可高密度培養(yǎng)的裂殖壺菌及其生產(chǎn)富含dha的油脂的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及可高密度培養(yǎng)的裂殖壺菌及其生產(chǎn)富含 DHA的油脂的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] DHA是人類大腦和視網(wǎng)膜組織中細(xì)胞膜的重要組成成分，是人體自身發(fā)育必需的 n-3系列多不飽和脂肪酸系，其對嬰幼兒大腦及視力的發(fā)育有至關(guān)重要的作用，同時它在預(yù) 防高血壓、動脈硬化、關(guān)節(jié)炎以及癌癥等疾病方面具有顯著功效。另外，n-3系列不飽和脂肪 酸也是魚蝦生長所必需，而其本身不能合成，養(yǎng)殖時必須依靠飼料提供，尤其是仔幼階段， DHA缺乏會導(dǎo)致死亡率升高以及體表白化等疾病。傳統(tǒng)的DHA生產(chǎn)途徑主要來源于魚油的 提取純化，但提取得率低、資源有限、易氧化、有魚腥味，而且生產(chǎn)工藝復(fù)雜、產(chǎn)品成本高。隨 著漁業(yè)資源萎縮以及海洋污染的加劇，魚油來源的DHA面臨著發(fā)展乏力的困境，難以滿足 市場需求。
[0003] 目前，已發(fā)現(xiàn)一些低等海洋細(xì)菌、海洋真菌和微藻類，如希瓦氏菌（Shewanella)、 破囊壺菌（Thraustochytrium)、裂殖壺菌（Schizochytrium)、寇氏隱甲藻(Crythecodiniumcohnii)等都能合成DHA。其中裂殖壺菌，也叫裂殖壺藻，屬真菌門、網(wǎng)粘 菌綱、破囊壺菌目、破囊壺菌科的一類海洋真菌，單細(xì)胞、球形。且生長周期短，可異養(yǎng)發(fā)酵， 生物量及油脂含量高，油脂可達(dá)細(xì)胞干重50%，其中DHA可達(dá)40-50%。國家已批準(zhǔn)裂殖壺 藻為新資源食品，其DHA油脂可用于嬰幼兒配方食品。其安全性也早已得到美國食品藥品 管理局（FDA)認(rèn)可，批準(zhǔn)為GRAS級營養(yǎng)添加物。歐盟也于2014年7月16日公布批準(zhǔn)微藻 裂殖壺菌油脂作為新型食品配料投放市場，歐盟食品安全局并于同年10月9日宣布擴(kuò)大新 型食品配料，當(dāng)中EPA和DHA的每日攝入量總和不超過5g時不會對成人構(gòu)成安全風(fēng)險(xiǎn)。
[0004] CN104312929A"一株高產(chǎn)DHA裂殖壺菌菌株及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用"，公開了一株高 產(chǎn)DHA裂殖壺菌菌株，發(fā)酵后裂殖壺菌的生物量為30~45g/L，DHA含量為8. 6~12. 5g/ L。其生物量和DHA含量較低，限制其生產(chǎn)應(yīng)用。CN104031843A"一種裂殖壺菌及其應(yīng)用" 公開了 一種裂殖壺菌，發(fā)酵后獲得生物量為180~200g/L，DHA產(chǎn)量為50~65g/L。然而 這只是在3L和5L的發(fā)酵罐中高密度發(fā)酵培養(yǎng)的結(jié)果，無法大規(guī)模生產(chǎn)。并且其發(fā)酵培養(yǎng) 過程中，需長時間流加50% (w/v)的玉米漿溶液，整個發(fā)酵過程中采用了補(bǔ)糖操作，玉米漿 溶液用量大，生產(chǎn)成本過高，不適合量產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供可高密度培養(yǎng)的裂殖壺菌及其生產(chǎn)富含DHA的油脂的方法，該裂殖壺 菌適合高密度培養(yǎng)并生產(chǎn)富含DHA的油脂，其生產(chǎn)方法成本低，所得生物量及DHA產(chǎn)量高。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：可高密度培養(yǎng)的裂殖壺菌，其 分類命名為裂殖壺菌（Schizochytriumsp.)SLTW3,已于2015年10月8日保藏于中國典型 培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國武漢，保藏編號為CCTCCN〇:M2015591。該裂殖壺菌生長 速度快，適合高密度發(fā)酵。其主要長鏈不飽和脂肪酸的代謝產(chǎn)物為DHA，基因序列如SEQID NO:1所示。
[0007] 所述的可高密度培養(yǎng)的裂殖壺菌，是以SR21作為出發(fā)菌株，通過多次紫外誘變及 篩選后，得到所述的裂殖壺菌；所述篩選包括裂殖壺菌的初篩和復(fù)篩；所述裂殖壺菌的初 篩為培養(yǎng)誘變的菌液，篩選出細(xì)胞直徑大、生長快的裂殖壺菌菌株；所述裂殖壺菌的復(fù)篩 為，將初篩得到的裂殖壺菌菌株進(jìn)行擋板搖瓶培養(yǎng)，并檢測脂肪酸成分，篩選出生物量、總 脂肪酸含量以及DHA含量高的菌株。
