將異源蛋白呈遞于大腸桿菌外膜囊泡表面的新型疫苗形式的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及分子生物學(xué)及免疫學(xué)領(lǐng)域，具體的說(shuō)，本發(fā)明提供了一種大腸桿菌外膜囊泡（OMVs）作為疫苗載體的構(gòu)建及應(yīng)用方法。運(yùn)用基因工程手段，可以利用膜蛋白（如SEQ ID NO1所示）作為牽引將異源蛋白呈遞至大腸桿菌OMVs表面，以此重組OMVs免疫動(dòng)物時(shí)，該OMVs作為疫苗載體可以誘發(fā)針對(duì)異源蛋白的免疫應(yīng)答。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
將異源蛋白呈遞于大腸桿菌外膜囊泡表面的新型疫苗形式
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體而言，通過(guò)膜定位的牽引分子與外源蛋白的融合表達(dá)，實(shí)現(xiàn)將外源蛋白呈遞在OMVs表面，并應(yīng)用于疫苗領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]細(xì)菌與宿主細(xì)胞的聯(lián)系主要是通過(guò)細(xì)菌向胞外釋放效應(yīng)因子來(lái)完成信息的傳遞，細(xì)菌通過(guò)釋放刺激因子激發(fā)宿主的免疫防御功能并產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
[0003]細(xì)菌的蛋白分泌系統(tǒng)大多由單一蛋白或小蛋白的復(fù)合體形式通過(guò)膜轉(zhuǎn)運(yùn)途徑進(jìn)行分泌。
[0004]細(xì)菌外膜囊泡(OMVs)是一種主要的信息傳遞載體，OMVs將多種蛋白分子及脂類(lèi)物質(zhì)向外分泌并傳遞至宿主哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
[0005]OMVs是一種很小的蛋白脂質(zhì)體，平均直徑為50_200nm，由致病及非致病的革蘭氏陰性菌在生長(zhǎng)過(guò)程中由外膜釋放然后分泌到胞外。
[0006]OMVs的成分主要是外膜蛋白(0ΜΡ)、脂多糖(LPS)、磷脂及可溶性的周質(zhì)蛋白，但沒(méi)有在OMVs中發(fā)現(xiàn)內(nèi)膜或細(xì)胞質(zhì)成分。
[0007]天然的OMVs作為細(xì)菌的主要分泌系統(tǒng)，主要負(fù)責(zé)向胞外釋放脂類(lèi)蛋白、膜蛋白、疏水分子，并保護(hù)釋放的可溶性蛋白不受環(huán)境中蛋白酶的水解，以保護(hù)運(yùn)載蛋白的完整性。
[0008]OMVs能包裹高濃度的效應(yīng)分子(DNA、RNA)，并利用OMVs的表面配體準(zhǔn)確的識(shí)別目標(biāo)細(xì)胞，將效應(yīng)分子準(zhǔn)確無(wú)誤的遞送至目標(biāo)地點(diǎn)。
[0009]天然免疫系統(tǒng)能快速識(shí)別并清除入侵機(jī)體的病原微生物，是人體免疫防御的第一道防線(xiàn)，在天然免疫應(yīng)答中，免疫細(xì)胞通過(guò)模式識(shí)別受體(pattern recognit1nreceptors, PRRs)識(shí)別被稱(chēng)為病原相關(guān)分子模式(pathogen-associatedmolecularpatterns, PAMPs)的微生物保守結(jié)構(gòu)，進(jìn)而啟動(dòng)有效的免疫應(yīng)答。
[0010]Toll樣受體是PAMPs的結(jié)合受體，不同的PAMPs可以被不同的TolI樣受體所識(shí)別或組合識(shí)別，然后通過(guò)一系列蛋白質(zhì)級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活轉(zhuǎn)錄因子NF- K B和Jun/Fos等，從而有效地活化天然免疫系統(tǒng)。
