一株黃單胞菌nyw79及其用圖
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種黃單胞菌(Xanthomonas sp.)NYW79及其用途。使用NYW79菌株生產(chǎn)無色素黃原膠的步驟包括活化培養(yǎng)、液體種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)與黃原膠沉淀等步驟。使用NYW79菌株生產(chǎn)黃原膠的產(chǎn)量比誘變出發(fā)NY07菌株提高14.9％以上；發(fā)酵液的OD值降低77.1％以上，由NYW79菌株生產(chǎn)黃原膠能夠從根本上解決黃原膠產(chǎn)品的脫色問題，同時黃原膠多糖產(chǎn)量也非常顯著提高。CGMCC No1262020160616
【專利說明】一株黃單胞菌NYW79及其用途 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及一株黃單胞菌 (Xanthomonas sp · )NYW79,還涉及黃單胞菌NYW79的用途。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 黃原膠(xanthan gum)是野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)以碳水化合 物為主要原料，經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生的一種微生物胞外雜多糖，其分子由D-葡萄糖、D-甘露糖、D-葡 萄糖醛酸、乙酸和丙酮酸構(gòu)成。黃原膠有許多獨特的理化性能，主要表現(xiàn)在顯著的假塑性、 良好的增稠性、較好的乳化穩(wěn)定性、低濃度時的高黏度、對固體懸浮能力強以及較寬的耐溫 性、耐凍融性、耐酸堿性等。它作為增稠劑、乳化劑、品質(zhì)改良劑、懸浮劑廣泛應(yīng)用于食品工 業(yè)，在食品添加劑中占據(jù)相當(dāng)重要的位置。
[0003] 黃單胞菌(Xanthomonas campestris)是革蘭氏陰性菌，專性好氧，細胞直桿狀，大 小0.4~I .OymX 1.2~3.Ομπι，單端極生鞭毛，菌落圓形、光滑、全緣、乳脂狀。在培養(yǎng)基上菌 株分泌具有非類胡蘿卜素性質(zhì)的不溶于水的黃色素，其化學(xué)成分為溴芳基多烯，使菌落呈黃 色，生長初期為淡黃色，后期為蠟黃色。它作為菌種生產(chǎn)莢膜多糖，即黃原膠。由于這種菌株 分泌具有非類胡蘿卜素性質(zhì)的不溶于水的黃色素，因此在生產(chǎn)中需要使用足夠量的溶劑脫 去部分色素，但這種溶劑耗量大，操作費工費時，生產(chǎn)成本高，在生產(chǎn)中為了控制黃單胞菌 色素形成，往往以縮短生長周期方式減少色素合成，這樣又往往影響產(chǎn)品得率和產(chǎn)品質(zhì)量。 由于黃原膠發(fā)酵液粘度高，使后處理非常困難，其中去除菌體細胞色素是提取工藝中的一 大障礙。因此，解決產(chǎn)品外觀顏色的有效方法是降低黃單胞菌色素合成。
[0004] 亞硝基胍作用方式主要是誘發(fā)GC-AT的轉(zhuǎn)換，它能氧化脫去A、G和C的氨基，使A轉(zhuǎn) 變HX(次黃嘌呤）、C_轉(zhuǎn)變U(尿嘧啶）、由于所形成的新堿基改變了原來堿基的性質(zhì)，再復(fù)制 時就會引起A: T-G: C的轉(zhuǎn)換，G: C-A: T的轉(zhuǎn)換而造成突變。亞硝基胍除了有較強的誘變作 用外，還能誘發(fā)鄰近位置基因的并發(fā)突變，而且特別容易誘發(fā)DNA復(fù)制叉附近的基因突變， 隨著復(fù)制叉的移動，它的作用位置也隨著移動，某些誘變菌株可能會造成某些基因改變或 者缺陷。
[0005] 本發(fā)明針對黃原膠工業(yè)化生產(chǎn)的脫色技術(shù)問題，以傳統(tǒng)的含有色素的黃單孢桿菌 NY07為出發(fā)菌株，利用亞硝基胍誘變、篩出一株無色素的黃單孢桿菌菌株NYW79,并進一步 研究了其在工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)中的黃原膠生產(chǎn)能力，從根本上解決黃原膠產(chǎn)品的脫色問題。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0006] [要解決的技術(shù)問題]
[0007] 本發(fā)明的目的是提供一株黃單胞菌(Xanthomonas sp.)NYW79。
[0008] 本發(fā)明的另一個目的是提供所述黃單胞菌(Xanthomonas sp. )NYW79的用途。
[0009] [技術(shù)方案]
[0010] 本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)的。
[0011 ] 本發(fā)明涉及一株黃單胞菌(Xanthomonas sp. )NYW79，該菌株已于2016年06月16日 在北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心保藏，其保藏號為CGMCC No 12620。
[0012] 本發(fā)明還涉及所述的黃單胞菌NYW79在生產(chǎn)無色素黃原膠中的用途。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方式，生產(chǎn)無色素黃原膠的步驟如下：
[0014] A、活化培養(yǎng)
[0015]挑取一環(huán)斜面保藏黃單胞菌NYW79菌種接種到茄瓶斜面培養(yǎng)基中，在溫度30°C下 培養(yǎng)72h，斜面菌種奶白色，斜面菌苔顏色明顯低于出發(fā)菌株顏色，得到活化黃單胞菌NYW79 菌種；
[0016] B、液體種子培養(yǎng)
[0017] 按照使用的種子培養(yǎng)基重量計1~3%，將步驟A得到的活化黃單胞菌NYW79菌種接 種于種子培養(yǎng)基中，在搖床中在溫度30°C下培養(yǎng)18小時，得到黃單胞菌NYW79菌種發(fā)酵液；
[0018] C、發(fā)酵培養(yǎng)
