一種地毯草黃單胞菌菌株及應(yīng)用
【專利說明】一種地毯草黃單胞菌菌株及應(yīng)用 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物及其應(yīng)用，尤其涉及一種地毯草黃單胞菌菌株及應(yīng)用其制備多 糖膠質(zhì)。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 多糖是以單糖為基本組成單位，按一定方式重復(fù)排列而成的聚合物。用于食品加 工的多糖俗稱為膠質(zhì)，即多糖膠質(zhì)。多糖膠質(zhì)可來源于動物、植物、微生物，海藻類多糖膠 質(zhì)主要包括瓊脂和卡拉膠以及海藻酸及其衍生物。植物類多糖膠質(zhì)包括阿拉伯膠、纖維素 膠及其衍生物、魔芋粉等。微生物多糖膠質(zhì)主要包括黃原膠、結(jié)冷膠、卡拉膠等，具有粘著 性、穩(wěn)定性、乳化性和凝膠性等特點(diǎn)，在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域等方面都有著廣泛的應(yīng)用，尤其是近 些年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的引入，多糖在抗凝血、延緩衰老、抗癌防癌、疾病免疫等方 面的功能也逐漸被揭示出來。按其用途，多糖膠質(zhì)又可被分類為增稠劑和膠凝劑，可作為 食品添加劑、凝結(jié)劑、保鮮劑等。已報(bào)道的可產(chǎn)多糖膠質(zhì)的微生物菌屬有鞘氨醇單胞菌屬 (Sphingomonas)、農(nóng)桿菌屬（Agrobacterium)、黃單胞菌屬（Xanthomonas)等，但未見將地 毯草黃單胞菌作為制備多糖膠質(zhì)的應(yīng)用。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種地毯草黃單胞菌菌株 FJAT-10151 (Xanthomonas axonopodis)，該地毯草黃單胞菌菌株 FJAT-10151 (Xanthomonas axonopodis)于2015年01月04日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏編號為CGMCC No. 10271，且采用該地毯 草黃單胞菌菌株FJAT-10151制備獲得一種硬度小、且彈性和粘著性均較佳的多糖膠質(zhì)。
[0004] 本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題的：
[0005] 本實(shí)驗(yàn)室從福建省順昌縣的黃龍病紅心柚的柚葉片上分離并通過產(chǎn)多糖膠質(zhì)篩 選得到的菌株，并對該菌株其理化特性等進(jìn)行鑒定，最終鑒定其為地毯草黃單胞菌菌屬的 一個(gè)菌株。
[0006] 進(jìn)一步地，采用該菌株制備獲得一種硬度小、且彈性和粘著性均較佳的多糖膠質(zhì)， 其制備方法的具體步驟如下：
[0007] (1)權(quán)利要求1中所述的地毯草黃單胞菌菌株FJAT-10151的活化：用接種環(huán)將權(quán) 利要求1中所述的地毯草黃單胞菌菌株FJAT-10151劃線于NA平板上，并于恒溫培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)48h，并且培養(yǎng)溫度為30°C ;
[0008] (2)制備種子液：將步驟（1)所獲得的地毯草黃單胞菌菌株FJAT-10151的單菌落 接種于種子培養(yǎng)基中，并將其置于恒溫振蕩搖床中培養(yǎng)16h，溫度30°C，轉(zhuǎn)速170rpm/min ;
[0009] (3)制備菌株發(fā)酵液：按2%接種量將步驟（2)所獲得的種子液轉(zhuǎn)入已消毒滅菌的 發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度30°C，轉(zhuǎn)速190rpm/min，培養(yǎng)72h即獲得菌株發(fā)酵液；