[0011]對(duì)于OMVs的免疫學(xué)特性，OMVs含有的脂多糖(LPS)、外膜孔道蛋白(Porin)以及脂蛋白(Lipoprotein)能激發(fā)宿主產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，OMVs通過(guò)PAMPs被Toll樣受體(TLR)識(shí)別，啟動(dòng)下游免疫反應(yīng)，進(jìn)而增強(qiáng)免疫反應(yīng)。
[0012]OMVs被認(rèn)為能有效刺激DCs細(xì)胞成熟并促進(jìn)抗原加工，從而有效的增強(qiáng)免疫應(yīng)技口 ο
[0013]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]通過(guò)PCR擴(kuò)增的方法，獲得天然細(xì)菌的膜錨定蛋白編碼基因序列，通過(guò)基因工程手段，以限制性?xún)?nèi)切酶酶切后連接入原核表達(dá)載體，構(gòu)建成含重組膜錨定蛋白的原核表達(dá)質(zhì)粒。
[0015]在該重組質(zhì)粒的膜錨定序列的3’端以基因工程手段插入外源蛋白的基因序列，以此形成“膜錨定蛋白-外源蛋白”融合表達(dá)的重組質(zhì)粒。
[0016]將此重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌后，在低溫誘導(dǎo)的條件下使外源蛋白正確折疊為可溶性融合蛋白，隨膜牽引蛋白將外源蛋白牽引至細(xì)菌外膜。
[0017]在經(jīng)過(guò)重組表達(dá)后的大腸桿菌形成的OMVs中檢測(cè)到了外源蛋白的存在，并證明存在于OMVs表面，而非內(nèi)腔中。
[0018]多種外源蛋白通過(guò)此方法進(jìn)行表達(dá)，都可以獲得在大腸桿菌OMVs表面的有效呈遞，證明該方法具有普遍適用性。
[0019]在誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)夜后的大腸桿菌培養(yǎng)基上清中制備重組OMVs，OMVs的制備方法如下:
(1)將誘導(dǎo)后的細(xì)菌培養(yǎng)液離心，收獲培養(yǎng)液上清；
(2)將培養(yǎng)液上清進(jìn)行過(guò)濾(0.45 μ m或0.22 μ m濾膜)；
(3)過(guò)濾液用超濾模塊(50-100kDa)進(jìn)行濃縮，濃縮液再次過(guò)濾；
(4)濾過(guò)液進(jìn)行超速離心；
(5)超速離心后沉淀用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌一次后再次超速離心；
(6)離心后沉淀用PBS重懸并再次過(guò)濾；
(7)濾過(guò)液經(jīng)碘克沙醇或蔗糖密度梯度離心，獲得OMVs所在成分。
[0020]作為實(shí)例，我們將一種鮑曼不動(dòng)桿菌的外膜蛋白p22或HPV16型E7蛋白分別成功的呈遞到了 OMVs表面。并通過(guò)呈遞了鮑曼不動(dòng)桿菌的p22蛋白的重組p22-0MVs為例，檢測(cè)了重組OMVs引起的針對(duì)所呈遞外源蛋白的免疫反應(yīng)。
[0021]以p22_0MVs重組蛋白為例，兩次皮下免疫小鼠后小鼠產(chǎn)生了針對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌P22蛋白的抗體水平。
[0022]p22-0MVs免疫后的小鼠免受鮑曼不動(dòng)桿菌的感染，表現(xiàn)為100%的成活率，未免疫組小鼠存活率僅為16.7%。顯示了小鼠針對(duì)OMVs呈遞的外源抗原產(chǎn)生的有效的免疫應(yīng)答，并成功的抵抗了鮑曼不動(dòng)桿菌的感染。
[0023]鮑曼不動(dòng)桿菌感染小鼠后，p22_0MVs免疫后的小鼠較未免疫小鼠中鮑曼不動(dòng)桿菌在各個(gè)組織中的細(xì)菌載量明顯下降，反應(yīng)了 p22-0MVs免疫后小鼠產(chǎn)生了識(shí)別鮑曼不動(dòng)桿菌外膜蛋白P22的抗體，該抗體起到了快速清除小鼠組織中細(xì)菌的作用。
