專利名稱：：重組耐高溫超氧化物岐化酶的高密度發(fā)酵與純化工藝的制作方法
技術(shù)領域：
：本發(fā)明涉及的是一種重組耐高溫超氧化物岐化酶的工程菌構(gòu)建方法及高密度發(fā)酵和純化工藝，屬于基因工程制藥
技術(shù)領域：
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背景技術(shù)：
：超氧化物岐化酶(SuperoxideDismutase,以下簡稱SOD)是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的金屬酶；根據(jù)其所結(jié)合金屬離子的不同依次命名為Cu/Zn-SOD，Mn-SOD,Fe-SOD和Ni-SOD。SOD是氧自由基的高效清除劑，同時具有抗腫瘤，抗疲勞，抗病及抗衰老等作用；該酶在食品、化妝品和醫(yī)藥等領域中都有重要應用。目前，主要是通過從動物血液或植物組織中提取的方法獲得SOD，因此SOD的產(chǎn)量在很大程度上受原材料的限制。許多研究者也曾對通過基因工程方法生產(chǎn)SOD進行了很多的探索，但現(xiàn)有方法仍存在如下問題1)重組表達的SOD多是以無活性的包涵體形式存在，必須在純化過程中增加變性和復性等步驟，因此，難以保證SOD的收率；2)所產(chǎn)SOD存在著活力低，熱耐受性差，容易失活等問題，需要進行化學修飾后才能使用；3)重組表達量比較低，一般在20-40%的水平。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對國內(nèi)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，而提供一種能表達耐熱超氧化物岐化酶的工程菌構(gòu)建方法及高密度發(fā)酵和純化工藝。本發(fā)明所述的超氧化物岐化酶的工程菌構(gòu)建方法，它包括以嗜熱菌中編碼SOD的基因為模板，設計帶有限制性酶切位點的特異引物擴增目的基因，經(jīng)雙酶切后連接于經(jīng)相同酶切處理后的質(zhì)粒載體/ET28a中，構(gòu)建重組質(zhì)粒，命名為^SOD。然后經(jīng)化學轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒pSOD轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)篩選，獲得高產(chǎn)SOD的菌株，完成SOD工程菌的構(gòu)建。所述的克隆載體和表達載體用的是同一種質(zhì)粒-^ET28a;用BL21(DE3)作為表達菌株。本發(fā)明克隆了一種嗜熱菌的SOD基因序列，并且成功構(gòu)建了高效表達菌株。本發(fā)明涉及的SOD工程菌的構(gòu)建及其表達方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(l)克隆獲得的SOD基因包含了SOD的整個結(jié)構(gòu)基因。(2)構(gòu)建得到的SOD工程菌表達產(chǎn)生的SOD具有良好熱穩(wěn)定性與耐熱性。(3)表達產(chǎn)物占全菌蛋白的60%以上，且全部為可溶性蛋白，避免了包含體復性過程的種種麻煩。本發(fā)明所述的超氧化物岐化酶工程菌的高密度發(fā)酵工藝發(fā)酵過程經(jīng)過一級種子培養(yǎng)、二級種子培養(yǎng)、上罐發(fā)酵、誘導表達四個步驟，最終獲得發(fā)酵產(chǎn)物-SOD。本發(fā)酵方法可以實現(xiàn)SOD的高效表達，目的蛋白的表達量占菌體蛋白總量的60%以上。作為本發(fā)明的一種改進發(fā)酵基本培養(yǎng)基按照如下表1進行配制；表1高密度發(fā)酵基本培養(yǎng)基<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>作為本發(fā)明的一種改進發(fā)酵用補料培養(yǎng)基按照如下表2進行配制，補料間隔為4-5h。