專利名稱：一種重組人促紅素分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程重組蛋白純化領(lǐng)域，尤其涉及一種采用陰離子交換層析技術(shù)對(duì)重組人促紅素進(jìn)行分離純化的方法。
背景技術(shù)：
促紅素(Erythropoietin，ΕΡ0)最早發(fā)現(xiàn)于1906年，是一種糖蛋白，屬唾液糖蛋 白激素，蛋白質(zhì)部分由166個(gè)氨基酸組成，分子量為34KD。其編碼基因是單拷貝基因，定位 于人的7號(hào)染色體長(zhǎng)臂21區(qū)。依據(jù)其糖型結(jié)構(gòu)的差異可分為α、β兩種，α型含34%的 碳水化合物，β型含26%的碳水化合物，兩種類型在生物學(xué)特性、抗原性等效果上均相同。 促紅素的生理作用是刺激骨髓中血紅蛋白或紅細(xì)胞的形成，主要由腎臟生成并通過(guò)循環(huán)血 進(jìn)入骨髓而發(fā)揮作用。當(dāng)人的腎功能發(fā)生嚴(yán)重?fù)p害時(shí)，如在急、慢性腎衰竭或腎切除的情況 下，EPO的產(chǎn)生減少，出現(xiàn)貧血。因此，EPO對(duì)絕大多數(shù)腎性貧血患者均有很好的療效。1985年，人EPO基因克隆和表達(dá)的成功使重組人促紅素的制備成為現(xiàn)實(shí)，重組人 促紅素(rhEPO)采用反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)克隆人EPO-cDNA，將其插入到真核細(xì)胞表達(dá)載體中，構(gòu) 建重組表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化到CHO細(xì)胞中，篩選出高效穩(wěn)定表達(dá)人EPO的工程細(xì)胞株。培養(yǎng)該 工程細(xì)胞，收獲上清，進(jìn)行rhEPO蛋白分離純化。rhEPO具有與天然的人促紅素相同的結(jié)構(gòu) 及生理作用，是治療腎性貧血的首選藥物，還可用于外科圍手術(shù)期的紅細(xì)胞動(dòng)員，治療癌癥 及癌癥放療化療引起的貧血，治療艾滋病伴發(fā)貧血癥等，rhEPO是目前為止人類開(kāi)發(fā)最成功 的基因工程藥物。隨著對(duì)rhEPO臨床應(yīng)用的深入研究，發(fā)現(xiàn)rhEPO在治療婦科貧血、孕產(chǎn)婦 貧血、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎所致的貧血等方面都有較好的效果。目前已有重組人促紅素分離純化方法具有以下缺點(diǎn)操作繁瑣，每次處理量不高， 工藝放大難度大，不適合大規(guī)模生產(chǎn)，且最終rhEPO純度僅能達(dá)到95%以上，唾液酸含量為 9. Omol/molEPO以上，體內(nèi)生物學(xué)比活性為1. 2X105IU/mg。亟需建立一種適合大規(guī)模生產(chǎn)且生產(chǎn)成本低的重組人促紅素(rhEPO)分離純化 方法，以滿足大量患者的需求。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的主要目的在于提供一種工藝穩(wěn)定、容易放大、適合大規(guī) 模生產(chǎn)且生產(chǎn)成本低的重組人促紅素分離純化方法。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為一種重組人促紅素分離純化方法，包括以下步驟1)樣品進(jìn)行藍(lán)膠層析；2)所述藍(lán)膠層析產(chǎn)物進(jìn)行超濾濃縮；3)所述超濾濃縮產(chǎn)物進(jìn)行離子交換層析I，用pH6. 5 7. 5的10mmol/L Tris-HCl 緩沖液平衡柱床，上樣后先用PH6. 5 7. 5，含0. 03 0. 