[0019] 按照以使用的發(fā)酵培養(yǎng)基重量計4~10重量％，將步驟B)得到的黃單胞菌NYW79菌 種發(fā)酵液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度32~33°C下發(fā)酵培養(yǎng)26小時，接著往所述的發(fā)酵培 養(yǎng)基中添加淀粉作為碳源，在溫度29~3TC下繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)27~48小時，然后在溫度28°C 下發(fā)酵培養(yǎng)直至發(fā)酵結(jié)束；
[0020] D、黃原膠沉淀
[0021]將步驟C得到的發(fā)酵液離心沉淀，往上清液中加入濃度為以體積計20%乙醇溶液 按照體積比1:1.8~2.2混合均勻，再加入以發(fā)酵液體積計0.5%氯化鈣溶液，在斬拌罐中處 理20min，再離心分離，往得到的沉淀物中加入以其體積計30%乙醇，混合后加入無機堿液 將其PH調(diào)節(jié)至7.50,接著用離心機進行固液分離，得到的沉淀物在溫度85°C下烘干，得到所 述的無色素黃原膠。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，在步驟A中，所述的斜面培養(yǎng)基制備方法如 下:將0.8~1.2重量份蔗糖、0.06~0.10重量份蛋白胨、0.08-0.12重量份酵母浸汁、0.4~ 0.6重量份牛肉膏、1~3重量份瓊脂、0.1~0.3重量份K 2HP〇4 · 3H20、0.08~0.12重量份NaCl 與0.08~0.12重量份MgS〇4溶于100重量份水中，攪拌均勻，再使用無機酸或無機堿水溶液 將其PH值調(diào)節(jié)到7.0，再在溫度121°C下滅菌30min，得到所述的斜面培養(yǎng)基。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，在步驟B中，所述的種子培養(yǎng)基制備方法如 下:0.8~1.2重量份葡萄糖、0.06~0.10重量份蛋白胨、0.08~0.12重量份酵母浸汁、0.4~ 0·6重量份牛肉膏、0· 1~0·3重量份K2HPO4 · 3H20、0·08~0· 12重量份NaCl與0·08~0· 12重 量份MgSO4溶于100重量份水中，攪拌均勻，再使用無機酸或無機堿水溶液將其pH值調(diào)節(jié)到 7.0,再在溫度121°C下滅菌30分鐘，得到所述的種子培養(yǎng)基。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，在步驟C中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基制備方法如 下:0.6~1.0重量份葡萄糖、0.6~1.0重量份酵母粉、0.04~0.06重量份NH4NO3、0.01~0.03 重量份K 2HPO4 · 3H20溶于100重量份水中，攪拌均勻，再使用無機酸或無機堿水溶液將其pH 值調(diào)節(jié)到7.0,再在溫度121°C下滅菌30分鐘，得到所述的發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，所述的無機酸是硝酸、硫酸或鹽酸;所述的無 機堿是氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉或碳酸鉀。
[0026]根據(jù)本發(fā)明的另一種優(yōu)選實施方式，在步驟C中，淀粉添加量是所述發(fā)酵培養(yǎng)基重 量的4~6%。
[0027]下面將更詳細地描述本發(fā)明。
[0028]本發(fā)明通過改變傳統(tǒng)菌株基因缺陷來改變菌種的生理特性，降低菌株合成色素能 力，同時避免了基因工程改良菌種帶來的外援DNA問題，在應(yīng)用到醫(yī)藥、食品、日化等領(lǐng)域具 有一定的安全性，從根本上解決了產(chǎn)品的脫色問題。
[0029] 本發(fā)明涉及一株黃單胞菌(Xanthomonas sp· )NYW79，該菌株已于2016年06月16日 在北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心保藏，其保藏號為CGMCC No 12620。
[0030] 本發(fā)明具有色素缺陷型黃單胞菌NYW79菌株(Xanthomonas SP.NYW79)是利用亞硝 基胍誘變由黃單胞菌NY07(Xanthomonas campestris NY07)出發(fā)菌株得到的，菌株分類命 名為野油菜黃單胞菌NY07樣本保藏于內(nèi)蒙古自治區(qū)鄂爾多斯市達拉特旗三坰梁工業(yè)園區(qū) 煒五路8號鄂爾多斯市中軒生化股份有限公司。
[0031] 采用亞硝基胍誘變由NY07菌株誘變獲得黃色素缺陷型黃單孢桿菌NYW79的步驟如 下：
[0032] (1)菌種活化
[0033]按照以使用的種子培養(yǎng)基重量計1 %的接種量，將在溫度5 °C下保存的NY07菌株接 種在蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上，在溫度30 °C下恒溫培養(yǎng)72h，在斜面長出黃色菌體；
[0034]所述的蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基是采用下述方法制備得到的：
[0035]將IOg鹿糖、5g蛋白胨、2g氯化鈉、3g牛肉膏、0.5g酵母膏與20g瓊脂溶于1000 ml水 中，再使用常見無機酸或無機堿水溶液將其PH值調(diào)節(jié)至7.0,然后在溫度121°C下滅菌 30min，得到所述的蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。
[0036] (2)制備NY07菌株菌懸液
[0037]按照以使用的種子培養(yǎng)基重量計1 %的接種量，把上述培養(yǎng)的NY07菌株接種在牛 肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中在溫度30 °C與搖床轉(zhuǎn)速220rpm的條件下恒溫培養(yǎng)18h，如此傳代培養(yǎng)2 次，澄清液體培養(yǎng)基變渾濁達到對數(shù)期(OD = 1.1-1.2)。