表2高密度發(fā)酵補料培養(yǎng)基<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>作為本發(fā)明的一種改進發(fā)酵條件為溶氧30%、溫度30。C、pH7.0、轉(zhuǎn)速在200rpm到800rpm之間根據(jù)溶氧自動調(diào)節(jié)。作為本發(fā)明的一種改進發(fā)酵進行5-6小時，OD600為25-28時加入誘導劑IPTG，使其終濃度為0.5mM。本發(fā)明所述的高密度發(fā)酵產(chǎn)物——超氧化物岐化酶的分離純化工藝它包括收集發(fā)酵產(chǎn)物，經(jīng)ATS高壓勻漿機將細胞破碎，使胞內(nèi)酶完全釋放出來得到粗酶液；然后將粗酶液經(jīng)80。C水浴2-3小時，離心后上清為初分級產(chǎn)物；將初分級產(chǎn)物在70-80%的乙醇中沉淀，沉淀經(jīng)干燥、重溶解、透析、濃縮、干燥后得到SOD純品。作為本發(fā)明的一種改進發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)ATS高壓勻漿機破碎的工作壓力為750-800bar;作為本發(fā)明的一種改進熱純化的條件是80°C水浴2-3小時；作為本發(fā)明的一種改進SOD在乙醇中沉淀的乙醇終濃度為70%~80%;本發(fā)明涉及的SOD發(fā)酵產(chǎn)物的分離純化工藝具有以下優(yōu)點(1)整個過程采用物理方法，避免了化學試劑的污染；(2)純化工藝簡單，產(chǎn)率高，成本低廉；(3)終產(chǎn)物SOD的純度高、活力高、耐熱性強、半衰期長。本發(fā)明是一種關(guān)于超氧化物岐化酶(SOD)表達菌株的構(gòu)建、高密度發(fā)酵以及分離純化的工藝方法。我們克隆了嗜熱菌的SOD序列，構(gòu)建出表達耐熱SOD的質(zhì)粒pSOD，并且利用工程菌將其表達，得到耐熱SOD蛋白。之后，通過對其高密度發(fā)酵條件的研究，建立起高密度發(fā)酵SOD的工藝流程。發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)過高壓破碎一熱純化一乙醇沉淀一透析等方法得到高純度、高活力、高穩(wěn)定性的SOD。本發(fā)明構(gòu)建的SOD工程菌能夠進行高效表達，表達量可占菌體蛋白的60%以上。并且具有極高的耐熱性，能夠耐90'C高溫而不喪失活力。純化后的SOD可以達到電泳純級別，比活力達6000~9000U每毫克蛋白。圖1是表達菌株搖瓶誘導后總蛋白在12.5%SDS-PAGE電泳圖譜；圖2是表達菌株高密度發(fā)酵后菌體總蛋白在12.5%SDS-PAGE電泳圖譜圖3是SOD純化后12.5%SDS-PAGE電泳圖譜；具體實施方式本發(fā)明所述的超氧化物岐化酶的工程菌構(gòu)建方法，它包括以嗜熱菌的SOD基因為模板，設計帶有限制性酶切位點的特異引物擴增目的基因，經(jīng)雙酶切后連接于經(jīng)相同酶切處理后的質(zhì)粒載體；ET28a中，構(gòu)建重組質(zhì)粒，命名為pSOD。然后經(jīng)化學轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒pSOD轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)篩選，獲得高產(chǎn)SOD的菌株，完成SOD工程菌的構(gòu)建。作為本發(fā)明的一種改進克隆載體和表達載體用的是同一種質(zhì)粒-;7ET28a;作為本發(fā)明的一種改進用BL21(DE3)作為表達菌株。本發(fā)明所述的超氧化物岐化酶工程菌的高密度發(fā)酵工藝發(fā)酵過程經(jīng)過一級種子培養(yǎng)、二級種子培養(yǎng)、上罐發(fā)酵、誘導表達四個步驟，最終獲得發(fā)酵產(chǎn)物-SOD。本發(fā)酵方法可以實現(xiàn)SOD的高效表達，目的蛋白的表達量占菌體蛋白總量的60%以上。