg/L；接種量1-2％，培養(yǎng)溫度為28-32℃，培養(yǎng)周期為6-10小時。
所述的第二級擴大培養(yǎng)中培養(yǎng)基選用甘油培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基由下列成份組成胰蛋白胨12-18g/L，酵母粉8-15g/L，氯化鈉5g/L，甘油5-10g/L；接種量1-2％，培養(yǎng)溫度28-32℃，培養(yǎng)周期12-18小時。
B步驟中所述的補料方式采用對數(shù)流加方式，補料培養(yǎng)基由下列成份組成甘油100-500g/L，酵母粉20-60g/L，胰蛋白胨20-50g/L，(NH4)2SO410-50g/L，MgSO48-20g/L。
所述的步驟(4)中高效液相色譜柱為C18，洗脫方法為梯度洗脫。
所述的步驟(4)中采用旋轉蒸發(fā)或冷凍干燥的方法去除乙腈和TFA。
步驟(1)中所述的裂解液為8M尿素，50m MTris，PH8.3。
斜面菌種的培養(yǎng)基為3ml LB/Amp。
所述的步驟(1)中的壓力勻漿為2遍。
本發(fā)明所取得的技術進步在于本發(fā)明提供了一種可大規(guī)模制備重組人心鈉肽(rhANP)的方法，該方法成本低，原料與菌種易得，操作簡單，且生產(chǎn)條件易于控制，重復性好，所制備的產(chǎn)物可有效的適于制藥領域的應用。
具體實施例方式
以下結合實施例對本發(fā)明做進一步描述。
本實施例的制備方法包括如下工藝步驟
A、將斜面菌種經(jīng)擴大培養(yǎng)制成種子液將-70℃保存的生產(chǎn)甘油菌種按1％的比例接種于試管中(3ml LB/Amp+培養(yǎng)基)，在30℃、300rpm、培養(yǎng)周期為15小時的培養(yǎng)條件下制成斜面菌種；再按1％的比例接種于小三角瓶中(20ml LB/Amp+培養(yǎng)基)，30℃、300rpm培養(yǎng)8小時；再按1％的比例接種于大三角瓶中(1500ml 2-YT/Amp+培養(yǎng)基)，30℃、300rpm培養(yǎng)15小時。
B、發(fā)酵將上述種子液按3％的比例接種到30L發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為甘油5g/L，胰蛋白胨7g/L，酵母粉3g/L，KH2PO47g/L，K2HPO49g/L，(NH4)2SO42g/L，MgCl21.5g/L，微量元素1ml/L；微量元素為FeSO4·7H2O 2g/L，CoCl2·6H2O 3g/L，MnCl2·4H2Og/L，CuSO46g/L，ZnSO43g/L，EDTA 4g/L，H3BO35g/L，Na2MoO4·2H2O 2.5g/L。
發(fā)酵條件為28-32℃培養(yǎng)15小時；41-43℃誘導5小時；細菌增長階段PH7.0，目的基因表達階段PH7.2；溶解氧18％；攪拌速度600rpm；培養(yǎng)5小時后開始補料，補料速度2000ml/hr。每隔1小時取樣測OD600。最終發(fā)酵液總體積為50L。發(fā)酵結束后離心收集菌體，得菌體3450g。經(jīng)SDS-PAGE分析，目標蛋白表達率達30％。
C、純化(1)包涵體的提取稱取B步驟中收集的菌體1000g，用10L緩沖液(250mM NaCl，10mMTris-HCl，1mM EDTA-Na2，PH7.8)懸浮，冰水浴，用均質機以650bar壓力勻漿2遍，10000rpm離心，15分鐘，棄上清，收集沉淀(包涵體)；用5L緩沖液(2M尿素，250mM NaCl，10mM Tris-HCl，1mM EDTA-Na2，PH7.8)洗滌包涵體1次，使其SDS-PAGE純度達到60％以上；將上述包涵體用9.7L裂解液(8M尿素，50mM Tris，PH8.3)，室溫攪拌6小時，用6N鹽酸調PH至8.0；11000rpm離心，25℃，30分鐘。棄沉淀，取上清，即得包涵體裂解液。
(2)融合蛋白提取用Sepharose 6FF(GE Heal thcare)疏水層析提取融合蛋白，將(1)步驟中的上清液用緩沖液[2.2M(NH4)2SO4，50mM Tris-HCl，PH8.0]對倍稀釋后上樣，流速25ml/min；以2M尿素，0.4M(NH4)2SO4，50mM Tris-HCl，PH8.0洗脫，280nm紫外檢測，收集目標峰(第一峰)；層析柱經(jīng)再生后再次上樣。收集的產(chǎn)物共含蛋白質16740mg；用SDS-PAGE分析，純度85％左右，分子量與理論值一致。