[0038]所述的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是采用下述方法制備得到的：
[0039]將IOg葡萄糖、5g蛋白胨、2g氯化鈉、3g牛肉膏與0.5g酵母膏溶于1000 ml水中，再使 用常見無機酸或無機堿水溶液將其pH值調(diào)節(jié)至7.0,然后在溫度121°C下滅菌30min，得到所 述的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。
[0040] (3)菌懸液制備
[0041] 將步驟(2)得到的培養(yǎng)物進行離心分離，收集的菌體用濃度為以重量計0.85%的 生理鹽水洗滌兩次，然后收集的菌體使用同樣的生理鹽水制成l(T 7CfU/ml菌懸液，菌落計數(shù) 作為對照。
[0042] (4)亞硝基胍(NTG)誘變
[0043]亞硝基胍水溶液的配制:采用常規(guī)方法配制濃度為0.1g/ml的亞硝基胍水溶液，然 后讓其亞硝基胍水溶液經(jīng)0.22μπι膜過濾進行滅菌，接著置于溫度5 °C下保存。
[0044]往步驟(3)得到的菌懸液中加入滅菌的亞硝基胍水溶液，使其終濃度達到0.4mg/ ml，接著在溫度30°C與搖床轉(zhuǎn)速200rpm的條件下分別處理50min、60min、70min、80min、 90min、IOOmin、I IOmin，進行菌落平板計數(shù)測定菌數(shù)，并按照下式計算致死率： 未經(jīng)誘變菌落數(shù)-經(jīng)過誘變菌落數(shù)
[0045] 致死率=--X 100% 未經(jīng)誘變菌落數(shù)
[0046] 亞硝基胍(NTG)誘變處理結(jié)果列于表1與附圖3中：
[0047] 表1:NTG誘變處理時間與致死率測定結(jié)果
[0049] 往步驟（3)得到的菌懸液中分別加入0 · 2mg/ml、0 · 3mg/ml、0 · 4mg/ml、0 · 5mg/ml、 0.6mg/ml不同濃度NTG誘變處理，致死率結(jié)果參見附圖3。
[0050] 由附圖1知道，經(jīng)0.4mg/ml亞硝基胍誘變90min，該菌株的致死率達80 %~90%，因 此確定0.4mg/ml濃度為最佳誘變劑量。
[0051] 本發(fā)明利用濃度為0.4-0.6mg/ml亞硝基胍誘變具有色素缺陷型黃單孢桿菌獲得 無色素的黃單孢桿菌菌株NYW79。亞硝基胍濃度對于控制色素缺陷型黃單胞菌起著非常重 要的作用，當(dāng)亞硝基胍濃度過低時，對控制平板上耐亞硝基胍菌落的數(shù)量不明顯，當(dāng)亞硝基 胍濃度過高時，會抑制耐亞硝基胍菌落的生長。
[0052]經(jīng)過誘變的菌株在溫度30°C的條件下以1.0X l(T7CfU/ml平板培養(yǎng)72h，目測挑取 菌落白色、圓形、凸起、光滑濕潤、黏連度高的菌落在蛋白胨瓊脂固體培養(yǎng)基平板上反復(fù)劃 線純化，挑取挑取109株突變株(NYW)。
[0053] (5)誘變菌株篩選
[0054]將挑選的109株誘變菌株在搖瓶發(fā)酵進行連續(xù)傳代培養(yǎng)，每傳一代都進行黃原膠 合成測試與色度測試，觀察其穩(wěn)定性。
[0055]將誘變菌株在含有以重量計4 %淀粉、0.50 %大豆蛋白粉與0.2 % CaCO3的發(fā)酵液在 溫度30°C與搖床轉(zhuǎn)速220rpm的條件下培養(yǎng)72h，采用Brook field旋轉(zhuǎn)粘度計，食品添加劑 黃原膠GB13886-2007標(biāo)準(zhǔn)方法測定其粘度，采用100g發(fā)酵液沉淀物65°C干燥3小時標(biāo)準(zhǔn)方 法測定得率，采用以蒸餾水為空白，掃描波長，波長調(diào)至最大透光率（500nm)，將發(fā)酵液在 6000r/min離心15min去菌體，用分光光度計在此波長下測定上清液吸光度的方法測定色素 指標(biāo)，其測定結(jié)果列于下表2中。
[0056]表2:出發(fā)菌株與誘變菌株發(fā)酵液測定結(jié)果
[0058] 表2的結(jié)果清楚地表明，在這些誘變菌株中，NYW79誘變菌株粘度、得率較高，而發(fā) 酵液色素較低。
[0059] NYW79誘變菌株在同樣條件下進行多次傳代培養(yǎng)，其粘度、得率與色度測試結(jié)果列 于表3中。
[0060] 表3: NYW79誘變菌株遺傳穩(wěn)定性試驗結(jié)果
[0062]由表3的結(jié)果可以清楚地知道，NYW79誘變菌株遺傳穩(wěn)定性良好，適宜于實際應(yīng)用。 篩選初始菌株為產(chǎn)膠能力強的菌株NY07,它的初始產(chǎn)膠能力為3.42(g)，折光度0.48(吸光 度的標(biāo)度是對數(shù)函數(shù)值越大被測物質(zhì)顏色越深）。以〇. 4g/L亞硝基胍處理90min誘變?nèi)危?得到一株NYW79誘變菌株，它的產(chǎn)膠能力為3.94(g)，折光度0.11。色素合成能力減弱或者稱 為缺失，膠體合成能力提高14.9 %，無色素黃原膠。
[0063] (6)NYW79菌株的低溫冷凍真空保存
[0064]按照1 %的接種量，將最終篩選出的NYW79菌株接種到蛋白胨培養(yǎng)基中，在溫度30 °C下培養(yǎng)18h，離心分離，收集菌體，這種菌體用PBS緩沖液洗滌兩次，加入凍干燥保護劑在 低溫下凍干保存。
[0065] NYW79菌株的形態(tài)學(xué)特征:革蘭氏陰性菌，專性好氧，細胞直桿狀，大小0.4~1.0 ym X 1.2~3.Ομπι，單端極生鞭毛，菌株形成孢外莢膜多糖一黃原膠。菌落圓形、光滑、全緣、乳 脂狀，奶白色。
[0066] NYW79菌株的培養(yǎng)特性:在HE瓊脂培養(yǎng)基30°C下培養(yǎng)72h，斜面菌種奶白色，在葡萄 糖、蛋白胨、酵母浸汁、牛肉膏、K2HP〇4 · 3H20、NaClMgS〇4的種子培養(yǎng)基中菌種生長18h達到 對數(shù)生長期，該培養(yǎng)基利于菌體生長。在葡萄糖、酵母粉、NH4N〇3、K 2HP〇4 · 3H20、淀粉的發(fā)酵 培養(yǎng)基中菌體生長莢膜。
[0067] NYW79菌株的代謝特性:該菌為有機化能異養(yǎng)菌，專性好氧最適溫度28-32°C，在溫 度rc以下無一能生長，在溫度40°C以上也無一能生長，菌體生長后期有膠體產(chǎn)生，菌體在 培養(yǎng)基中為奶白色，在培養(yǎng)基上菌株不合成非類胡蘿卜素性質(zhì)不溶于水的黃色素。