作為本發(fā)明的一種改進發(fā)酵基本培養(yǎng)基按照如下表3進行配制；表3髙密度發(fā)酵基本培養(yǎng)基營養(yǎng)終濃度胰蛋白胨10g/L酵母提取物10g/LNaCl10g/L葡萄糖20g/LK2HP042g/LMgS04.7H200.25g/L(NH4)2S045g/LKana50mg/L作為本發(fā)明的一種改進發(fā)酵用補料培養(yǎng)基按照如下表4進行配制，補料間隔為4-5h。表4高密度發(fā)酵補料培養(yǎng)基成份補料量補料頻率葡萄糖80g5h(NH4)2S0420g5hK2HP048g5h作為本發(fā)明的一種改進發(fā)酵條件為溶氧30%、溫度30°C、pH7.0、轉(zhuǎn)速在200rpm到800rpm之間根據(jù)溶氧自動調(diào)節(jié)。作為本發(fā)明的一種改進發(fā)酵進行5-6小時，OD600為25-28時加入誘導劑IPTG，使其終濃度為0.5mM。本發(fā)明所述的高密度發(fā)酵產(chǎn)物——超氧化物岐化酶的分離純化工藝它包括收集發(fā)酵產(chǎn)物，經(jīng)ATS高壓勻漿機將細胞破碎，使胞內(nèi)酶完全釋放出來得到粗酶液；然后將粗酶液經(jīng)80。C水浴2小時，離心后上清為初分級產(chǎn)物；將初分級產(chǎn)物在60%的乙醇中沉淀，沉淀經(jīng)干燥、重溶解、透析、濃縮、干燥后得到SOD純品。作為本發(fā)明的一種改進發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)ATS高壓勻漿機破碎的工作壓力為750-800bar;作為本發(fā)明的一種改進熱純化的條件是80°C水浴2-3小時；作為本發(fā)明的一種改進SOD在乙醇中沉淀的乙醇濃度為70-80%;以下通過實例對本發(fā)明作進一步的描述實施例l、SOD工程菌的構(gòu)建及誘導表達(1)PCR擴增耐熱SOD基因，經(jīng)雙酶切后連接于經(jīng)相同酶切處理后的質(zhì)粒載體pET28a中，構(gòu)建重組質(zhì)粒，命名為^SOD。然后經(jīng)化學轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒;SOD轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)篩選，獲得高產(chǎn)SOD的菌株，完成SOD工程菌的構(gòu)建。(2)LB培養(yǎng)基中加入卡那霉素至終濃度為30mg/L，接種SOD工程菌單菌落，37'C振蕩培養(yǎng)2小時，加入0.5mMIPTG，繼續(xù)在3(TC條件下培養(yǎng)8小時；(3)離心收集菌體并重懸于500ml裂解緩沖液中；裂解緩沖液10mMTris-HCl,pH8.0。(4)用超聲波細胞破碎儀進行細胞破碎，功率設定為400W，工作時間1.5S，間歇時間1.5S，工作總時間30min;離心(20000g，10min)后收集上清和沉淀，分別進行12.5%SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果見圖l。電泳結(jié)果表明，SOD工程菌誘導表達SOD最適宜條件如下先在37'C條件下培養(yǎng)2小時，加入0.5mmolIPTG后在3(TC條件下繼續(xù)培養(yǎng)8小時，外源蛋白SOD獲得高水平表達，目的蛋白占菌體總蛋白的60%以上，且全部以可溶性蛋白存在于細胞裂解液上清中。實施例2、SOD工程菌的髙密度發(fā)酵(1)發(fā)酵罐基本培養(yǎng)基成份按表2所示，補料成份按表3所示；(2)—級種子培養(yǎng)20mlLB液體培養(yǎng)基中接種甘油菌5ul，kana終濃度50mg/L，37°C，220ipm，培養(yǎng)10h;(3)二級種子培養(yǎng)將上一步培養(yǎng)好的菌液轉(zhuǎn)移至200mlLB液體培養(yǎng)基，kana終濃度50mg/L，37。C，220rpm，培養(yǎng)4h;(4)上罐發(fā)酵將上一步培養(yǎng)的200ml二級種子菌液接種到容積為6.6L的發(fā)酵罐中。發(fā)酵條件為溶氧30%、溫度30。