專利名稱：一種重組人干擾素α2b的高密度發(fā)酵培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體的涉及一種重組人干擾素ot2b的髙密度 發(fā)酵培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
目前工業(yè)生產(chǎn)中使用最多的工程菌為大腸桿菌。利用大腸桿菌生產(chǎn)蛋白 質(zhì)的基本過(guò)程是先將目的基因插入到合適的質(zhì)粒中，再將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿 菌中，培養(yǎng)大腸桿菌，將目的蛋白從大腸桿菌中提取出來(lái)。其中大腸桿菌的培 養(yǎng)暨工程菌的髙密度發(fā)酵至關(guān)重要，它直接決定獲得目的蛋白的多少。釆用高 密度培養(yǎng)技術(shù)(High cell-density culture, HCDC)，也就是高密度發(fā)酵技術(shù)， 提高菌體的發(fā)酵密度，最終提高產(chǎn)物的比生產(chǎn)率(單位體積單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物的 產(chǎn)量)不僅可減少培養(yǎng)體積、強(qiáng)化下游分離提取，還可以縮短生產(chǎn)周期、減少 設(shè)備投資從而降低生產(chǎn)成本，能極大地提高在巿場(chǎng)上的竟?fàn)幜Α?br> 這一目的的實(shí)現(xiàn)，除了重組菌本身的表達(dá)性質(zhì)外，還必須賦予重組菌生長(zhǎng) 和產(chǎn)物表達(dá)的最適培養(yǎng)基組成等。目前生產(chǎn)重組人干擾素oc 2b的髙密度發(fā)酵 培養(yǎng)基大多采用葡萄糖為碳源，在培養(yǎng)過(guò)程中極易產(chǎn)生乙酸，而生產(chǎn)重組人 干擾素ct2b的髙密度發(fā)酵培養(yǎng)基中釆用復(fù)合碳源(甘油+葡萄糖)加入某些 氨基酸(甘氨酸、甲硫氨酸)以及某些合適濃度的微量元素(VB^ MgS04.7H20 、 FeS04-7H,0 、 MnS04 CaCh)做為乙酸抑制劑尚未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
(一) 要解決的技術(shù)問(wèn)趙
本發(fā)明的目的是提供一種重組人干擾素oc2b的髙密度發(fā)酵培養(yǎng)基。
(二) 技術(shù)方案
本發(fā)明提供了一種重組人干擾素cx2b的高密度發(fā)酵培養(yǎng)基，其組分為 蛋白胨5~20g/L，酵母者l 10g/L，葡萄糖0.01°/^5%，甘油0.5一％，Na2HP04 10 30g/L， NaH2P04 l~8g/L ， KH2 P04 4~8g/L， NaCl 2~7g /L， FeS04.7H20 0.08~0.01g/L， MgS04.7H20 0.01~2g/L, CaCl20.001~0.01g/L， VBi 0.1 0.01g/L， MnS04 0.1 ~0.01 g/L，甘氨酸0.1 2g/L,甲硫氨酸O.l ~0.01 g/L。
本發(fā)明所述的高密度發(fā)酵培養(yǎng)基的配制方法，它包括如下步驟
(1) 按上述配方稱取規(guī)定重量的組分；
(2) 在規(guī)定數(shù)量的純化水溶液中溶解；
(3) 用氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至5.0-8.0;
(4) 在相應(yīng)容積的發(fā)酵罐內(nèi)滅菌。
本發(fā)明所采用的發(fā)酵罐是W14900瑞士比歐公司生產(chǎn)的450L全自動(dòng)發(fā)酵 罐。所釆用的試劑均為普通化學(xué)試劑公司購(gòu)買(mǎi)。乙酸濃度釆用離子色譜(美 國(guó)D i one x公司I C S 1 5 0 0離子色譜儀，I o n p a c A S 1 1 H C 4 x 2 5 0 mm陰離子分析柱和IonpacAGll HC4x50 mm保護(hù)柱，電導(dǎo)檢測(cè)器檢測(cè))檢測(cè)。目的蛋白測(cè)定釆用SDS-PAGE法，釆 用瑞典安發(fā)瑪西亞公司MINIVE電泳儀。 (三)有益效果
釆用本發(fā)明所述的培養(yǎng)基，重組大腸桿菌可以在發(fā)酵過(guò)程中避免或減少 乙酸的生成，從而減輕了乙酸的抑制作用，實(shí)現(xiàn)重組大腸桿菌高密度生長(zhǎng)，， 提高重組人干擾素cc2b蛋白的產(chǎn)率。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例l重組人干擾素a2b的高密度發(fā)酵
配方1:蛋白胨6g / L,酵母膏2g / L，葡萄糖0. 02%,甘油0. 6 % , Na 2線 llg/L, NaH2P04 lg/L ， KH2 P04 4g/L， NaCl 2g/L， FeS04. 7H20 0. 01g/L， MgS04.7H20 0. 02g/L， CaCl2 0. OOlg/L, ， VB^ 0. 01g/L， MnS04 0. 01 g/L、 甘氨酸0.2 g/L、甲硫氨酸O. 01 g /L。本發(fā)明所述的重組人干擾素oc2b的高密度發(fā)酵培養(yǎng)基配制方法包括如下 步驟
(1) 按上述配方稱取100L的組分；
(2) 在規(guī)定數(shù)量的純化水溶液中溶解；
(3) 用氫氧化鈉溶液調(diào)PH值至7. 0;
(4) 在相應(yīng)容積的發(fā)酵罐內(nèi)滅菌(urc, 30分鐘)。