[0068] 本發(fā)明還涉及所述的黃單胞菌NYW79在生產(chǎn)無色素黃原膠中的用途。
[0069] 根據(jù)本發(fā)明，生產(chǎn)無色素黃原膠的步驟如下：
[0070] A、活化培養(yǎng)
[0071] 挑取一環(huán)斜面保藏黃單胞菌NYW79菌種接種到茄瓶斜面培養(yǎng)基中，在溫度30°C下 培養(yǎng)72h，斜面菌種奶白色，斜面菌苔顏色明顯低于出發(fā)菌株顏色，得到活化黃單胞菌NYW79 菌種。
[0072] 所述的斜面培養(yǎng)基是采用下述方法制備得到的：將0.8~1.2重量份蔗糖、0.06~ 0.10重量份蛋白胨、0.08-0.12重量份酵母浸汁、0.4~0.6重量份牛肉膏、1~3重量份瓊脂、 0· 1~0·3重量份K2HPO4 · 3H20、0·08~0· 12重量份NaCl與0·08~0· 12重量份MgS〇4溶于100 重量份水中，攪拌均勻，再使用無機酸或無機堿水溶液將其PH值調(diào)節(jié)到7.0，再在溫度121°C 下滅菌30min，得到所述的斜面培養(yǎng)基。
[0073] 所述的無機酸是硝酸、硫酸或鹽酸;所述的無機堿是氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉 或碳酸鉀。
[0074] 在本發(fā)明中，所述無機酸或無機堿水溶液的濃度并不十分關(guān)鍵，這個濃度通常是 0·1~0·5mol/L。
[0075] 在這個步驟中斜面培養(yǎng)使用的設(shè)備是微生物培養(yǎng)通常使用的設(shè)備，例如由山東濰 坊精鷹醫(yī)療器戒有限公司以商品名電熱恒溫培養(yǎng)箱銷售的恒溫控制產(chǎn)品。
[0076] B、液體種子培養(yǎng)
[0077] 按照以使用的種子培養(yǎng)基重量計1~3%，將步驟A得到的活化黃單胞菌NYW79菌種 接種于種子培養(yǎng)基中，在搖床中在溫度30°C下培養(yǎng)18小時，得到黃單胞菌NYW79菌種發(fā)酵 液。
[0078] 所述的種子培養(yǎng)基是采用下述方法制備得到的：0.8~1.2重量份葡萄糖、0.06~ 0.10重量份蛋白胨、0.08~0.12重量份酵母浸汁、0.4~0.6重量份牛肉膏、0.1~0.3重量份 K2HPO4 · 3H20、0.08~0.12重量份NaCl與0.08~0.12重量份MgS〇4溶于100重量份水中，攪拌 均勻，再使用無機酸或無機堿水溶液將其PH值調(diào)節(jié)到7.0，再在溫度121°C下滅菌30分鐘，得 到所述的種子培養(yǎng)基。
[0079] 有關(guān)無機酸或無機堿水溶液的情況已在前面描述過，在此不再贅述。
[0080] 在這個步驟中種子培養(yǎng)使用的設(shè)備是微生物培養(yǎng)通常使用的設(shè)備，例如由上海世 平實驗設(shè)備有限公司以商品名恒溫?fù)u床銷售的恒溫控制搖床產(chǎn)品。
[0081 ] C、發(fā)酵培養(yǎng)
[0082]按照以使用的發(fā)酵培養(yǎng)基重量計4~10重量％，將步驟B)得到的黃單胞菌NYW79菌 種發(fā)酵液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度32~33°C下發(fā)酵培養(yǎng)26小時，接著往所述的發(fā)酵培 養(yǎng)基中添加淀粉作為碳源，在溫度29~3TC下繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)27~48小時，然后在溫度28°C 下發(fā)酵培養(yǎng)直至發(fā)酵結(jié)束；
[0083]所述的發(fā)酵培養(yǎng)基是采用下述方法制備得到的：0.6~1.0重量份葡萄糖、0.6~ 1 · 0重量份酵母粉、0 · 04~0 · 06重量份NH4NO3、0 · 01~0 · 03重量份K2HPO4 · 3H20溶于100重量 份水中，攪拌均勻，再使用無機酸或無機堿水溶液將其PH值調(diào)節(jié)到7.0,再在溫度121°C下滅 菌30分鐘，得到所述的發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0084] 在這個步驟中，淀粉添加量是所述發(fā)酵培養(yǎng)基重量的4~6%。
[0085] 有關(guān)無機酸或無機堿水溶液的情況已在前面描述過，在此不再贅述。
[0086] 在這個步驟中發(fā)酵培養(yǎng)使用的設(shè)備是微生物培養(yǎng)通常使用的設(shè)備，例如由江蘇豐 澤生物工程設(shè)備制造有限公司以商品名全自動發(fā)酵罐銷售的全自動發(fā)酵控制產(chǎn)品。
[0087] D、黃原膠沉淀
[0088]將步驟C得到的發(fā)酵液使用金壇市醫(yī)療儀器公司以商品名離心沉淀器銷售的離心 機在轉(zhuǎn)速6000r/min的條件下離心分離15min，往得到的上清液中與濃度為以體積計20 %乙 醇溶液按照體積比1:1.8~2.2混合均勻，再加入以發(fā)酵液體積計0.5 %氯化鈣溶液，在斬拌 罐中處理20min，再使用金壇市醫(yī)療儀器公司以商品名離心沉淀器的離心機在轉(zhuǎn)速6000r/ min的條件下離心分離15min，往得到的沉淀中加入以其體積計30 %乙醇，混合后加入 0. lmol/L氫氧化鈉水溶液將其pH調(diào)節(jié)至7.50，接著使用金壇市醫(yī)療儀器公司以商品名離心 沉淀器銷售的離心機進行固液分離，得到的沉淀物在溫度85°C下烘干至恒重，得到的產(chǎn)物 采用本說明書描述的方法分析確定，它是無色素黃原膠。
[0089]在這個步驟中，添加20%乙醇溶液的主要作用在于使黃原膠初步形成絮狀沉淀。 如果發(fā)酵液與20%乙醇溶液的體積比大于1:1.8,如果攪拌的速度慢易形成包水塊狀物，影 響產(chǎn)品溶解;如果發(fā)酵液與20%乙醇溶液的體積比小于1:2.2,則不利于黃原膠形成絮狀沉 淀析出；因此，發(fā)酵液與20%乙醇溶液的體積比為1:1.8~2.2是合理的。
