一種促重組畢赤酵母表達木聚糖酶的培養(yǎng)基及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于木聚糖酶制品生產技術領域，尤其是涉及一種促重組畢赤酵母表達木聚糖酶的培養(yǎng)基及其制備方法。
【背景技術】
[0002]巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)是最廣泛應用的重組蛋白生產菌之一。具有翻譯后修飾、遺傳操作相對簡單、消除了內毒素和噬菌體污染、表達水平高、產物可分泌和利用簡單無機鹽培養(yǎng)基就可進行高密度發(fā)酵等優(yōu)點。
[0003]木聚糖酶是常用的工業(yè)用酶之一，在醫(yī)藥、保健品、食品、飼料和新能源等領域都有重要應用。目前木聚糖酶主要由重組畢赤酵母進行表達生產。
[0004]目前實驗室常用的重組畢赤酵母誘導培養(yǎng)基主要是經典的BMMY培養(yǎng)基，但該培養(yǎng)基成分復雜、原料價格昂貴、培養(yǎng)過程不易控制及實驗重復性差，因此不適用于大規(guī)模工業(yè)化生產。當前重組畢赤酵母大規(guī)模工業(yè)化生產主要使用合成培養(yǎng)基。然而，目前重組畢赤酵母最常用的合成培養(yǎng)基一 BSM和FM22等一在初始pH高于5.5時易出現金屬沉淀，而大部分畢赤酵母重組蛋白的發(fā)酵過程中pH在5.5-7.0之間變化，所以BSM和FM22等培養(yǎng)基不利于重組酵母的生長與異源蛋白的表達。因此開發(fā)出成分簡單而又明確、成本低和不易出現金屬沉淀的合成培養(yǎng)基，用于木聚糖酶的表達與生產是推動該酶的產業(yè)化生產的重要條件。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種促重組畢赤酵母表達木聚糖酶的培養(yǎng)基及其制備方法，以解決現有重組畢赤酵母表達木聚糖酶的復合培養(yǎng)基成分復雜、原料價格昂貴、生產條件不易控制及合成培養(yǎng)基初始pH偏低易出現沉淀而影響細胞的生長和外源蛋白的表達等問題，本發(fā)明提供一種成分明確、高效、簡便、廉價和安全的，適于重組畢赤酵母表達木聚糖酶基礎研究和商業(yè)化生產的合成培養(yǎng)基，以及該培養(yǎng)基的制備方法。
[0006]本發(fā)明的技術方案是:一種促重組畢赤酵母表達木聚糖酶的培養(yǎng)基，包括以下組分:甘油磷酸鈉15.0?40.0g，硫酸銨1.0?10.0g，二水合硫酸鈣1.0?4.0g，硫酸鉀8.0?16.0g,七水合硫酸鎂7.0?15.0g，PTM1微量元素溶液0.5?6.0mL，無水甲醇5.0?20.0mL，吐溫801.0?3.0g，蒸餾水溶解至1000mL，用Κ0Η調pH在5.5?7.5之間。
[0007]本發(fā)明的另一方面，還包括上述培養(yǎng)基在重組畢赤酵母GS115表達來源于黑曲霉XZ-3S的木聚糖酶基因xynZF-2基因表達的木聚糖酶方面的應用。
[0008]本發(fā)明的另一方面還包括上述培養(yǎng)基的制備工藝，包括以下步驟:
[0009](1)配制基礎培養(yǎng)基:按照上述培養(yǎng)基配方，配制包含甘油磷酸鈉、硫酸銨、二水合硫酸鈣、硫酸鉀、七水合硫酸鎂的基礎鹽培養(yǎng)基，并以蒸餾水定容，用Κ0Η調pH在5.5?7.5之間，121°C滅菌15min，冷卻備用。
[0010](2)添加微量元素PTM1:按照上述配方中所述PTM1的配比，對PTM1微量元素進行過濾除菌，然后無菌加入步驟(1)中所述基礎鹽培養(yǎng)基。
[0011](3)添加誘導劑無水甲醇:按照上述配方中所述無水甲醇的配比，在重組畢赤酵母表達木聚糖酶的發(fā)酵過程中，每12h加入無水甲醇進行誘導表達，即制成用于促進重組畢赤酵母表達木聚糖酶的培養(yǎng)基。
[0012]步驟(2)中PTM1 的成分含量分別為:CuS04.5H20 6.0g/L，KI 0.08g/L，MnS〇4.H203.0g/L,Na2Mo04.2H20 0.2g/L，H3B030.02g/L，CoCl2.6H2O 0.5g/L，ZnCl220.0g/L，FeS04.7H20 65.0g/L，生物素0.2g/L，濃H2SO45.0ml。
[0013]本發(fā)明具有的優(yōu)點和積極效果是:
[0014]1、本發(fā)明以市售無機鹽為主要原料，成分明確，價格經濟。