[0008] 本發(fā)明篩選所得裂殖壺菌的形態(tài)特征如圖1、圖2所示，細(xì)胞直徑為5-15μm。進(jìn) 行擋板搖瓶培養(yǎng)后，檢測結(jié)果為：總脂肪酸含量為細(xì)胞干重的51. 7%，其中DHA含量占 45. 53%〇
[0009] -種利用裂殖壺菌生產(chǎn)富含DHA的油脂的方法，以上述的裂殖壺菌為出發(fā)菌株， 經(jīng)高密度發(fā)酵收集菌體，提取富含DHA的油脂。
[0010] 所述的高密度發(fā)酵包括以下步驟：
[0011] (1)菌株活化培養(yǎng)：將保存在甘油管的菌株經(jīng)劃線培養(yǎng)于平板培養(yǎng)中，經(jīng)過 40-48h培養(yǎng)，得到單菌落；
[0012] ⑵一級種子培養(yǎng)：將平板中的單菌落接入裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶 中，在20-30°C、150-220rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)20-24h，獲得一級種子；
[0013] (3)二級種子培養(yǎng)：將一級種子接入裝有100mL種子培養(yǎng)基的500mL搖瓶中，接種 量為5-10% (V/V)，在20-30°C、150-220rpm條件下?lián)u床培養(yǎng)20-24h，獲得二級種子；
[0014] (4)發(fā)酵罐放大培養(yǎng)：將二級種子接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)，接 種量為5-10 % (V/V)，攪拌轉(zhuǎn)速200-400rpm，通氣量上限3m3/h，培養(yǎng)溫度25-30°C，通過通 氣量和轉(zhuǎn)速控制溶氧10 % -20 %，通過自動流加40 %磷酸或40 %氫氧化鈉維持發(fā)酵液pH 為6. 0,發(fā)酵周期為70-96h。
[0015] 發(fā)酵過程中，當(dāng)還原糖含量低于l〇g/L，且發(fā)酵液中溶解氧開始升高時，添加適量 的培養(yǎng)液，維持發(fā)酵液中碳氮的質(zhì)量比為3-2:1，并使發(fā)酵液中還原糖的含量為10-20g/L; 如果還原糖含量較低，但溶解氧變化不明顯時，無需添加葡萄糖。
[0016] 優(yōu)選的：所述發(fā)酵罐放大培養(yǎng)中添加的培養(yǎng)液為無菌玉米漿干粉溶液和無菌葡萄 糖溶液。
[0017] 優(yōu)選的：所述發(fā)酵罐放大培養(yǎng)的發(fā)酵培養(yǎng)基包含以下組分：葡萄糖60-90g/L， 酵母膏 10_20g/L，玉米漿干粉 20-30g/L，蛋白胨l-5g/L，海水素 10-15g/L，MgS04 · 7H20 1· 5-2. 5g/L，KH2P03 1· 5-2. 5g/L，KC1 0· 5-0. 7g/L，CaCl2 0· 1-0. 2g/L。
[0018] 優(yōu)選的：所述一級種子培養(yǎng)和二級種子培養(yǎng)的種子培養(yǎng)基包含以下組分：葡萄糖 20-60g/L，酵母粉 5-15g/L，蛋白胨l-5g/L，海水素 10-15g/L，且PH為 6. 0。
[0019]當(dāng)進(jìn)行大規(guī)模高密度培養(yǎng)時，優(yōu)選的，所述發(fā)酵罐放大培養(yǎng)為多聯(lián)發(fā)酵培養(yǎng)。
[0020] 優(yōu)選的：高密度發(fā)酵結(jié)束后，離心收集濕菌體噴霧干燥，通過酸熱法提取并旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā)得到富含DHA的油脂。
[0021] 本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明以SR21作為出發(fā)菌株，通過紫外誘變并篩選獲 得一種裂殖壺菌，該裂殖壺菌生長速度快，適合高密度發(fā)酵。并且提供了一種利用該裂殖壺 菌生產(chǎn)富含DHA的油脂的方法，經(jīng)高密度發(fā)酵培養(yǎng)，最終生物量可達(dá)170-190g/L，其中DHA 產(chǎn)量可達(dá)25g/L。所述高密度發(fā)酵的發(fā)酵罐放大培養(yǎng)中，僅當(dāng)還原糖含量低于10g/L，且發(fā) 酵液中溶解氧開始升高時，需添加適量的培養(yǎng)液。在實(shí)現(xiàn)高生物量和DHA產(chǎn)量的同時，降低 了生產(chǎn)成本，適合工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0022] 圖1為裂殖壺菌菌落形態(tài)圖；