[0090] 在這個步驟中，添加0.5%氯化鈣溶液的主要作用在于黃原膠與氯化鈣形成黃原 膠鈣凝膠狀沉淀。本法與溶劑法相比，溶劑的耗用量較少，酒精用量減少一半，但在成品中 帶入了鈣離子，成品顏色略灰，用酸調(diào)節(jié)可以減少鈣離子帶入產(chǎn)品，由于本產(chǎn)品不形成色 素，用少量酒精提出產(chǎn)品顏色淺，同時提高了產(chǎn)品的提取收率在97%左右。
[0091] 在這個步驟中，往得到的沉淀中添加30%乙醇的主要目的是使黃原膠脫水徹底， 利于黃原膠沉淀進行烘干。
[0092]有關(guān)無機堿液的情況已在前面描述過，在此不再贅述。
[0093]將發(fā)酵液在轉(zhuǎn)速6000r/min的條件下離心分離15min，往得到的沉淀中加以其體積 計30%乙醇，劇烈振蕩處理，離心分離，得到黃原膠多糖沉淀，讓這種沉淀在溫度85°C下烘 干至恒重，得到無色素黃原膠多糖產(chǎn)物。
[0094]該多糖產(chǎn)物采用紅外光譜與核磁共振譜分析技術(shù)確定它是無色素黃原膠。
[0095]根據(jù)GB 50093-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測定，所述發(fā)酵液多糖含量 達到39.40g/L，出發(fā)菌株NY07為34.28g/L，NYW79菌株的黃原膠多糖產(chǎn)量比出發(fā)菌株NY07提 尚 14 · 9 % 〇
[0096]發(fā)酵液顏色和吸光度測定。由NYW79菌株得到的發(fā)酵液在發(fā)酵時間Oh至72h內(nèi)均為 乳白色，而由出發(fā)菌株NY07得到的發(fā)酵液在發(fā)酵時間Oh至72h內(nèi)顏色逐漸加深，直觀對比， 本發(fā)明得到的發(fā)酵液色素含量明顯降低。
[0097]將發(fā)酵液在轉(zhuǎn)速6000r/min的條件下離心分離15min，分離菌體，得到的上清液使 用分光光度計以蒸餾水為空白測定在500nm波長處的吸光度。
[0098] 使用分光光度計測定，NYW79菌株發(fā)酵液的OD值為0.11，而出發(fā)菌株NY07發(fā)酵液的 OD值為0.48，因此本發(fā)明發(fā)酵液的OD值降低77.1 %。
[0099][有益效果]
[0100] 本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明以傳統(tǒng)的含有色素的黃單孢桿菌NY07為出發(fā)菌株， 利用亞硝基胍誘變、篩出一株無色素的黃單孢桿菌菌株NYW79。使用NYW79菌株生產(chǎn)黃原膠 的產(chǎn)量比誘變出發(fā)NY07菌株提高14.9%以上;發(fā)酵液的OD值降低77.1 %以上，由此可見，由 NYW79菌株生產(chǎn)黃原膠能夠從根本上解決黃原膠產(chǎn)品的脫色問題，同時黃原膠多糖產(chǎn)量也 非常顯著提高。
[0101] 黃色素缺陷型黃單胞菌(Xanthomonas sp. )NYW79菌株已于2016年06月16日在北 京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中心保藏，其保藏號為CGMCC N〇12620。 【【附圖說明】】
[0102] 圖1是實施例1-3與對比實施例1-3實施得率結(jié)果圖。
[0103] 圖2是實施例1-3與對比實施例1-3實施OD值結(jié)果圖。
[0104] 圖3是NTG誘變對致死率影響的示意圖。 【【具體實施方式】】
[0105] 通過下述實施例將能夠更好地理解本發(fā)明。
[0106] 在本發(fā)明中，如無特殊說明，用于說明濃度的"％"均為重量百分比；"份"均為重量 份。
[0107] 實施例1:使用NYW79菌株生產(chǎn)無色素黃原膠
[0108] 該實施例的實施步驟如下 [0109] A、活化培養(yǎng)
[0110] 所述的斜面培養(yǎng)基制備方法如下：將0.8重量份蔗糖、0.06重量份蛋白胨、0.10重 量份酵母浸汁、〇. 4重量份牛肉膏、1重量份瓊脂、0.2重量份K2HPO4 · 3H20、0.08重量份NaCl 與0.08重量份MgSO4溶于100重量份水中，攪拌均勻，再使用0. lmol/L硝酸或氫氧化鈉水溶 液將其PH值調(diào)節(jié)到7.0，再在溫度121°C下滅菌30min，得到所述的斜面培養(yǎng)基。
[0111] 挑取一環(huán)斜面保藏黃單胞菌NYW79菌種接種到茄瓶斜面培養(yǎng)基中，在山東濰坊精 鷹醫(yī)療器戒有限公司以商品名電熱恒溫培養(yǎng)箱銷售的設(shè)備中在溫度30°C下培養(yǎng)72h，斜面 菌種奶白色，斜面菌苔顏色明顯低于出發(fā)菌株顏色，得到活化黃單胞菌NYW79菌種；
[0112] B、液體種子培養(yǎng)
[0113] 所述的種子培養(yǎng)基制備方法如下：1.0重量份葡萄糖、0.06重量份蛋白胨、0.08重 量份酵母浸汁、0.5重量份牛肉膏、0.1重量份Κ 2ΗΡ〇4 · 3H20、0.08重量份NaCl與0.10重量份 MgSO4溶于100重量份水中，攪拌均勻，再使用0. lmol/L硝酸或氫氧化鈉水溶液將其pH值調(diào) 節(jié)到7.0,再在溫度121°C下滅菌30分鐘，得到所述的種子培養(yǎng)基。
[0114] 按照以使用的種子培養(yǎng)基重量計1 %，將步驟A得到的活化黃單胞菌NYW79菌種接 種于種子培養(yǎng)基中，在上海世平實驗設(shè)備有限公司以商品名恒溫?fù)u床銷售的設(shè)備中在溫度 30 °C下培養(yǎng)18小時，得到黃單胞菌NYW79菌種發(fā)酵液；
[0115] C、發(fā)酵培養(yǎng)
[0116] 所述的發(fā)酵培養(yǎng)基制備方法如下:0.6重量份葡萄糖、0.6重量份酵母粉、0.05重量 份順4如3、0.01重量份1( 2即04.3!120溶于100重量份水中，攪拌均勻，再使用0.1111〇1/1硝酸或 氫氧化鈉水溶液將其PH值調(diào)節(jié)到7.0,再在溫度121°C下滅菌30分鐘，得到所述的發(fā)酵培養(yǎng) 基。