07mol/L NaCl的10mmol/L Tris-HCl 緩沖液洗脫至基線，再用 pH6. 5 7. 5，含 0. 08 0. 15mol/L NaCl 的 10mmol/LTris-HCl緩沖液洗脫；4)所述離子交換層析I產(chǎn)物進(jìn)行C4反相層析；5)所述C4反向?qū)游霎a(chǎn)物進(jìn)行離子交換層析II，用pH6. 5 7. 5的lOmmol/L Tris-HCl緩沖液平衡，上樣后先用pH3. 7 4. 7、含4 8mol/L尿素、0. 5 2mmol/L甘氨 酸的緩沖液洗脫柱床，洗脫至基線后再用PH6. 5 7. 5的lOmmol/L Tris-HCl緩沖液淋洗 10 15 個(gè)柱體積，最后用 pH6. 5 7. 5、含 0. 1 0. 4mol/L NaCl 的 10mmol/L Tris-HCl 緩沖液洗脫；6)所述離子交換層析II產(chǎn)物進(jìn)行S-200分子篩層析，得到重組人促紅素蛋白。所述步驟1)中樣品為灌流培養(yǎng)細(xì)胞收集液；所述步驟1)具體為用 ρΗ6· 5 7. 5、含 0. 1 0. 3mo 1/L NaCl 的 20mmol/L Tris-HCl緩沖液平衡Blue Sepharose 6 Fast Flow層析柱，上樣后，先用所述緩沖液平衡 液淋洗至基線，再用ρΗ6· 5 7. 5、含1. 0 1. 4mol/L NaCl的20mmol/L Tris-HCl緩沖液 洗脫，收集rhEPO峰。優(yōu)選地，步驟1)具體為用 ρΗ7· 0、含 0. 2mol/L NaCl 的 20mmol/LTris-HCl 緩沖 液平衡Blue Sepharose 6 Fast Flow層析柱，上樣后，先用所述緩沖液平衡液淋洗至基線， 再用 pH7. 0、含 1. 3mol/L NaCl 的 20mmol/L Tris-HCl 緩沖液洗脫，收集 rhEPO 峰。所述步驟2)具體為用pH6. 5 7. 5的lOmmol/L Tris-HCl緩沖液進(jìn)行超濾濃 縮，濃縮至電導(dǎo)率和緩沖液電導(dǎo)率相差100 200μ S/cm。優(yōu)選地，步驟2)具體為用pH7. 0的lOmmol/L Tris-HCl緩沖液進(jìn)行超濾濃縮，濃 縮至電導(dǎo)率和緩沖液電導(dǎo)率相差180 μ S/cm。所述步驟3)具體為用pH6. 5 7. 5的lOmmol/L Tris-HCl緩沖液平衡柱床，上 樣后先用PH6. 5 7. 5、含0. 03 0. 07mol/L NaCl的10mmol/L Tris-HCl緩沖液洗脫至基 線，再用 ρΗ6· 5 7. 5、含 0. 08 0. 15mol/L NaCl 的 IOmmol/L Tris-HCl 緩沖液洗脫，收集 DEAE I洗脫峰。優(yōu)選地，步驟3)具體為用pH7. 0的lOmmol/L Tris-HCl緩沖液平衡柱床，上樣后 先用ρΗ7· 0、含0. 04mol/L NaCl的IOmmol/L Tris-HCl緩沖液洗脫至基線，再用ρΗ7· 0、含 0. 13mol/L NaCl 的 10mmol/LTris-HCl 緩沖液洗脫，收集 DEAE I 洗脫峰。所述步驟4)具體為用pH6. 5 7. 5、含4% 10%乙醇的lOmmol/LTris-HCl緩 沖液平衡C4柱，上樣后，先用pH6. 5 7. 5、含4% 10%乙醇的10mmol/L Tris-HCl緩沖 液淋洗至基線，再用PH6. 5 7. 5、含40% 70%乙醇的lOmmol/L Tris-HCl緩沖液洗脫， 收集洗脫峰。優(yōu)選地，步驟4)具體為用pH7. 0、含8%乙醇的lOmmol/LTris-HCl緩沖液平衡C4 柱，上樣后，先用PH7. 0、含8%乙醇的lOmmol/L Tris-HCl緩沖液淋洗至基線，再用pH7. 0、 含50%乙醇的lOmmol/L Tris-HCl緩沖液洗脫，收集洗脫峰。 所述步驟5)具體為用pH6. 5 7. 5的lOmmol/L Tris-HCl緩沖液平衡柱床，上 樣后先用PH3. 7 4. 7、含4 8mol/L尿素、0. 5 2mmol/L甘氨酸的緩沖液洗脫柱床，洗 脫至基線后再用PH6. 5 7. 5的lOmmol/LTris-HCl緩沖液淋洗10 15個(gè)柱體積，最后用 ρΗ6· 5 7. 5、含 0. 1 0. 4mol/L NaCl 的 IOmmol/L Tris-HCl 緩沖液洗脫，收集 DEAE II 洗脫峰。