(3)rhANP初步純化將步驟(2)中的疏水層析收集物用緩沖液(50mM Tris-HCl，150mM NaCl，PH8.0)稀釋，按每毫克融合蛋白用1-5單位凝血酶的用量加入凝血酶17000單位，于32℃反應8小時，調節(jié)PH至5.0終止反應。經(jīng)SDS-PAGE分析，酶切效率很高，達到90％以上。將上述酶切液經(jīng)Superdex 30pg柱(XK50/100)將大分子蛋白與rhANP分離，以0.1M乙酸-乙酸胺，18mM NaCl，15％乙腈為流動相，收集目標峰(第2峰，即小分子峰)；等目標峰出現(xiàn)后，不需將柱再生，可直接再次上樣，單次層析時間110分鐘左右。收集產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析為單一條帶，分子量3K。本步驟可連續(xù)進行。
(4)rhANP精細純化采用C18高效液相色譜柱(WTARES PREPLC4000，WTARES C18柱，25mm*100mm*3)，流動相A為6％乙腈，0.1％TFA(三氟乙酸)，流動相B為30％乙腈，0.1％TFA(三氟乙酸)，進行線性梯度洗脫；收集目標峰，去除乙腈和TFA，即為純化的rhANP。
發(fā)酵菌種選用大腸桿菌遺傳工程菌株(pCW112-ANP/DH5α)。
采用上述方法得到的rhANP，經(jīng)SDS-PAGE分析，分子量為3K，與標準品一致，其純度為單一條帶；rp-HPLC的分析結果，與標準品完全一致；肽圖、紫外光譜與標準品一致；毛細管電泳測定的等電點，與標準品相同，PI＞10；氨基酸組成、氨基酸序列、二硫鍵位置與標準品一致，并和理論值相同。
權利要求
1.利用高密度發(fā)酵制備重組人心鈉肽(rhANP)的方法，其特征在于該方法包括如下工藝步驟A、將斜面菌種經(jīng)擴大培養(yǎng)制成種子液；B、將A步驟中制備的種子液按種子液發(fā)酵培養(yǎng)基按2-5％的比例接種于發(fā)酵培養(yǎng)基進行發(fā)酵，其中發(fā)酵培養(yǎng)基包括下列組分(g/L)甘 油3-8g/L，胰蛋白胨4-10g/L，酵母粉2-6g/L，KH2PO44-10g/L，K2HPO46-12g/L，(NH4)2SO41-4g/L，MgCl20.5-2g/L，微量元素1ml/L；培養(yǎng)溫度為28-32℃，培養(yǎng)15-20小時后誘導，誘導溫度為41-43℃，誘導時間4-6小時；升溫誘導之前，將菌體的平均比生長速率控制在0.2～0.4；發(fā)酵過程中細菌增殖階段的pH值控制在6.9-7.1，在目的基因表達階段的pH值為7.1-7.3，通氣量為0.5～1.5VVM，發(fā)酵過程的溶解氧濃度為15％-50％，并進行補料，控制補料速率與菌體的消耗速率相當，使發(fā)酵液中的甘油濃度維持在1.0～3.0g/L；發(fā)酵液經(jīng)離心(3500-5000rpm，4-10℃，15-20分鐘)收集菌體，發(fā)酵周期為19-26小時；C、純化(1)包涵體的提取將B步驟中收集的菌體按1∶5-10的比例用緩沖液(150-250mM NaCl，10-50mM Tris-HCl，1mM EDTA-Na2，PH7.5-9.0)重懸，冰水浴，用均質機以600-700bar壓力勻漿，離心，收集沉淀(包涵體)；用緩沖液(2M尿素，150-250mM NaCl，10-50mM Tris-HCl，1mM EDTA-Na2，PH7.5-9.0)洗滌包涵體1-2次，使其SDS-PAGE純度達到60％以上；將包涵體按1∶20-40的比例加入裂解液，室溫攪拌5-8小時，離心(8000-11000rpm，4-25℃，15-30分鐘)，棄沉淀，取上清；(2)融合蛋白提取用Sepharose 6FF(GE Healthcare)疏水層析提取融合蛋白，將(1)步驟中的上清液直接上樣或用2.2M(NH4)2SO4，10-50mMTris-HCl，PH8.0-9.0稀釋一倍后上樣，以2M尿素，0.4M(NH4)2SO4，10-50mMTris-HCl，PH8.0-9.0洗脫，280nm紫外檢測，收集目標峰(第一峰)；(3)rhANP初步純化將步驟(2)中的疏水層析收集物用緩沖液(10-50mMTris-HCl，150-250mM NaCl，PH8.0-9.0)稀釋，按每毫克融合蛋白用1-5單位凝血酶的用量加入凝血酶，于28-35℃反應4-10小時；以0.1M乙酸-乙酸胺，150-250mM NaCl，0-25％乙腈為流動相，用Superdex 30pg(GE Healthcare)分離，收集目標峰；(4)rhANP精細純化采用高效液相色譜柱，流動相A為6％乙腈，0.05％-0.1％TFA(三氟乙酸)，流動相B為30％乙腈，0.05％-0.1％TFA(三氟乙酸)，進行洗脫；收集目標峰，去除乙腈和TFA，即為純化的rhANP；發(fā)酵菌種選用大腸桿菌遺傳工程菌株(pCW112-ANP/DH5α)。