[0117] 按照以使用的發(fā)酵培養(yǎng)基重量計7重量％，將步驟B)得到的黃單胞菌NYW79菌種發(fā) 酵液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在江蘇豐澤生物工程設(shè)備制造有限公司以商品名全自動發(fā)酵罐 銷售的設(shè)備中在溫度32°C下發(fā)酵培養(yǎng)26小時，接著往所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加所述發(fā)酵培 養(yǎng)基重量的4%的淀粉作為碳源，在溫度29 °C下繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)34小時，然后在溫度28 °C下發(fā) 酵培養(yǎng)直至發(fā)酵結(jié)束；
[0118] 采用100g發(fā)酵液沉淀物在溫度105°C下干燥3小時標(biāo)準(zhǔn)方法測定得率的標(biāo)準(zhǔn)方法 測定，得到的發(fā)酵液多糖含量是39.40g/L;采用本說明書描述的方法測定所述發(fā)酵液的OD 值為0.11。這些結(jié)果列于附圖1-2中。
[0119] D、黃原膠沉淀
[0120] 將步驟C得到的發(fā)酵液使用金壇市醫(yī)療儀器公司以商品名離心沉淀器銷售的離心 機在轉(zhuǎn)速600〇1'/111；[11的條件下離心分離151]1；[11，得到的上清液與濃度為以體積計20%乙醇溶 液按照體積比1:1.8混合均勻，再加入以發(fā)酵液體積計0.5 %氯化鈣溶液，在斬拌罐中處理 20min，再使用金壇市醫(yī)療儀器公司以商品名離心沉淀器的離心機在轉(zhuǎn)速6000r/min的條件 下離心分離15min，往得到的沉淀中加入以其體積計30%乙醇，混合后加入0.1 N氫氧化鈉水 溶液將其PH調(diào)節(jié)至7.50,接著用使用金壇市醫(yī)療儀器公司以商品名離心沉淀器銷售的離心 機進行固液分離，得到的沉淀物在溫度85°C下烘干至恒重，得到的產(chǎn)物采用本說明書描述 的方法分析確定，它是無色素黃原膠。
[0121 ]實施例2:使用NYW79菌株生產(chǎn)無色素黃原膠 [0122]該實施例的實施步驟如下 [0123] A、活化培養(yǎng)
[0124] 所述的斜面培養(yǎng)基制備方法如下：將1.0重量份蔗糖、0.10重量份蛋白胨、0.08重 量份酵母浸汁、0.5重量份牛肉膏、3重量份瓊脂、0.1重量份K 2HPO4 · 3H20、0.10重量份NaCl 與0.12重量份MgSO4溶于100重量份水中，攪拌均勾，再使用0.5mol/L硫酸或氫氧化鉀水溶 液將其PH值調(diào)節(jié)到7.0，再在溫度121°C下滅菌30min，得到所述的斜面培養(yǎng)基。
[0125] 挑取一環(huán)斜面保藏黃單胞菌NYW79菌種接種到茄瓶斜面培養(yǎng)基中，在山東濰坊精 鷹醫(yī)療器戒有限公司以商品名電熱恒溫培養(yǎng)箱銷售的設(shè)備中在溫度30°C下培養(yǎng)72h，斜面 菌種奶白色，斜面菌苔顏色明顯低于出發(fā)菌株顏色，得到活化黃單胞菌NYW79菌種；
[0126] B、液體種子培養(yǎng)
[0127] 所述的種子培養(yǎng)基制備方法如下:0.8重量份葡萄糖、0.8重量份蛋白胨、0.12重量 份酵母浸汁、〇 . 4重量份牛肉膏、0.2重量份K2HP〇4 · 3H20、0.12重量份NaCl與0.08重量份 MgSO4溶于100重量份水中，攪拌均勻，再使用0.5mol/L硫酸或氫氧化鉀水溶液將其pH值調(diào) 節(jié)到7.0,再在溫度121°C下滅菌30分鐘，得到所述的種子培養(yǎng)基。
[0128] 按照以使用的種子培養(yǎng)基重量計3%，將步驟A得到的活化黃單胞菌NYW79菌種接 種于種子培養(yǎng)基中，在上海世平實驗設(shè)備有限公司以商品名恒溫?fù)u床銷售的設(shè)備中在溫度 30 °C下培養(yǎng)18小時，得到黃單胞菌NYW79菌種發(fā)酵液；
[0129] C、發(fā)酵培養(yǎng)
[0130] 所述的發(fā)酵培養(yǎng)基制備方法如下：1.0重量份葡萄糖、1.0重量份酵母粉、0.04重量 份順4如3、0.02重量份1( 2即04.3!120溶于100重量份水中，攪拌均勻，再使用0.5111〇1/1硫酸或 氫氧化鉀水溶液將其PH值調(diào)節(jié)到7.0,再在溫度121°C下滅菌30分鐘，得到所述的發(fā)酵培養(yǎng) 基。
[0131 ]按照以使用的發(fā)酵培養(yǎng)基重量計4重量％，將步驟B)得到的黃單胞菌NYW79菌種發(fā) 酵液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在江蘇豐澤生物工程設(shè)備制造有限公司以商品名全自動發(fā)酵罐 銷售的設(shè)備中在溫度33°C下發(fā)酵培養(yǎng)26小時，接著往所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加所述發(fā)酵培 養(yǎng)基重量的6%的淀粉作為碳源，在溫度30°C下繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)27小時，然后在溫度28 °C下發(fā) 酵培養(yǎng)直至發(fā)酵結(jié)束；
[0132] 得到的發(fā)酵液參照采用國際標(biāo)準(zhǔn)IS01026-1982標(biāo)準(zhǔn)方法測定多糖含量是41.6g/ L;采用本說明書描述的方法測定所述發(fā)酵液的OD值0.11。這些結(jié)果列于附圖1-2中。
[0133] D、黃原膠沉淀
[0134] 將步驟C得到的發(fā)酵液使用金壇市醫(yī)療儀器公司以商品名離心沉淀器銷售的離心 機在轉(zhuǎn)速600〇1'/111；[11的條件下離心分離151]1；[11，得到的上清液與濃度為以體積計20%乙醇溶 液按照體積比1:1.8混合均勻，再加入以發(fā)酵液體積計0.5 %氯化鈣溶液，在斬拌罐中處理 20min，再使用金壇市醫(yī)療儀器公司以商品名離心沉淀器的離心機在轉(zhuǎn)速6000r/min的條件 下離心分離15min，往得到的沉淀中加入以其體積計30%乙醇，混合后加入0.1 N氫氧化鈉水 溶液將其PH調(diào)節(jié)至7.50,接著用使用金壇市醫(yī)療儀器公司以商品名離心沉淀器銷售的離心 機進行固液分離，得到的沉淀物在溫度85°C下烘干至恒重，得到的產(chǎn)物采用本說明書描述 的方法分析確定，它是無色素黃原膠。