[0015]2、重組畢赤酵母在該培養(yǎng)基中生長良好，在最佳搖瓶生長狀態(tài)下，菌體生物量、木聚糖酶酶活和比酶活的最高值分別可達到21.0g/L(細胞干重)、6500.0U/mL(改進的DNS法，BAILEY M J，BIELY P and POUTANEN K.1nterlaboratory testing of methods forassay ofxylanase activity[J].Journal ofB1technology，1992，23:257-270.)和21700.0U/mg(用Bradford法測定蛋白質濃度，以牛血清白蛋白作為標準蛋白，酶的比活性(U/mg)=酶活性/蛋白濃度)以上，生物量比經典合成培養(yǎng)基BSM和FM22的培養(yǎng)效果均提高50.0%以上，而木聚糖酶酶活和比酶活均分別提高10倍以上，且超越實驗室使用價格高昂的復合培養(yǎng)基BMMY的培養(yǎng)效果。
[0016]3、可廣泛應用于重組畢赤酵母表達木聚糖酶的基礎研究和工業(yè)化生產，尤其適用于工業(yè)化大規(guī)模表達木聚糖酶。
【具體實施方式】
[0017]實施例1
[0018]本實施例的重組畢赤酵母GS115表達木聚糖酶誘導培養(yǎng)基的配方組成為:甘油磷酸鈉29.0g，硫酸銨4.5g，二水合硫酸鈣1.6g，硫酸鉀14.0g，七水合硫酸鎂11.0g，PTM1微量元素溶液2.4mL，無水甲醇10.0mL，吐溫802.0g，蒸餾水溶解至1000.0mL，用Κ0Η調pH在7.0。
[0019]該培養(yǎng)基的制備方法為:
[0020](1)基礎合成培養(yǎng)基制備:秤取甘油磷酸鈉29.0g，硫酸銨4.5g，二水合硫酸鈣
1.6g，硫酸鉀14.0g，七水合硫酸鎂11.0g，吐溫802.0g，混勾后加蒸饋水定容至1000mL，用Κ0Η調pH在7.0，121°C滅菌20分鐘，冷卻后即得基礎合成培養(yǎng)基。
[0021](2)添加微量元素PTM1:對2.4mL PTM1微量元素進行過濾除菌，然后無菌加入步驟(1)中所述基礎鹽培養(yǎng)基。
[0022](3)添加誘導劑無水甲醇:在重組畢赤酵母表達木聚糖酶的發(fā)酵過程中，每12h加入10mL/L的無水甲醇進行誘導表達，即制成用于促進重組畢赤酵母表達木聚糖酶的誘導培養(yǎng)基。
[0023]重組畢赤酵母經YPD培養(yǎng)基復活活化后，以1% (V/V)接種量接入FM22生長培養(yǎng)基中，培養(yǎng)Id后靜置培養(yǎng)液以沉淀菌體，并把菌體轉入本實施例所制備的誘導培養(yǎng)基中，30°C，240r/min搖瓶震蕩培養(yǎng)5d后生物量、木聚糖酶酶活和比酶活分別可達19.3g/L(細胞干重)、5500.0U/mL和15500.0U/mg。
[0024]實施例2
[0025]重組畢赤酵母GS115表達木聚糖酶誘導培養(yǎng)基的配方組成為:甘油磷酸鈉28.0g，硫酸銨3.5g，二水合硫酸鈣2.5g，硫酸鉀10.0g，七水合硫酸鎂10.0g，PTM1微量元素溶液
4.8mL，無水甲醇12.0mL，吐溫802.8g，蒸餾水溶解至1000.0mL，用K0H調pH在7.5。
[0026]該培養(yǎng)基的制備方法為:
[0027](1)基礎合成培養(yǎng)基制備:秤取甘油磷酸鈉28.0g，硫酸銨3.5g，二水合硫酸鈣
2.5g，硫酸鉀10.0g，七水合硫酸鎂10.0g，吐溫802.8g，混勻后加蒸餾水定容至1000mL，用Κ0Η調pH在7.5，121°C滅菌20分鐘，冷卻后即得基礎合成培養(yǎng)基。
[0028](2)添加微量元素PTM1:對4.8mL PTM1微量元素進行過濾除菌，然后無菌加入步驟(1)中所述基礎鹽培養(yǎng)基。
[0029](3)添加誘導劑無水甲醇:在重組畢赤酵母表達木聚糖酶的發(fā)酵工程中，每12h加入10mL/L的無水甲醇進行誘導表達，即制成用于促進重組畢赤酵母表達木聚糖酶的誘導培養(yǎng)基。
[0030]重組畢赤酵母經YPD培養(yǎng)基復活活化后，以1% (V/V)接種量接入FM22生長培養(yǎng)基中，培養(yǎng)Id后靜置培養(yǎng)液以沉淀菌體，并把菌體轉入本實施例所制備的誘導培養(yǎng)基中，30°C，240r/min搖瓶震蕩培養(yǎng)5d后生物量、木聚糖酶酶活和比酶活分別可達20.3g/L(細胞干重)、6300.0U/mL和16400.0U/mg。
[0031]實施例3