[0024]以上實(shí)例證明了 OMVs呈遞外源蛋白后，免疫動(dòng)物能產(chǎn)生針對(duì)外源蛋白的抗體水平，該抗體的產(chǎn)生不需要借助其他佐劑，并能有效的識(shí)別抗原，有效的防御病原菌入侵，是一種新型的疫苗形式。
【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1顯示了 0MVs-ClyA-p22質(zhì)粒的構(gòu)建圖譜，融合表達(dá)大腸桿菌的膜牽引序列?Ε.coli ClyA)與鮑曼不動(dòng)桿菌的外膜蛋白p22 (Ab 0mp22)，Nde1、BamH1、SalI為限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)。
[0026]圖2顯示了 0MVs-ClyA_p22誘導(dǎo)表達(dá)前后菌體及OMV的圖譜，左圖為菌體樣品電泳，右圖為OMVs樣品電泳，泳道I為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道2為誘導(dǎo)前菌體，泳道3為誘導(dǎo)后菌體，泳道4為未改造的大腸桿菌OMVs，泳道5為呈遞了 p22后的重組OMVs。
[0027]圖3顯示了鮑曼不動(dòng)桿菌外膜蛋白p22在OMVs外側(cè)成功呈遞的Western blot檢測(cè)圖片，泳道I為重組p22-0MVs未經(jīng)處理，泳道2為重組p22-0MVs用蛋白酶K處理，泳道3為重組p22-0MV經(jīng)EDTA處理，泳道4為非重組天然大腸桿菌OMVs，實(shí)驗(yàn)以抗鮑曼不動(dòng)桿菌OMVs的抗體進(jìn)行檢測(cè)，目的是檢測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌的外膜條帶，天然非重組的大腸桿菌OMVs用于檢測(cè)是去除背景反應(yīng)，非特異性反應(yīng)用星號(hào)表示。
[0028]圖4顯示了 HPV16型E7蛋白在OMVs外側(cè)成功呈遞的Western blot檢測(cè)圖片，泳道I為未經(jīng)處理的重組E7-0MVs，泳道2為蛋白酶K處理后的重組E7-0MVs，泳道3為EDTA處理后的重組E7-0MVs，泳道4為蛋白酶K和EDTA同時(shí)處理的重組E7_0MVs，Western blot檢測(cè)使用的抗體為抗HPV16型E7的商品化抗體，購(gòu)自Santa公司。
[0029]圖5顯示了重組0MVs-ClyA_p22的電鏡圖片。
[0030]圖6 顯示了重組 0MVs-ClyA_p22 (p22_0MV)、天然未改造 OMVs (wtOMV)及 PBS (對(duì)照)分別免疫小鼠后，第二次免疫后三周產(chǎn)生的針對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌外膜蛋白P22的抗體應(yīng)答水平。
[0031]圖7顯示了分別經(jīng)重組0MVs-ClyA_p22 (p22_0MV)及PBS (對(duì)照)免疫后的小鼠，腹腔感染鮑曼不動(dòng)桿菌后的存活率。
[0032]圖8顯示了分別經(jīng)重組0MVs-ClyA_p22 (p22_0MV)及PBS (對(duì)照)免疫后的小鼠，經(jīng)鮑曼不動(dòng)桿菌感染12小時(shí)后小鼠各器官中的鮑曼不動(dòng)桿菌載量情況。
[0033]SEQ ID NOl為本發(fā)明中列舉的耐藥大腸桿菌ClyA基因序列。
[0034]SEQ ID N02為本發(fā)明中列舉的鮑曼不動(dòng)桿菌p22基因序列。
[0035]SEQ ID N03為本發(fā)明中列舉的HPV16型E7基因序列。
【具體實(shí)施方式】
[0036]通過(guò)以下實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明，以便本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明。下述實(shí)施例僅僅出于示范性目的，并非意在限制本發(fā)明的范圍。已經(jīng)努力確保有關(guān)數(shù)字的準(zhǔn)確性，但應(yīng)該考慮到會(huì)存在一些誤差和偏差。