[0023] 圖2為裂殖壺菌在光學(xué)顯微鏡下的形態(tài)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 實(shí)施例一
[0025] 1、裂殖壺菌的誘變及篩選
[0026] 1. 1紫外誘變
[0027] 出發(fā)菌株為（Schizochytriumsp.)SR21 (購自美國ATCC)，具體步驟為：
[0028] (1)取保藏菌株（1. 0ml融化菌液）接種于50ml種子培養(yǎng)基中，于20-30°C、 150-220印111條件下?lián)u床培養(yǎng)20-2411，得到對數(shù)期菌液；然后按5-10%(￥/￥)轉(zhuǎn)接到新鮮的 種子培養(yǎng)基中，在相同條件下培養(yǎng)至對數(shù)期。
[0029] (2)將上述得到的對數(shù)期菌液經(jīng)無菌蒸餾水洗滌離心，并制成菌懸液，菌懸液的菌 液濃度0D650為0. 3-0. 8;取適量菌懸液倒入培養(yǎng)皿，使該菌液成為厚度l-5mm的薄層菌 膜；于15-30W紫外燈下，20-30cm距離處照射20-lOOs，得到誘變的菌液。
[0030] 1.2裂殖壺菌的篩選
[0031]1.2.1裂殖壺菌的初篩
[0032] (1)在無菌條件下，取l_2ml上述誘變的菌液接種到新鮮的種子培養(yǎng)基中，于 20-30°C、150-220rpm的黑暗條件下?lián)u床培養(yǎng)12-20h。
[0033] (2)培養(yǎng)后的菌液適當(dāng)稀釋后涂布于固體培養(yǎng)基（葡萄糖5g/L，酵母粉lg/L，蛋白 胨lg/L，海鹽15g/L，瓊脂粉17g/L，pH為6.0)平板上，在20-30°C下培養(yǎng)至長出單菌落。
[0034] (3)從單菌落中，篩選出生長較快、細(xì)胞直徑較大的裂殖壺菌菌株，在進(jìn)行純化后 轉(zhuǎn)接于固體培養(yǎng)基斜面，在20-30°C下培養(yǎng)后于4°C下保藏。
[0035] 1.2. 2裂殖壺菌的復(fù)篩
[0036] (1)將初篩保藏的裂殖壺菌菌株進(jìn)行擋板搖瓶培養(yǎng)，擋板搖瓶培養(yǎng)的具體步驟如 下：
[0037] a、菌株活化培養(yǎng)：將保存在斜面的菌株經(jīng)劃線培養(yǎng)于平板培養(yǎng)基（葡萄糖5g/L， 酵母粉lg/L，蛋白胨lg/L，海鹽15g/L，瓊脂粉17g/L，pH為6.0)中，經(jīng)過40h培養(yǎng)，得到單 菌落。
[0038] b、種子培養(yǎng)：將平板中的單菌落接入裝有50mL種子培養(yǎng)基（葡萄糖20g/L，酵母 粉l〇g/L，蛋白胨5g/L，海水素15g/L，pH為6. 0)的250mL搖瓶中，在28°C、200rpm條件下 搖床培養(yǎng)20h，獲得一級種子。
[0039] 〇、按10%的接種量接入到裝有10〇11^發(fā)酵培養(yǎng)基（葡萄糖5(^/1，酵母浸膏3(^/ L，蛋白胨5g/L，海鹽15g/L，pH6. 0)的500mL擋板搖瓶中，28°C、200r/min搖瓶培養(yǎng)56h，直 至葡萄糖消耗完畢。
[0040] (2)取一定量的發(fā)酵液，通過酸熱法提取，三氟化硼甲酯化-氣相色譜法 (Agilent7890A氣相色譜儀，SupelcoSPTM-2560石英毛細(xì)管柱）進(jìn)行檢測，篩選出生物量、 總脂肪酸含量以及DHA含量高的菌株。
[0041] 經(jīng)過多次誘變及篩選后，得到本發(fā)明所提供的裂殖壺菌。該裂殖壺菌的形態(tài)特征 如圖1、圖2所示，細(xì)胞直徑為5-15μπι。檢測結(jié)果為：總脂肪酸含量為細(xì)胞干重的51. 7%， 其中DHA含量占45. 53%，其脂肪酸的組成成分分析如下表所不：
[0042]
[0043] 上述的裂殖壺菌分類命名為裂殖壺菌（Schizochytriumsp. )SLTW3,已保藏于中 國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCN〇:M2015591，經(jīng)檢測基因序列如SEQIDN0:1 所示。
[0044] 實(shí)施例二
[0045] 裂殖壺菌（Schizochytriumsp.)SLTW3的20L高密度發(fā)酵生產(chǎn)
[0046] 具體步驟如下：
[0047] (1)菌株活化培養(yǎng)：將保存在甘油管的菌株經(jīng)劃線培養(yǎng)于平板培養(yǎng)基（葡萄糖 5g/L，酵母粉lg/L，蛋白胨lg/L，海鹽15g/L，瓊脂粉17g/L，pH為6.0)中，經(jīng)