2.根據(jù)權利要求1所述的利用高密度發(fā)酵制備重組人心鈉肽(rhANP)的方法，其特征在于B步驟中所述的微量元素由下列成份組成FeSO4·7H2O1-3g/L，CoCl2·6H2O 2-4g/L，MnCl2·4H2O 1-3g/L，CuSO43-8g/L，ZnSO41-4g/L，EDTA 2-5g/L，H3BO33-6g/L，Na2MoO4·2H2O 1.5-5g/L。
3.根據(jù)權利要求1所述的利用高密度發(fā)酵制備重組人心鈉肽(rhANP)的方法，其特征在于A步驟中所述的將斜面菌種經(jīng)二級擴大培養(yǎng)制備成種子液，其中第一級擴大培養(yǎng)中發(fā)酵培養(yǎng)基組成為胰蛋白胨6-15g/L，酵母粉3-8g/L，氯化鈉4-6g/L，氨芐青霉素50-200mg/L；接種量1-2％，培養(yǎng)溫度為28-32℃，培養(yǎng)周期為6-10小時。
4.根據(jù)權利要求3所述的利用高密度發(fā)酵制備重組人心鈉肽(rhANP)的方法，其特征在于所述的第二級擴大培養(yǎng)中培養(yǎng)基選用甘油培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基由下列成份組成胰蛋白胨12-18g/L，酵母粉8-15g/L，氯化鈉5g/L，甘油5-10g/L；接種量1-2％，培養(yǎng)溫度28-32℃，培養(yǎng)周期12-18小時。
5.根據(jù)權利要求1所述的利用高密度發(fā)酵制備重組人心鈉肽(rhANP)的方法，其特征在于B步驟中所述的補料方式為對數(shù)流加方式，補料培養(yǎng)基由下列成份組成甘油100-500g/L，酵母粉20-60g/L，胰蛋白胨20-50g/L，(NH4)2SO410-50g/L，MgSO48-20g/L。
6.根據(jù)權利要求1所述的利用高密度發(fā)酵制備重組人心鈉肽(rhANP)的方法，其特征在于所述的步驟(4)中高效液相色譜柱為C18，洗脫方法為梯度洗脫。
7.根據(jù)權利要求1所述的利用高密度發(fā)酵制備重組人心鈉肽(rhANP)的方法，其特征在于所述的步驟(4)中采用旋轉蒸發(fā)或冷凍干燥的方法去除乙腈和TFA。
8.根據(jù)權利要求1所述的利用高密度發(fā)酵制備重組人心鈉肽(rhANP)的方法，其特征在于步驟(1)中所述的裂解液為8M尿素，50mM Tris，PH8.3。
9.根據(jù)權利要求1所述的利用高密度發(fā)酵制備重組人心鈉肽(rhANP)的方法，其特征在于斜面菌種的培養(yǎng)基為3ml LB/Amp。
10.根據(jù)權利要求1所述的利用高密度發(fā)酵制備重組人心鈉肽(rhANP)的方法，其特征在于步驟(1)中所述的壓力勻漿為2遍。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物發(fā)酵技術領域，特別是利用高密度發(fā)酵制備重組人心鈉肽(rhANP)的方法。本發(fā)明利用大腸桿菌遺傳工程菌株(pCW112－ANP/DH5α)經(jīng)過斜面菌種、擴大培養(yǎng)制備種子液、高密度發(fā)酵、分離純化等工藝步驟制備純化的重組人心鈉肽(rhANP)。本發(fā)明解決了ANP的表達和純化比較困難，因而限制了ANP的產(chǎn)業(yè)化應用的問題，具有成本低、原料與菌種易得、操作簡單，且生產(chǎn)條件易于控制、重復性好的優(yōu)點，所制備的產(chǎn)物可有效的適于制藥領域的應用。
文檔編號C12P21/02GK1687443SQ20051001242
公開日2005年10月26日 申請日期2005年3月25日 優(yōu)先權日2005年3月25日
發(fā)明者林楓, 于志江, 王玉樹, 周兆平, 章剛, 陳旭, 梁四五, 姚小建, 駱曉棟, 歐陽藩 申請人:深圳國家生化工程技術開發(fā)中心