實(shí)施例
[0037]實(shí)施例1 = OMVs-ClyA重組質(zhì)粒的構(gòu)建
以ClyA膜牽引蛋白為例，將臨床獲取的大腸桿菌過(guò)夜培養(yǎng)，待菌體生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期(0D=0.4-0.6)，取菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增引物為ClyA-S:5，-CATATGACTGAAATCGTTGCAGATA-3’ ；ClyA_A:5，-GGATCCGACTTCAGGTACCTCA-3，；PCR 體系具體為:菌液:2 μ L ；ClyA-A:2 μ L ;ClyA_S:2 μ L ；dNTP:2 μ L ；Taq 連接酶:0.25 μ L ；10 X Taq連接酶buffer:2.5 yL;無(wú)酶水:14.25 μ L0 PCR程序?yàn)?①94 °C預(yù)變性5分鐘；②變性94°C，30秒；退火56°C，30秒；延伸72°C，I分鐘，循環(huán)35次；③最后延伸72°C，10分鐘。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收(北京天根生物)，回收產(chǎn)物以T-A連接至pMD19T-simple載體(Takara公司)，連接體系為:pMD19T_simple載體:0.5yL ;片段:4.4yL ;T4連接酶:0.5yL;T4連接酶buffer:0.6yL。16°C連接過(guò)夜。將連接后的重組子轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆以T載體測(cè)序引物進(jìn)行鑒定。將pTh1HisA原核表達(dá)載體(Invitrogen公司)及陽(yáng)性重組質(zhì)粒以限制性?xún)?nèi)切酶(Takara公司)NdeI及BamHI進(jìn)行雙酶切，酶切體系為:載體 / 質(zhì)粒:13yL ；NdeI 酶:2yL ；BamHI:2yL ；10XT buffer:3 μ L，37°C酶切3小時(shí)。膠回收酶切產(chǎn)物后加入DNA連接酶(Takara公司)進(jìn)行連接，連接體系為:ClyA 片段:4.7 μ L ；pTh1HisA 載體:0.2 μ L ；DNA 連接酶:0.5 μ L ；DNA 連接酶 buffer:0.6 μ L，16°C連接過(guò)夜。將DNA連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆并測(cè)序鑒定。最終獲得PTh1HisA-ClyA重組質(zhì)粒作為基礎(chǔ)牽引質(zhì)粒。
[0038]實(shí)施例2:0MVs-ClyA-X外源蛋白基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建
外源蛋白基因X以鮑曼不動(dòng)桿菌蛋白P22基因序列及HPV16型E7蛋白基因序列為例說(shuō)明。收獲鮑曼不動(dòng)桿菌臨床菌株，以PCR引物p22-S:5’ -GGATCCATGCGTGCATTAGTTAT-3’及 P22-A:5’_ GTCGACTTATTGTTTAGCATAAATGCT-3’ 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，獲得鮑曼不動(dòng)桿菌 p22 蛋白的基因序列；或以全基因合成的方式合成HPV16型E7基因并帶有BamHI及SalI酶切位點(diǎn)。將外源基因序列及重組PTh1HisA-ClyA質(zhì)粒同時(shí)以BamHI及SalI進(jìn)行雙酶切，回收酶切目的片段，以DNA連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5 α，篩選陽(yáng)性克隆后測(cè)序鑒定。最終獲得pTh1HisA-ClyA-p22或PTh1HisA-ClyA-E7重組質(zhì)粒，具體實(shí)驗(yàn)步驟同實(shí)施例1。