[0135] 實施例3:使用NYW79菌株生產(chǎn)無色素黃原膠
[0136] 該實施例的實施步驟如下
[0137] A、活化培養(yǎng)
[0138] 所述的斜面培養(yǎng)基制備方法如下：將1.2重量份蔗糖、0.08重量份蛋白胨、0.12重 量份酵母浸汁、〇. 6重量份牛肉膏、2重量份瓊脂、0.3重量份K2HPO4 · 3H20、0.12重量份NaCl 與0.10重量份MgS〇4溶于100重量份水中，攪拌均勾，再使用0.3mol/L鹽酸或碳酸鈉水溶液 將其PH值調(diào)節(jié)到7.0，再在溫度121°C下滅菌30min，得到所述的斜面培養(yǎng)基。
[0139] 挑取一環(huán)斜面保藏黃單胞菌NYW79菌種接種到茄瓶斜面培養(yǎng)基中，在山東濰坊精 鷹醫(yī)療器戒有限公司以商品名電熱恒溫培養(yǎng)箱銷售的設(shè)備中在溫度30°C下培養(yǎng)72h，斜面 菌種奶白色，斜面菌苔顏色明顯低于出發(fā)菌株顏色，得到活化黃單胞菌NYW79菌種；
[0140] B、液體種子培養(yǎng)
[0141] 所述的種子培養(yǎng)基制備方法如下：1.2重量份葡萄糖、0.10重量份蛋白胨、0.10重 量份酵母浸汁、0.6重量份牛肉膏、0.3重量份K 2HP〇4 · 3H20、0.10重量份NaCl與0.12重量份 MgSO4溶于100重量份水中，攪拌均勻，再使用0.3mol/L鹽酸碳酸鈉溶液將其pH值調(diào)節(jié)到 7.0,再在溫度121°C下滅菌30分鐘，得到所述的種子培養(yǎng)基。
[0142] 按照以使用的種子培養(yǎng)基重量計2%，將步驟A得到的活化黃單胞菌NYW79菌種接 種于種子培養(yǎng)基中，在上海世平實驗設(shè)備有限公司以商品名恒溫?fù)u床銷售的設(shè)備中在溫度 30 °C下培養(yǎng)18小時，得到黃單胞菌NYW79菌種發(fā)酵液；
[0143] C、發(fā)酵培養(yǎng)
[0144] 所述的發(fā)酵培養(yǎng)基制備方法如下:0.8重量份葡萄糖、0.8重量份酵母粉、0.06重量 份順4如3、0.03重量份1( 2即04.3!120溶于100重量份水中，攪拌均勻，再使用0.3111〇1/1鹽酸或 碳酸鈉水溶液將其PH值調(diào)節(jié)到7.0,再在溫度121°C下滅菌30分鐘，得到所述的發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0145] 按照以使用的發(fā)酵培養(yǎng)基重量計10重量％，將步驟B)得到的黃單胞菌NYW79菌種 發(fā)酵液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在江蘇豐澤生物工程設(shè)備制造有限公司以商品名全自動發(fā)酵 罐銷售的設(shè)備中在溫度32°C下發(fā)酵培養(yǎng)26小時，接著往所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中添加所述發(fā)酵 培養(yǎng)基重量的5%的淀粉作為碳源，在溫度31°C下繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)48小時，然后在溫度28°C下 發(fā)酵培養(yǎng)直至發(fā)酵結(jié)束；
[0146] 得到的發(fā)酵液根據(jù)參照采用國際標(biāo)準(zhǔn)IS01026-1982標(biāo)準(zhǔn)方法測定多糖含量是 40.02g/L;采用本說明書描述的方法測定所述發(fā)酵液的OD值為0.10。這些結(jié)果列于附圖1-2 中。
[0147] D、黃原膠沉淀
[0148] 將步驟C得到的發(fā)酵液使用金壇市醫(yī)療儀器公司以商品名離心沉淀器銷售的離心 機在轉(zhuǎn)速600〇1'/111；[11的條件下離心分離151]1；[11，得到的上清液與濃度為以體積計20%乙醇溶 液按照體積比1:1.8混合均勻，再加入以發(fā)酵液體積計0.5 %氯化鈣溶液，在斬拌罐中處理 20min，再使用金壇市醫(yī)療儀器公司以商品名離心沉淀器的離心機在轉(zhuǎn)速6000r/min的條件 下離心分離15min，往得到的沉淀中加入以其體積計30%乙醇，混合后加入0.1 N氫氧化鈉水 溶液將其PH調(diào)節(jié)至7.50,接著用使用金壇市醫(yī)療儀器公司以商品名離心沉淀器銷售的離心 機進行固液分離，得到的沉淀物在溫度85°C下烘干至恒重，得到的產(chǎn)物采用本說明書描述 的方法分析確定，它是無色素黃原膠。
[0149] 對比實施例1:使用出發(fā)NY07菌株生產(chǎn)黃原膠
[0150]按照與實施例1相同的實施方式進行，只是本對比實施例使用出發(fā)NY07菌株生產(chǎn) 黃原膠，得到的發(fā)酵液根據(jù)參照采用國際標(biāo)準(zhǔn)IS01026-1982標(biāo)準(zhǔn)方法測定多糖含量是 34.28g/L;采用本說明書描述的方法測定所述發(fā)酵液的OD值為0.48。這些結(jié)果列于附圖1-2 中。
[0151 ]與本對比實施例1相比，實施例1的黃原膠多糖產(chǎn)量提高14.9% ;實施例1發(fā)酵液的 OD值降低77.1%。
[0152]對比實施例2:使用出發(fā)NY07菌株生產(chǎn)黃原膠
[0153]按照與實施例2相同的實施方式進行，只是本對比實施例使用出發(fā)NY07菌株生產(chǎn) 黃原膠，得到的發(fā)酵液根據(jù)參照采用國際標(biāo)準(zhǔn)IS01026-1982標(biāo)準(zhǔn)方法測定多糖含量是 33.6g/L;采用本說明書描述的方法測定所述發(fā)酵液的OD值為0.51。這些結(jié)果列于附圖1-2 中。
[0154] 與本對比實施例2相比，實施例1的黃原膠多糖產(chǎn)量提高17.2%;實施例2發(fā)酵液的 OD值降低78.4%。
[0155] 對比實施例3:使用出發(fā)NY07菌株生產(chǎn)黃原膠