C、pH7.0、轉(zhuǎn)速在200rpm到800rpm之間根據(jù)溶氧自動調(diào)節(jié)；(5)發(fā)酵進行5-6小時，OD600約為25-28時加入誘導劑IPTG，使其終濃度為0.5mM。發(fā)酵進行20h左右，待菌體不在產(chǎn)酸并且耗氧持續(xù)減少時停止發(fā)酵，離心收集菌體。實施例3:SOD工程菌髙密度發(fā)酵產(chǎn)物的電泳檢測菌體在300W超聲波下超聲破碎后，8000g離心20min，分別將菌體破碎之后的上清和沉淀進行12.5%的SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖2。圖中的標號說明分別為卜誘導前裂菌上清；2-誘導5小時裂菌上清；3-誘導10小時裂菌上清；4-誘導14小時裂菌上清；5-誘導前裂菌沉淀；6-誘導5小時裂菌沉淀；7-誘導10小時裂菌沉淀；8-誘導14小時裂菌沉淀;9-發(fā)酵液上清；10-Marker(14400-97000).結(jié)果顯示，誘導前無SOD目的蛋白產(chǎn)生，誘導之后SOD蛋白全部以可溶性蛋白的形式出現(xiàn)。實施例4:SOD工程菌收菌后的破碎及SOD的純化(1)將離心后的菌體，稱12g，溶于200mlBufferA(lOmMTris-HCl，pH8.0)，加溶菌酶至終濃度50mg/L，室溫震蕩30min;(2)ATS高壓勻漿機破碎，破碎壓力為800bar;(3)80°C水浴加熱2h;(4)待冷卻至室溫后12000g,4°C,離心30min;(5)收集上清，調(diào)pH二6.92;(6)緩緩加入4°<:預冷的95%的乙醇，并不斷攪拌V乙醉V齒上清-2:l;(7)4。C靜置30min后，12000g，4。C，離心30min;(8)棄上清，沉淀在40。C烘箱中烘干多余的乙醇；(9)用BufferA重溶解乙醇沉淀后透析過夜；(10)透析之后的產(chǎn)物分裝干燥、制成成品。(11)蛋白質(zhì)純度檢測12.5%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳對最終產(chǎn)品進行電泳分析，結(jié)果如圖3所示，本方法純化的SOD已達到電泳純的級別。實施例5:純化SOD的測活以Marklund的鄰苯三酚自氧化法測定純化蛋白的酶活力測活的工作Buffer為pH8.0的lOmM的Tris-HCl，底物為鄰苯三酚，定義在1ml體系內(nèi)SOD抑制鄰苯三酚自氧化速率達50%時所需的酶量為一個活力單位。結(jié)果表明，純化的SOD的最終比活力為6000~9000U/mg。10權(quán)利要求1.一種重組耐高溫超氧化物岐化酶的高密度發(fā)酵與純化工藝，它包括以嗜熱菌中編碼SOD的基因為模板，設計帶有限制性酶切位點的特異引物擴增目的基因，經(jīng)雙酶切后連接于經(jīng)相同酶切處理后的質(zhì)粒載體pET28a中，構(gòu)建重組質(zhì)粒，命名為pSOD，然后經(jīng)化學轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒pSOD轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)篩選，獲得高產(chǎn)SOD的菌株，完成SOD工程菌的構(gòu)建。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組耐高溫超氧化物岐化酶的高密度發(fā)酵與純化工藝，其特征在于所述的雙酶切位點是EcoRI和SalI。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組耐高溫超氧化物岐化酶的高密度發(fā)酵與純化工藝，其特征在于所述的克隆載體和表達載體用的是同一種質(zhì)粒-pET28a;用BL21(DE3)作為表達菌株。4、一種重組耐高溫超氧化物岐化酶的高密度發(fā)酵與純化工藝，該發(fā)酵工藝至少包括經(jīng)過一級種子培養(yǎng)、二級種子培養(yǎng)、上罐發(fā)酵、誘導表達四個步驟，最終獲得發(fā)酵產(chǎn)物-SOD，且該發(fā)酵工藝可以實現(xiàn)SOD的高效表達，使目的蛋白的表達量占菌體蛋白總量的60%以上。