[0039]實(shí)施例3:0MVs-ClyA-X重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)條件
將成功轉(zhuǎn)入了攜帶牽引序列及外源序列重組質(zhì)粒的大腸桿菌DH5a進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，具體方法為，將100-200 μ L陽(yáng)性重組克隆的甘油菌接種至已加入氨芐西林(100mg/mL)的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)16小時(shí)后以1:5的比例轉(zhuǎn)接菌液進(jìn)入新的帶氨芐西林的LB培養(yǎng)基中，待菌株生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，加入IPTG (lmmol/L)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，控制誘導(dǎo)表達(dá)溫度為20_30°C，低溫誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)夜。
[0040]實(shí)施例4:重組OMVs的制備及純化
將誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)夜后的樣品以室溫14000g離心10分鐘，收集培養(yǎng)基上清，將培養(yǎng)基上清通過(guò)0.45或0.22 μ m的濾膜去除菌體。濾過(guò)液以50kDa或10kDa的超濾模塊進(jìn)行超濾濃縮，濃縮液再次通過(guò)0.45或0.22 μ m的濾膜，濾過(guò)液以4°C、200000g超速離心4小時(shí)，收獲離心后沉淀樣品，將沉淀以PBS重懸，重懸液再次通過(guò)0.45或0.22 μ m的濾膜。將該濾過(guò)液進(jìn)行體積比為27%、33%和39%的碘克沙醇密度梯度離心，收獲OMVs所在成分即獲得純化的重組OMVs。
[0041]實(shí)施例5:外源蛋白在OMVs表面成功呈遞的檢測(cè)
由于OMVs本身由很多外膜蛋白組成，受到大量OMVs本身蛋白質(zhì)的影響，通過(guò)SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)染色不能通過(guò)分子量大小來(lái)清晰的分辨外源蛋白的遞呈情況，因此，通過(guò)Western blot的方法以免疫學(xué)檢測(cè)OMVs上外源蛋白的呈遞情況是有效的手段。以鮑曼不動(dòng)桿菌外膜蛋白P22呈遞為例，將成功呈遞了鮑曼不動(dòng)桿菌p22蛋白的大腸桿菌OMVs(p22-0MVs)及未重組的大腸桿菌OMVs進(jìn)行檢測(cè)，為了分辨呈遞的外源抗原是在OMVs內(nèi)腔還是在OMVs的表面，以工作濃度為100 μ g/mL的蛋白酶K (PK)37°C過(guò)夜消化來(lái)處理OMVs，消化OMVs表面蛋白；也以工作濃度為0.lmol/L的EDTA處理打開(kāi)OMVs的結(jié)構(gòu)，使內(nèi)腔的蛋白得以釋放，檢測(cè)OMVs內(nèi)腔是否有外源蛋白。結(jié)果顯示鮑曼不動(dòng)桿菌的p22蛋白被呈遞于大腸桿菌OMVs表面，而非內(nèi)腔。同樣我們以呈遞HPV16型E7蛋白在大腸桿菌OMVs為例，也證明了 E7蛋白成功的呈遞在OMVs的表面，而非內(nèi)腔。
[0042]實(shí)施例6:重組OMVs的動(dòng)物免疫以呈遞鮑曼不動(dòng)桿菌蛋白p22為例證明以重組的p22-0MVs免疫能夠產(chǎn)生針對(duì)p22的抗體水平。將重組的p22-0MVs以50 μ g總蛋白劑量(Bradford染色測(cè)定法)進(jìn)行免疫ICR小鼠，分別在O天、14天進(jìn)行兩次皮下免疫，不加入佐劑。小鼠飼養(yǎng)在SPF級(jí)別的環(huán)境中。最后一次免疫后3周采血進(jìn)行抗體水平的ELISA檢測(cè)，ELISA檢測(cè)時(shí)抗原包被為1ug鮑曼不動(dòng)桿菌外膜蛋白P22或鮑曼不動(dòng)桿菌OMVs。結(jié)果證明經(jīng)p22-0MVs免疫后，小鼠產(chǎn)生了針對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌OMVs以及鮑曼不動(dòng)桿菌p22蛋白的抗體水平。
