專利名稱：修飾的腦膜炎球菌fHBP多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是針對(duì)奈瑟球菌屬，如腦膜炎奈瑟球菌致病菌導(dǎo)致疾病的免疫。
背景技術(shù)：
腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)是一種革蘭陰性莢膜菌,寄居在大約10%人群上呼吸道中。雖然已有針對(duì)A、C、W135和Y血清群的多糖和偶聯(lián)疫苗，但疫苗不能應(yīng)用于血清群B，因?yàn)槠淝v膜多糖是一種多聚唾液酸的聚合物，是人類的一種自身抗原。為了開(kāi)發(fā)針對(duì)血清群B的疫苗，已采用了外膜囊泡(OMV)包含的表面暴露蛋白。這些疫苗 能誘導(dǎo)產(chǎn)生血清殺菌抗體應(yīng)答和抵抗疾病，但不能誘導(dǎo)菌株間交叉保護(hù)作用[I]。因此，一些研究人員專注于可用于疫苗的特異性腦膜炎球菌抗原[2]。一種這樣的抗原是腦膜炎H因子結(jié)合蛋白(fHBP)，也稱作蛋白‘741’ [文獻(xiàn)3中的 SEQ IDs 2535 & 2536 ;本文的 SEQ ID I], ‘NMB1870’，‘GNA1870’ [文獻(xiàn) 4-6，以下文獻(xiàn)2]，‘P2086’，‘LP2086’或‘0RF2086’ [7-9] 0這種脂蛋白在所有腦膜炎球菌血清群中都有表達(dá)，見(jiàn)于多種腦膜炎球菌株，已將fHBP序列分為三個(gè)家族[4](在本文中稱為家族I、II和III)，已發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生的對(duì)某給定家族血清對(duì)同一家族有殺細(xì)菌活性，但對(duì)表達(dá)其它兩個(gè)家族之一的菌株無(wú)活性，即具有家族內(nèi)、而非家族間交叉保護(hù)作用。

發(fā)明內(nèi)容
使fHBP結(jié)合fH的能力與其免疫原性解離可產(chǎn)生改良的抗原。例如，fHBP表面上的重要表位可能在體內(nèi)結(jié)合fH后被隱藏躲開(kāi)了免疫系統(tǒng)。相反，宿主蛋白與疫苗組分的高親和性結(jié)合在一些對(duì)象中可能導(dǎo)致意想不到的疫苗接種后果。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供經(jīng)過(guò)修飾結(jié)合fH能力比野生型fHBP減弱但保留了誘導(dǎo)殺菌性抗fHBP抗體能力的fHBP。文獻(xiàn)10已經(jīng)鑒定了 fHBP/fH相互作用中的幾個(gè)重要?dú)埢?。例如，野生型的兩個(gè)谷氨酸殘基突變使該蛋白對(duì)fH的親和力降低了兩個(gè)數(shù)量級(jí)。然而，文獻(xiàn)10沒(méi)有公開(kāi)這些改變對(duì)fHBP免疫原性的影響。然而如本文所示，表達(dá)這二個(gè)Glu突變的細(xì)菌對(duì)野生型fHBP誘導(dǎo)的殺菌性抗體敏感。因此，有可能使fHBP的H因子結(jié)合活性與其殺菌敏感性解離。菌株MC58的全長(zhǎng)fHBP氨基酸序列(SEQ ID NO 1)如下MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRI⑶IAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ
該序列是fHBP家族I的序列。此成熟的脂蛋白缺少SEQ ID NO :1前19個(gè)氨基酸(SEQ ID NO :4)，而fHBP的AG形式缺少前26個(gè)氨基酸(SEQ ID NO 7)菌株2996的全長(zhǎng)fHBP氨基酸序列(SEQ ID NO 2)如下 MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ該序列是fHBP家族II的序列。此成熟的脂蛋白缺少SEQ ID NO :1前19個(gè)氨基酸(SEQ ID NO :5)，而fHBP的AG形式缺少前26個(gè)氨基酸(SEQ ID NO 8)。菌株M1239的全長(zhǎng)fHBP氨基酸序列(SEQ ID NO 3)如下
MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSIPQNGTLTLSAQGAEKTFKA⑶KDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ該序列是fHBP家族III的序列。此成熟的脂蛋白缺少SEQ ID NO :1前19個(gè)氨基酸(SEQ ID NO :6)，而fHBP的AG形式缺少前31個(gè)氨基酸(SEQ ID NO 9)。NMR研究鑒定了參與fHBP/fH相互作用的各個(gè)氨基酸殘基。因此，可修飾SEQ IDNO :4、5和6各自中以下編號(hào)的一個(gè)或多個(gè)殘基，以抑制fH/fHBP相互作用
權(quán)利要求
1.一種多肽，其特征在于，包含(a)與SEQID NO :4，5或6任一序列至少90%相同的氨基酸序列和/或包含SEQ ID NO :4，5或6的片段；但(b)其中以下所示SEQ ID NO :4、5或6序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基缺失或被不同氨基酸取代
2.如權(quán)利要求I所述的多肽，其特征在于，包含與SEQID NO 4具有至少90%相同的氨基酸序列，和/或包含SEQ ID NO :4的片段，和給予宿主動(dòng)物后可引發(fā)能識(shí)別含SEQ IDNO 4序列的野生型腦膜炎多肽的抗體。
3.一種設(shè)計(jì)修飾的fHBP氨基酸序列的方法，其特征在于，包括步驟(i)提供起始氨基酸序列，其中含有該起始氨基酸序列或由其組成的蛋白能結(jié)合人H因子；(ii)采用配對(duì)序列比對(duì)算法鑒定該起始氨基酸序列內(nèi)與權(quán)利要求I表格中所列SEQ ID NO :4、5或6的殘基相對(duì)的氨基酸殘基；(iii)刪除步驟(ii)所述鑒定的氨基酸或用不同的氨基酸置換，從而提供修飾的fHBP氨基酸序列。
4.一種多肽，其特征在于，包含(i)用權(quán)利要求3所述方法設(shè)計(jì)的修飾的fHBP氨基酸序列，或( )選自SEQ ID NO :23-32序列的氨基酸序列。
5.一種核酸，其特征在于，編碼權(quán)利要求I、權(quán)利要求2或權(quán)利要求4所述的多肽。
6.一種包含編碼權(quán)利要求1、2或4任一項(xiàng)所述多肽的核苷酸序列的質(zhì)粒。
7.一種用權(quán)利要求6所述的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞是腦膜炎球菌。
9.權(quán)利要求8所述宿主細(xì)胞制備的膜囊泡，其特征在于，所述囊泡包含權(quán)利要求1、2或4任一項(xiàng)所述的多肽。
10.一種免疫原性組合物，其特征在于，包含權(quán)利要求1、2或4所述的多肽，或權(quán)利要求9所述的囊泡。
11.如權(quán)利要求10所述的組合物，其特征在于，包括佐劑。
12.如權(quán)利要求11所述的組合物，其特征在于，所述佐劑包括鋁鹽。
13.如權(quán)利要求10-12任何一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，還包含第二多肽，在給予哺乳動(dòng)物時(shí)，可引發(fā)對(duì)腦膜炎球菌的殺菌抗體應(yīng)答反應(yīng)，限制條件是所述第二多肽不是腦膜炎球菌的fHBP。
14.如權(quán)利要求10-13任何一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，還包含腦膜炎奈瑟球菌血清群A、C、W135和/或Y的偶聯(lián)莢膜糖。
15.如權(quán)利要求10-14任何一項(xiàng)所述的組合物，其特征在于，還包含偶聯(lián)的肺炎球菌莢月旲糖。
16.一種引發(fā)哺乳動(dòng)物抗體應(yīng)答的方法，其特征在于，包括給予權(quán)利要求10-15任何一所述的免疫原性組合物。
全文摘要
可使腦膜炎球菌fHBP的H因子結(jié)合活性與其殺菌敏感性分開(kāi)。NMR研究鑒定了參與fHBP/H相互作用的多個(gè)氨基酸殘基，修飾fHBP中這些殘基的一個(gè)或多個(gè)可降低或消除其結(jié)合fH的能力。
文檔編號(hào)C07K14/22GK102917730SQ201080060450
公開(kāi)日2013年2月6日 申請(qǐng)日期2010年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月27日
發(fā)明者L·班西, F·坎蒂尼, S·德拉戈內(nèi)蒂, M·A·簡(jiǎn)蒂萊, D·維吉, M·斯卡塞利, M·皮薩 申請(qǐng)人:諾華有限公司