優(yōu)選地，步驟5)具體為用pH7. 0的lOmmol/L Tris-HCl緩沖液平衡柱床，上樣 后先用PH4. 0、含5mol/L尿素、1. 5mmol/L甘氨酸的緩沖液洗脫柱床，洗脫至 基線后再用 pH7. 0的IOmmol/L Tris-HCl緩沖液淋洗15個(gè)柱體積，最后用ρΗ7· O、含0. 3mol/L NaCl的 10mmol/L Tris-HCl緩沖液洗脫，收集DEAE II洗脫峰；所述步驟6)具體為用pH6. 0 8. 0、含50 150mmol/L NaCl的20mmol/L枸櫞 酸_枸櫞酸鈉緩沖液平衡S-200柱，上樣并洗脫，同時(shí)用0. 22 μ m過(guò)濾器過(guò)濾并無(wú)菌收集， 收集峰即為重組人促紅素。優(yōu)選地，步驟6)具體為用pH7. 0、含120mmol/L NaCl的20mmol/L枸櫞酸-枸櫞 酸鈉緩沖液平衡S-200柱，上樣并洗脫，同時(shí)用0. 22 μ m過(guò)濾器過(guò)濾并無(wú)菌收集，收集峰即 為重組人促紅素。本發(fā)明中采用兩次陰離子交換層析，第二次陰離子交換層析柱(DEAE-Sepharose Fast Flow層析)的使用，不但可以根據(jù)生產(chǎn)需要進(jìn)行不同程度的放大，解決生產(chǎn)規(guī)模問(wèn) 題，而且在去除乙醇的同時(shí)對(duì)rhEPO純度和體內(nèi)生物學(xué)比活性起到進(jìn)一步提高的作用，該 步層析可以將唾液酸含量低的rhEPO去除，提高產(chǎn)品中唾液酸含量高的rhEPO蛋白的比例。 采用本發(fā)明重組人促紅素分離純化方法，純化得到的rhEPO純度可達(dá)99%以上，唾液酸含 量達(dá)9. 5mOl/mOlEP0以上，體內(nèi)生物學(xué)比活性達(dá)1.4X105IU/mg以上。本發(fā)明在已有工藝 方法基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，不但解決了生產(chǎn)規(guī)模問(wèn)題，且提高了 rhEPO產(chǎn)品質(zhì)量。


圖1是本發(fā)明重組人促紅素分離純化方法工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖對(duì)本發(fā)明重組人促紅素分離純化方法做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。材料準(zhǔn)備通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)罐連續(xù)灌流培養(yǎng)含人促紅素基因的重組工程細(xì)胞株獲得 含重組人促紅素(rhEPO)的無(wú)血清培養(yǎng)液。從上述培養(yǎng)液中分離純化rhEPO的具體步驟1.藍(lán)膠層析(Blue Sepharose 6 Fast Flow 層析)1. 1 平衡用 0. 2mol/L NaCl_20mmol/L Tris-HCl (ρΗ7· 0)緩沖液平衡 Blue Sepharose 6 Fast Flow層析柱，直至流出液pH為7· 0。1. 2上樣以40ml/min流速，將過(guò)濾后的細(xì)胞收集液上樣。1. 3 淋洗用 0. 2mol/L NaCl_20mmol/L Tris-HCl (ρΗ7· 0)緩沖液以 40ml/min 的