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組耐高溫超氧化物岐化酶的高密度發(fā)酵與純化工藝，其特征在于發(fā)酵基本培養(yǎng)基按照如下表5進行配制；發(fā)酵用補料培養(yǎng)基按照如下表6進行配制，補料間隔為4-5h。表5高密度發(fā)酵基本培養(yǎng)基<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>表6高密度發(fā)酵補料培養(yǎng)基<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>6、根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的重組耐高溫超氧化物岐化酶的高密度發(fā)酵與純化工藝，其特征在于所述的發(fā)酵條件為溶氧30%、溫度30°C、pH7.0、轉(zhuǎn)速在200rpm到800rpm之間根據(jù)溶氧自動調(diào)節(jié)。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組耐高溫超氧化物岐化酶的高密度發(fā)酵與純化工藝，其特征在于所述的發(fā)酵進行5-6小時，OD600為25-28時加入誘導劑IPTG，使其終濃度為0.5mM。8、一種重組耐高溫超氧化物岐化酶的高密度發(fā)酵與純化工藝，它包括收集發(fā)酵產(chǎn)物，經(jīng)ATS高壓勻漿機將細胞破碎，使胞內(nèi)酶完全釋放出來得到粗酶液；然后將粗酶液經(jīng)80°C水浴2小時，離心后上清為初分級產(chǎn)物；將初分級產(chǎn)物在60%的乙醇中沉淀，沉淀經(jīng)千燥、重溶解、透析、濃縮、干燥后得到SOD純品。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組耐高溫超氧化物岐化酶的高密度發(fā)酵與純化工藝，其特征在于所述的發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)ATS高壓勻漿機破碎的工作壓力為750-800bar;熱純化的條件是80°C水浴2小時；SOD在乙醇中沉淀的乙醇濃度為65%。全文摘要一種重組耐高溫超氧化物岐化酶的高密度發(fā)酵與純化工藝，所述的構(gòu)建方法包括以嗜熱菌中編碼SOD的基因為模板，設計帶有限制性酶切位點的特異引物擴增目的基因，經(jīng)雙酶切后連接于經(jīng)相同酶切處理后的質(zhì)粒載體pET28a中，構(gòu)建重組質(zhì)粒，命名為pSOD，然后經(jīng)化學轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒pSOD轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)篩選，獲得高產(chǎn)SOD的菌株，完成SOD工程菌的構(gòu)建；所述的發(fā)酵工藝發(fā)酵過程經(jīng)過一級種子培養(yǎng)、二級種子培養(yǎng)、上罐發(fā)酵、誘導表達四個步驟，最終獲得發(fā)酵產(chǎn)物——SOD；本發(fā)酵方法可以實現(xiàn)SOD的高效表達，目的蛋白的表達量占菌體蛋白總量的60％以上；它具有SOD有良好熱穩(wěn)定性與耐熱性，表達產(chǎn)物占全菌蛋白的60％以上，且全部為可溶性蛋白，避免了包含體復性過程的種種麻煩；純化工藝簡單，產(chǎn)率高，成本低廉，終產(chǎn)物SOD的純度高、活力高、穩(wěn)定性強等特點。文檔編號C12N15/53GK101275144SQ200810061168公開日2008年10月1日申請日期2008年3月13日優(yōu)先權(quán)日2008年3月13日發(fā)明者周海夢,勇夏,孟凡國,王天文,胡衛(wèi)江申請人:浙江清華長三角研究院;嘉興博泰生物科技發(fā)展有限公司