[0032]重組畢赤酵母GS115表達木聚糖酶誘導培養(yǎng)基的配方組成為:甘油磷酸鈉30.0g，硫酸銨7.0g，二水合硫酸鈣1.6g，硫酸鉀14.0g，七水合硫酸鎂11.0g,PTM1微量元素溶液
2.8mL，無水甲醇10.0mL，吐溫802.3g，蒸餾水溶解至1000.0mL，用Κ0Η調pH在7.0。
[0033]該培養(yǎng)基的制備方法為:
[0034](1)基礎合成培養(yǎng)基制備:秤取甘油磷酸鈉30.0g，硫酸銨7.0g，二水合硫酸鈣
1.6g，硫酸鉀14.0g，七水合硫酸鎂11.0g，吐溫802.3g，混勾后加蒸饋水定容至1000mL，用Κ0Η調pH在7.0，121°C滅菌20分鐘，冷卻后即得基礎合成培養(yǎng)基。
[0035](2)添加微量元素PTM1:對2.8mL PTM1微量元素進行過濾除菌，然后無菌加入步驟
(1)中所述基礎鹽培養(yǎng)基。
[0036](3)添加誘導劑無水甲醇:在重組畢赤酵母表達木聚糖酶的發(fā)酵工程中，每12h加入10mL/L的無水甲醇進行誘導表達，即制成用于促進重組畢赤酵母表達木聚糖酶的誘導培養(yǎng)基。
[0037]重組畢赤酵母經YPD培養(yǎng)基復活活化后，以1% (V/V)接種量接入FM22生長培養(yǎng)基中，培養(yǎng)Id后靜置培養(yǎng)液沉淀菌體，并把菌體轉入本實施例所制備的誘導培養(yǎng)基中，30°C，240r/min搖瓶震蕩培養(yǎng)5d后生物量、木聚糖酶酶活和比酶活分別可達21.08/1(細胞干重)、6500.0U/mL和21700.0U/mg。
[0038]以上對本發(fā)明的一個實施例進行了詳細說明，但所述內容僅為本發(fā)明的較佳實施例，不能被認為用于限定本發(fā)明的實施范圍。凡依本發(fā)明申請范圍所作的均等變化與改進等，均應仍歸屬于本發(fā)明的專利涵蓋范圍之內。
【主權項】
1.一種促重組畢赤酵母表達木聚糖酶的培養(yǎng)基，其特征在于:包括以下組分:甘油磷酸鈉15.0?40.0g，硫酸銨1.0?10.0g，二水合硫酸鈣1.0?4.0g，硫酸鉀8.0?16.0g，七水合硫酸鎂7.0?15.0g，PTM1微量元素溶液0.5?6.0mL，無水甲醇5.0?20.0mL，吐溫801.0 —3.0g，蒸餾水溶解至1000mL，用K0H調pH在5.5?7.5之間。2.—種如權利要求1所述的促重組畢赤酵母表達木聚糖酶的培養(yǎng)基的制備工藝，其特征在于:包括以下步驟: (1)配制基礎培養(yǎng)基:按照所述培養(yǎng)基配方，配制包含甘油磷酸鈉、硫酸銨、二水合硫酸鈣、硫酸鉀、七水合硫酸鎂的基礎鹽培養(yǎng)基，并以蒸餾水定容，用K0H調pH在5.5?7.5之間，121°C滅菌15min，冷卻備用。 (2)添加微量元素PTM1:按照所述培養(yǎng)基配方中的所述PTM1的配比，對PTM1微量元素進行過濾除菌，然后無菌加入步驟(1)中所述基礎鹽培養(yǎng)基。 (3)添加誘導劑無水甲醇:按照所述培養(yǎng)基配方中的所述無水甲醇的配比，在重組畢赤酵母表達木聚糖酶的發(fā)酵過程中，每12h加入無水甲醇進行誘導表達，即制成用于促進重組畢赤酵母表達木聚糖酶的培養(yǎng)基。3.—種如權利要求1所述的培養(yǎng)基在重組畢赤酵母GS115表達木聚糖酶基因xynZF-2基因表達的木聚糖酶上的應用。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種促重組畢赤酵母表達木聚糖酶的培養(yǎng)基及其制備方法，培養(yǎng)基包括以下組分：甘油磷酸鈉15.0～40.0g，硫酸銨1.0～10.0g，二水合硫酸鈣1.0～4.0g，硫酸鉀8.0～16.0g，七水合硫酸鎂7.0～15.0g，PTM1微量元素溶液0.5～6.0mL，無水甲醇5.0～20.0mL，吐溫801.0～3.0g，蒸餾水溶解至1000mL，用KOH調pH在5.5～7.5之間。本發(fā)明的有益效果是成分明確，價格經濟，重組畢赤酵母在該培養(yǎng)基中生長良好，適用于工業(yè)化大規(guī)模表達木聚糖酶。
【IPC分類】C12N9/42, C12R1/84
【公開號】CN105420219
【申請?zhí)枴緾N201610053430
【發(fā)明人】朱新術, 趙文慧, 周晨妍, 羅曉秋, 解麗芹, 李同彪
【申請人】新鄉(xiāng)醫(yī)學院
【公開日】2016年3月23日
【申請日】2016年1月26日