流速淋洗至基線。1. 4 洗脫用 1. 3mol/L NaCl_20mmol/L Tris-HCl (ρΗ7· 0)緩沖液以 40ml/min 的 流速洗脫并收集EPO峰。2.超濾濃縮將藍(lán)膠洗脫液用lOmmol/L Tris-HCl，pH7. 0緩沖液進(jìn)行超濾濃縮，直到濃縮液電 導(dǎo)率和緩沖液電導(dǎo)率相差180 μ S/cm左右。3.離子交換層析 I (DEAE-Sepharose Fast Flow 層析)3. 1平衡以50mi/min的流速用lOmmol/L Tris-HCl (pH7. 0)緩沖液平衡柱床，直至流出液pH為7.0。

3. 2上樣以40ml/min的流速將超濾得到的濃縮液上樣于DEAE-S印harose Fast Flow層析柱。3. 3 淋洗用 0. 04mol/L NaCl-lOmmol/L Tris-HCl (ρΗ7· 0)緩沖液以 40ml/min 的 流速淋洗，直至待檢測(cè)峰下降至基線。3. 4 洗脫用 0. 13mol/L NaCl-IOmmo 1/LTris-HCl (ρΗ7· 0)緩沖液以 40ml/min 的 流速洗脫，洗脫收集液為DEAE I收集液，收集于血清瓶中。4. C4反相層析4. 1 平衡用 8% 乙醇 /lOmmol/LTris-HCl (pH7. 0)緩沖液平衡 VydacC4 柱，平衡流 速為40ml/min，淋洗5倍柱體積。4. 2上樣以40ml/min的流速將DEAE I收集液上樣于Vydac C4柱。4. 3淋洗上樣完畢后，用8%乙醇/lOmmol/L Tris-HCl (pH7. 0)緩沖液淋洗至基線。4. 4 洗脫用 50% 乙醇/10mmol/L Tris-HCl (pH7. 0)緩沖液以 40ml/min 的流速洗 脫，從洗脫峰出現(xiàn)時(shí)開(kāi)始收集至洗脫峰結(jié)束為止，收集至5L血清瓶中。5. m^^^M^fr II (DEAE-Sepharose Fast Flow 層析)5. 1平衡用lOmmol/L Tris-HCl (pH7. 0)緩沖液以40ml/min的流速平衡至流出 液PH為7.0。5. 2上樣以40ml/min的流速將C4反相層析收集液上樣于DEAE-S印harose Fast Flow層析柱。5. 3淋洗先用5mol/L尿素/1. 5mmol/L甘氨酸(pH4. 0)的緩沖液以40ml/min的 流速淋洗至紫外檢測(cè)值降低至基線，再用lOmmol/LTris-HCl (pH7. 0)緩沖液以40ml/min的 流速淋洗15個(gè)柱體積。5. 4 洗脫用含 0. 3mol/L NaCl/10mmol/L Tris-HCl (ρΗ7· 0)的緩沖液以 40ml/min 的流速洗脫，從洗脫峰紫外檢測(cè)值上升時(shí)開(kāi)始收集，至降低至基線結(jié)束收集，收集DEAE II 洗脫液于500ml鹽水瓶中。此收集液唾液酸含量應(yīng)不小于9. 5mOl/mOlEP0。6. S-200分子篩層析6. 1平衡用20mmol/L枸櫞酸-枸櫞酸鈉-120mmol/L NaCl (ρΗ7· 0)緩沖液以 12ml/min的流速平衡2倍柱體積。6. 2上樣上樣流速為12ml/min，上樣量應(yīng)不超過(guò)柱體積的1/10。6. 3洗脫用20mmol/L枸櫞酸-枸櫞酸鈉-120mmol/L NaCl (ρΗ7· 0)緩沖液以 12ml/min的流速洗脫。從洗脫峰開(kāi)始出現(xiàn)收集至檢測(cè)峰下降至基線時(shí)停止收集。用一次性 過(guò)濾器，無(wú)菌過(guò)濾EPO產(chǎn)品至無(wú)菌鹽水瓶中，即為最終純化的重組人促紅素(rhEPO)產(chǎn)品原 液。分離純化后的重組人促紅素(rhEPO)產(chǎn)品經(jīng)SDS-PAGE和HPLC檢測(cè)分析，純度達(dá) 99.0%以上，體內(nèi)和體外生物比活性達(dá)1.5X105IU/mg以上，唾液酸含量不低于9. 