[0043]實(shí)施例7:重組OMVs呈遞蛋白的活性驗(yàn)證
為了驗(yàn)證重組OMVs呈遞外源蛋白的活性，我們進(jìn)行了 p22-0MVs免疫小鼠后的細(xì)菌感染實(shí)驗(yàn)。p22-0MVs免疫兩次后的小鼠，在最后一次免疫后三周進(jìn)行鮑曼不動(dòng)桿菌的腹腔感染，以I X 16CFU濃度的鮑曼不動(dòng)桿菌混合10%的豬粘液素(Sigma公司)通過(guò)腹腔感染小鼠，感染后的7天對(duì)小鼠進(jìn)行連續(xù)觀(guān)察，并記錄小鼠存活率，結(jié)果顯示經(jīng)p22-0MVs免疫后的小鼠免受鮑曼不動(dòng)桿菌感染，存活率為100%。將小鼠的肺、脾、肝、腎取出稱(chēng)重，研磨并梯度稀釋后涂布于氨芐抗生物素的LB平板，檢查各器官中的細(xì)菌數(shù)(CFU)，結(jié)果顯示p22-0MVs免疫后的小鼠在多器官中的鮑曼不動(dòng)桿菌菌體載量明顯下降，證明了呈遞于大腸桿菌OMVs表面的鮑曼不動(dòng)桿菌P22蛋白免疫后產(chǎn)生了針對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的抗體，并清除鮑曼不動(dòng)桿菌感染。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.來(lái)自于大腸桿菌生長(zhǎng)狀態(tài)下分泌的外膜囊泡(OMVs)，其特征在于，可以通過(guò)基因工程手段以一種外膜錨定蛋白將異源蛋白牽引至OMVs表面，以此重組OMV免疫動(dòng)物時(shí)，動(dòng)物能產(chǎn)生針對(duì)表面呈遞蛋白的免疫應(yīng)答。2.權(quán)利要求1中所述異源蛋白，其特征為，可以作為疫苗靶點(diǎn)的單獨(dú)蛋白，包括本發(fā)明中顯示的鮑曼不動(dòng)桿菌外膜蛋白p22及HPV16型E7蛋白。3.權(quán)利要求1中所指的基因工程手段，其特征為，在大腸桿菌中導(dǎo)入原核表達(dá)質(zhì)粒，該質(zhì)粒能在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)一種細(xì)菌外膜錨定蛋白-外源蛋白復(fù)合物，經(jīng)表達(dá)該融合蛋白后，就可以將該外源蛋白呈遞于OMVs表面，而非內(nèi)腔。4.權(quán)利要求3中所述細(xì)菌外膜錨定蛋白，其特征為，該蛋白具有定位于細(xì)菌外膜的特性，包括一些天然的外膜蛋白分子，如OmpA、OmpW、ClyA等。5.權(quán)利要求4中所述ClyA蛋白，其特征為，其基因序列由臨床大腸桿菌中分離獲得，該基因全長(zhǎng)表達(dá)后將定位于大腸桿菌外膜。6.權(quán)利要求3中所述融合的膜錨定蛋白-外源蛋白復(fù)合物，其特征為融合表達(dá)后正確折置為可溶性蛋白。7.權(quán)利要求1中所述的免疫動(dòng)物，其特征為，在免疫過(guò)程中，不需要額外添加任何佐劑。8.權(quán)利要求1中所述免疫反應(yīng)，其特征為，針對(duì)呈遞在OMVs表面上的外源蛋白的體液免疫應(yīng)答。9.如前述權(quán)利要求中任意一項(xiàng)所述重組OMVs其應(yīng)用為新型疫苗載體。
【文檔編號(hào)】A61P31/04GK105861402SQ201510424483
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2015年7月20日
【發(fā)明人】馬雁冰, 黃惟巍, 姚宇峰, 王世杰
【申請(qǐng)人】中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所