(5) 在接入合適的重組大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，獲得含重組人干擾素o^b的菌 體1762g，經(jīng)檢測(cè)菌體目的蛋白(重組人干擾素oc21))表達(dá)量33.41%。
實(shí)施例2:重組人干擾素oc2b的高密度發(fā)酵
配方2:蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L,葡萄糖0.5%,甘油1%, Na肌 15g/L, NaH2P04 4g/L ， KH2 P04 6g/L, NaCl 3g/L， FeSO" 7H20 0. 5g/L， MgS04. 7H20 0. 5g/L， CaCl2 0. 02g/L， ， VB! 0. 03g/L， MnS04 0.05 g/L、甘 氨酸0. 5 g/L、甲硫氨酸0. 06 g/L。
本發(fā)明所述的重組人干擾素a2b的高密度發(fā)酵培養(yǎng)基配制方法包括如下
(1) 按上述配方稱取100L的組分；
(2) 在規(guī)定數(shù)量的純化水溶液中溶解；
(3) 用氫氧化鈉溶液調(diào)PH值至7.0;
(4) 在相應(yīng)容積的發(fā)酵罐內(nèi)滅菌(12rC， 30分鐘)。
(5) 在接入合適的重組大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，獲得含重組人干擾素ct2b的菌 體1863g，經(jīng)檢測(cè)菌體目的蛋白(重組人干擾素a2b)表達(dá)量37.2%。
實(shí)施例3:重組人干擾素a2b的高密度發(fā)酵
配方3:蛋白胨18g/L,酵母膏8g/L，葡萄糖2%，甘油4%， Na 2HP04 27g/L， NaH2P04 7. 5g/L ， KH2 P04 6. 5g / L， NaC16. 5g / L, FeS04. 7H20 0. 08g/L, MgS04. 7H20 1. 2g/L, CaCl2 0. 01g/L， ， VB! 0.1 g/L, MnS04 0.1 g g/L、甘 氨酸l. 2 g/L、甲硫氨酸O. 1 g g/L。
本發(fā)明所述的重組人干擾素oc2b的高密度發(fā)酵培養(yǎng)基配制方法包括如下步驟
(1) 按上述配方稱取100L的組分；
(2) 在規(guī)定數(shù)量的純化水溶液中溶解； (3 )用氫氧化鈉溶液調(diào)PH值至7. 0;
(4) 在相應(yīng)容積的發(fā)酵罐內(nèi)滅菌(121°C， 30分鐘)。
(5) 在接入合適的重組大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，獲得含重組人干擾素oc2b的 菌體1547g，經(jīng)檢測(cè)菌體目的蛋白(重組人干擾素oc 2b )表達(dá)量32. 16%。
實(shí)施例4對(duì)照實(shí)驗(yàn)
配方4:蛋白胨10g/L，酵母膏4g/L，葡萄糖2%， NaC15g/L， 本發(fā)明所述的重組人干擾素a 2b的高密度發(fā)酵培養(yǎng)基配制方法包括如下
(1) 按上述配方稱取100L的組分；
(2) 在規(guī)定數(shù)量的純化水溶液中溶解；
(3) 用氫氧化鈉溶液調(diào)PH值至7. 0;
(4) 在相應(yīng)容積的發(fā)酵罐內(nèi)滅菌(12rC, 30分鐘)。
(5) 在接入合適的重組大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，獲得含重組人干擾素oc2b的 菌體1021g,經(jīng)檢測(cè)菌體目的蛋白(重組人干擾素ot 2b )表達(dá)量25. 14%。
權(quán)利要求
1、一種重組人干擾素α2b的高密度發(fā)酵培養(yǎng)基，其組分為蛋白胨5～20g/L，酵母膏1～10g/L，葡萄糖0.01％～5％，甘油0.5～4％，Na2HPO4 10～30g/L，NaH2PO4 1～8g/L，KH2PO4 4～8g/L，NaCl 2～7g/L，F(xiàn)eSO4.7H2O 0.08～0.01g/L，MgSO4.7H2O 0.01～2g/L，CaCl2 0.001～0.01g/L，VB1 0.1～0.01g/L，MnSO4 0.1～0.01g/L，甘氨酸0.1～2g/L，甲硫氨酸0.1～0.01g/L。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的高密度發(fā)酵培養(yǎng)基的配制方法，它包括如下步驟(1) 按上述配方稱取規(guī)定重量的組分；(2) 在規(guī)定數(shù)量的純化水溶液中溶解；(3 )用氫氧化鈉溶液調(diào)pH值至5.0-8.0; (4)在相應(yīng)容積的發(fā)酵罐內(nèi)滅菌。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種重組人干擾素α2b的高密度發(fā)酵培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基在生產(chǎn)過(guò)程中可以有效減少乙酸的產(chǎn)生量，降低乙酸的抑制作用，提高了重組菌的生長(zhǎng)速率和重組蛋白的產(chǎn)率。
文檔編號(hào)C12P21/02GK101591691SQ200810113710
公開(kāi)日2009年12月2日 申請(qǐng)日期2008年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月29日
發(fā)明者春 吉, 周德勝, 張春麗 申請(qǐng)人:北京凱因科技股份有限公司