5mol/mol EPO0其它檢測(cè)項(xiàng)目均符合中國(guó)藥典現(xiàn)行版規(guī)定。本發(fā)明重組人促紅素(rhEPO)的分離純化方法具有以下優(yōu)點(diǎn)1)純化過(guò)程中介質(zhì)對(duì)蛋白的載量大，流速快，操作時(shí)間短；不但可大量處理樣品，還可根據(jù)生產(chǎn)需要進(jìn)行不同程度的放大，解決生產(chǎn)規(guī)模問(wèn)題。2)純化過(guò)程重復(fù)性好，且反復(fù)再生利用過(guò)程簡(jiǎn)單。3)純化過(guò)程操作簡(jiǎn)便，不需特殊的試劑。 4)由該方法獲得的rhEPO純度高，由已有工藝產(chǎn)品純度的95%以上提高到99.0% 以上，提高4.0%以上。5)由該方法獲得的rhEPO活性收率高由已有工藝的10%提高至15%，提高了 50%。6)由該方法獲得的rhEPO中唾液酸含量由已有工藝的9.0mOl/mOlEP0左右提高至 9. 5mol/mol EPO以上，提高了 5%以上。7)由該方法獲得的rhEPO體內(nèi)生物學(xué)比活性由1. 2 X 105IU/mg提高至Ij 1.4X105IU/mg以上，提高約17%以上。
權(quán)利要求
1.一種重組人促紅素分離純化方法，包括以下步驟1)對(duì)樣品進(jìn)行藍(lán)膠層析；2)對(duì)所述藍(lán)膠層析產(chǎn)物進(jìn)行超濾濃縮；3)對(duì)所述超濾濃縮產(chǎn)物進(jìn)行離子交換層析I，用pH6.5 7. 5的lOmmol/L Tris-HCl緩 沖液平衡柱床，上樣后先用PH6. 5 7. 5、含0. 03 0. 07mol/L NaCl的10mmol/L Tris-HCl 緩沖液洗脫至基線，再用 PH6. 5 7. 5，含 0. 08 0. 15mol/L NaCl 的 10mmol/L Tris-HCl 緩沖液洗脫；4)對(duì)所述離子交換層析I產(chǎn)物進(jìn)行C4反相層析；5)對(duì)所述C4反向?qū)游霎a(chǎn)物進(jìn)行離子交換層析II，用pH6.5 7.5的lOmmol/L Tris-HCl緩沖液平衡柱床，上樣后先用pH3. 7 4. 7、含4 8mol/L尿素、0. 5 2mmol/L 甘氨酸的緩沖液洗脫柱床，洗脫至基線后再用PH6. 5 7. 5的lOmmol/L Tris-HCl緩沖液淋 洗 10 15 個(gè)柱體積，最后用 pH6. 5 7. 5、含 0. 1 0. 4mol/L NaCl 的 10mmol/L Tris-HCl 緩沖液洗脫；6)對(duì)所述離子交換層析II產(chǎn)物進(jìn)行S-200分子篩層析，得到重組人促紅素蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人促紅素分離純化方法，其特征在于，步驟1)中的所述 樣品為灌流培養(yǎng)細(xì)胞收集液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人促紅素分離純化方法，其特征在于，步驟1)具體為 用 ρΗ6· 5 7. 5、含0. 1 0.3mol/L NaCl 的 20mmol/LTris-HCl 緩沖液平衡Blue Sepharose 6 Fast Flow層析柱，上樣后，先用所述緩沖液平衡液淋洗至基線，再用pH6. 5 7. 5、含 1. 0 1. 4mol/LNaCl 的 20mmol/L Tris-HCl 緩沖液洗脫，收集 rhEPO 峰。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人促紅素分離純化方法，其特征在于，步驟2)具體為 用pH6. 5 7. 5的lOmmol/L Tris-HCl緩沖液進(jìn)行超濾濃縮，濃縮至濃縮液電導(dǎo)率和緩沖 液電導(dǎo)率相差100 200 μ S/cm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人促紅素分離純化方法，其特征在于，步驟3)具體為，用 ρΗ6· 5 7. 