[0156]按照與實施例3相同的實施方式進行，只是本對比實施例使用出發(fā)NY07菌株生產(chǎn) 黃原膠，得到的發(fā)酵液根據(jù)參照采用國際標(biāo)準(zhǔn)IS01026-1982標(biāo)準(zhǔn)方法測定多糖含量是 32.6g/L;采用本說明書描述的方法測定所述發(fā)酵液的OD值為0.50。這些結(jié)果列于附圖1-2 中。
[0157] 與本對比實施例3相比，實施例1的黃原膠多糖產(chǎn)量提高20.9%;實施例1發(fā)酵液的 OD值降低78 %。
[0158] 上述實施例與對比實施例的實施結(jié)果表明，使用由本發(fā)明誘變方法得到的NYW79 菌株生產(chǎn)黃原膠的產(chǎn)量比誘變出發(fā)NY07菌株提高14.9%以上;發(fā)酵液的OD值降低77.1 %以 上，由此可見，由NYW79菌株生產(chǎn)黃原膠能夠從根本上解決黃原膠產(chǎn)品的脫色問題，同時黃 原膠多糖產(chǎn)量也非常顯著提高。
【主權(quán)項】
1. 一株黃色素缺陷型黃單胞菌(乂&111:11〇1]1〇仙8 8。.）階?79，該菌株已于2016年06月16日 在北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心保藏，其保藏號為CGMCC N〇12620。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃單胞菌NYW79在生產(chǎn)無色素黃原膠中的用途。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于生產(chǎn)無色素黃原膠的步驟如下： A、 活化培養(yǎng) 挑取一環(huán)斜面保藏黃單胞菌NYW79菌種接種到茄瓶斜面培養(yǎng)基中，在溫度30°C下培養(yǎng) 72h，斜面菌種奶白色，斜面菌苔顏色明顯低于出發(fā)菌株顏色，得到活化黃單胞菌NYW79菌 種； B、 液體種子培養(yǎng) 按照以使用的種子培養(yǎng)基重量計1~3 %，將步驟A得到的活化黃單胞菌NYW79菌種接種 于種子培養(yǎng)基中，在搖床中以溫度30°C下培養(yǎng)18小時，得到黃單胞菌NYW79菌種液； C、 發(fā)酵培養(yǎng) 按照以使用的發(fā)酵培養(yǎng)基重量計4~10重量％，將步驟B)得到的黃單胞菌NYW79菌種液 接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度32~33 °C下發(fā)酵培養(yǎng)26小時，接著往所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中添 加淀粉作為碳源，在溫度29~31°C下繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)27~48小時，然后在溫度28°C下發(fā)酵培 養(yǎng)直至發(fā)酵結(jié)束； D、 黃原膠沉淀 將步驟C得到的發(fā)酵液離心分離沉淀菌體，往上清液中加入濃度為以體積計20%乙醇 溶液按照體積比1:1.8~2.2混合均勻，再加入以發(fā)酵液體積計0.5 %氯化鈣溶液，在斬拌罐 中處理20min，再離心分離，往得到的沉淀物中加入以其體積計30%乙醇，混合后加入無機 堿液將其pH調(diào)節(jié)至7.50,接著用離心機進行固液分離，得到的沉淀物在溫度85°C下烘干，得 到所述的無色素黃原膠。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于在步驟A中，所述的斜面培養(yǎng)基制備方法如 下:將0.8~1.2重量份蔗糖、0.06~0.10重量份蛋白胨、0.08-0.12重量份酵母浸汁、0.4~ 0.6重量份牛肉膏、1~3重量份瓊脂、0.1~0.3重量份Κ2ΗΡ〇4 · 3H20、0.08~0.12重量份NaCl 與0.08~0.12重量份MgS〇4溶于100重量份水中，攪拌均勻，再使用無機酸或無機堿水溶液 將其pH值調(diào)節(jié)到7.0，再在溫度121°C下滅菌30min，得到所述的斜面培養(yǎng)基。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的黃單胞菌，其特征在于在步驟B中，所述的種子培養(yǎng)基制備方 法如下：0.8~1.2重量份葡萄糖、0.06~0.10重量份蛋白胨、0.08~0.12重量份酵母浸汁、 0.4~0.6重量份牛肉膏、0.1~0.3重量份1(2冊04.3!120、0.08~0.12重量份恥(：1與0.08~ 0.12重量份MgS〇4溶于100重量份水中，攪拌均勻，再使用無機酸或無機堿水溶液將其pH值 調(diào)節(jié)到7.0，再在溫度121°C下滅菌30分鐘，得到所述的種子液體培養(yǎng)基。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的黃單胞菌，其特征在于在步驟C中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基制備方 法如下:0.6~1.0重量份葡萄糖、0.6~1.0重量份酵母粉、0.04~0.06重量份NH4N03、0.01~ 0.03重量份Κ 2ΗΡ〇4 · 3H20溶于100重量份水中，攪拌均勻，再使用無機酸或無機堿水溶液將 其pH值調(diào)節(jié)到7.0,再在溫度121°C下滅菌30分鐘，得到所述的發(fā)酵培養(yǎng)基。7. 根據(jù)權(quán)利要求3~6中任一項權(quán)利要求所述的用途，其特征在于所述的無機酸是硝 酸、硫酸或鹽酸;所述的無機堿是氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉或碳酸鉀。8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于在步驟C中，淀粉添加量是所述發(fā)酵培養(yǎng)基 重量的4~6%。
【文檔編號】C12N1/20GK105861401SQ201610475116
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年6月24日
【發(fā)明人】尹麗華, 王恒書
【申請人】鄂爾多斯市中軒生化股份有限公司