5的IOmmol/L Tris-HCl緩沖液平衡柱床，上樣后先用ρΗ6. 5 7. 5、含0. 03 0. 07mol/L NaCl 的 10mmol/LTris-HCl 緩沖液洗脫至基線，再用 pH6. 5 7. 5，含 0. 08 0. 15mol/LNaCl 的 10mmol/L Tris-HCl 緩沖液洗脫，收集 DEAE I 洗脫峰。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人促紅素分離純化方法，其特征在于，步驟4)具體為 用pH6. 5 7. 5、含4% 10%乙醇的lOmmol/LTris-HCl緩沖液平衡C4柱，上樣后，先用 pH6. 5 7. 5、含4% 10%乙醇的10mmol/LTris-HCl緩沖液淋洗至基線，再用pH6. 5 7. 5、含40% 70%乙醇的lOmmol/L Tris-HCl緩沖液洗脫，收集洗脫峰。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人促紅素分離純化方法，其特征在于，步驟5)具體為用ρΗ6· 5 7. 5的IOmmol/L Tris-HCl緩沖液平衡柱床，上樣后先用ρΗ3· 7 4. 7、含4 8mol/L尿素、0. 5 2mmol/L甘氨酸的緩沖液洗脫柱床，洗脫至基線后再用pH6. 5 7. 5的10mmol/L Tris-HCl緩沖液淋洗10 15個(gè)柱體積，最后用pH6. 5 7. 5、含0. 1 0. 4mol/L NaCl 的 10mmol/L Tris-HCl 緩沖液洗脫，收集 DEAE II 洗脫峰。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人促紅素分離純化方法，其特征在于，所述步驟6)具體 為用pH6. 0 8. 0、含50 150mmol/L NaCl的20mmol/L枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液平衡 S-200柱，上樣并洗脫，同時(shí)用0. 22 μ m過(guò)濾器過(guò)濾并無(wú)菌收集，收集峰即為重組人促紅素。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程重組蛋白純化領(lǐng)域，尤其涉及一種采用陰離子交換層析技術(shù)對(duì)重組人促紅素進(jìn)行分離純化的方法，包括以下步驟1)樣品進(jìn)行藍(lán)膠層析；2)藍(lán)膠層析產(chǎn)物進(jìn)行超濾濃縮；3)超濾濃縮產(chǎn)物進(jìn)行離子交換層析I；4)離子交換層析I產(chǎn)物進(jìn)行C4反相層析；5)C4反向?qū)游霎a(chǎn)物進(jìn)行離子交換層析II；6)離子交換層析II產(chǎn)物進(jìn)行S-200分子篩層析，得到重組人促紅素蛋白。采用本發(fā)明所述方法，純化得到的rhEPO純度可達(dá)99％以上，唾液酸含量達(dá)9.5mol/molEPO以上，體內(nèi)生物學(xué)比活性達(dá)1.4×105IU/mg以上。本發(fā)明在已有工藝方法基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，不但解決了生產(chǎn)規(guī)模問(wèn)題，且提高了rhEPO產(chǎn)品質(zhì)量。
文檔編號(hào)C07K1/16GK102040659SQ20091011059
公開(kāi)日2011年5月4日 申請(qǐng)日期2009年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月19日
發(fā)明者于玉根, 張翼翔, 陳紅霞 申請(qǐng)人:深圳新鵬生物工程有限公司