[0010] (4)多糖膠質(zhì)的制備：將步驟（3)所得的菌株發(fā)酵液進(jìn)行離心分離，收集上清液， 用冰乙醇沉降多糖膠質(zhì)，且冰乙醇與上清液的體積比為3 :1 ;之后于4°C下靜置過夜，接著 進(jìn)行離心分離，采用無水乙醇洗滌離心所得的沉淀3遍，氮?dú)獯蹈?，最后粉碎即得所述多?膠質(zhì)的產(chǎn)物。
[0011] 進(jìn)一步地，所述NA平板的組分為：牛肉膏3g七1、蛋白胨5g七1、葡萄糖IOg七 1、 酵母膏Ig · L'瓊脂粉17g · L'pH 7. 2 ;所述種子培養(yǎng)基的組分為：鹿糖20g · L'蛋白胨 5g ·Ι7\酵母膏5g .L'pH 7. 0 ;發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖30g .L'蛋白胨3g ·Ι7\酵母膏2g七1、 KH2PO4Ig · IAMgSO4O. Ig · L-1、微量元素鹽溶液lmL/L、pH 7. 0 ;其中，微量元素鹽溶液的組 分為：MnCl2 · 4H20 I. 8g · Γ1，F(xiàn)eSO4 · 7H20 2. 4g · Γ1，H3BO3O. 283g · Γ1，CuCl20.00 27g · Γ1， CoCl2 · 6H20 0· 0074g · Γ1。
[0012] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0013] 提供了一種地毯草黃單胞菌菌株FJAT-10151，并且采用該地毯草黃單胞菌菌株 FJAT-10151制備多糖膠質(zhì)；該多糖膠質(zhì)硬度小，彈性、粘著性好，膠粘性和咀嚼性佳，此外 還具有制備過程簡單的特點(diǎn)。 【【附圖說明】】
[0014] 下面參照附圖結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。
[0015] 圖1是16S rDNA序列構(gòu)建的菌株FJAT-10151的系統(tǒng)發(fā)育樹。 【【具體實(shí)施方式】】
[0016] 本發(fā)明一種地毯草黃單胞菌菌株FJAT-10151 (Xanthomonas axonopodis)是從福 建省順昌縣的黃龍病紅心柚的柚葉片上分離并通過產(chǎn)多糖膠質(zhì)篩選得到的菌株，且通過該 菌株獲得一種硬度小、膠性良好的多糖膠質(zhì)。
[0017] 1、該菌株 FJAT-10151 的分離：
[0018] (1)稱取黃龍病紅心柚的柚葉片（該柚葉片處于整棵紅心柚子樹的北面下部）5g， 首先將柚葉片用自來水沖洗干凈，吸干柚葉片表面的水，之后于75 %酒精中浸泡30s，接著 取出用10%次氯酸鈉浸泡5分鐘，再用無菌水漂洗柚葉片3次；
[0019] (2)為了檢驗(yàn)柚葉片表面滅菌的效果，用滅過菌的鑷子夾著經(jīng)步驟（1)處理過的 柚葉片并使其表面與NA平板接觸2min，然后將NA平板放在30°C培養(yǎng)2d，若發(fā)現(xiàn)平板上沒 有菌落出現(xiàn)，證明該柚葉片表面滅菌徹底，能夠用于后續(xù)的操作；
[0020] (3)取步驟（2)檢驗(yàn)后滅菌徹底的柚葉片，無菌操作下將柚葉片剪碎至研缽里 并加入45mL無菌水，充分研磨勻漿制成KT 1樣品原液，靜置30min ;依次將樣品原液進(jìn)行 梯度稀釋，選用稀釋度為10' KT3;取200 μ L稀釋液分別加到NA平板上，并涂布至平板 干燥，重復(fù)3次；將涂布后的NA平板置于28°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，觀察菌落形態(tài)、顏色、 邊緣狀態(tài)、透明度、表面干濕狀態(tài)等特征；挑取各部位具有代表性的單菌落，并計(jì)數(shù)、純化、 20%甘油-80°C保存，從而分離得到菌株，為了方便描述，將分離所得的菌株命名為菌株 FJAT-10151〇
[0021] 2.該菌株 FJAT-10151 的鑒定：
[0022] 形態(tài)學(xué)鑒定：
[0023] 對菌株FJAT-10151的理化特性等進(jìn)行鑒定，得到該菌株FJAT-10151的主要形態(tài) 及生理生化如下：菌落較小、圓形、淡黃色、表面光滑且濕潤、微隆、邊緣整齊、不透明、具有 迀移性，革蘭氏陰性，七葉苷、ONPG、半固體瓊脂、葡萄糖半固體、葡萄糖銨和鳥氨酸脫羧酶 為陽性，MR-VP、丙二酸鹽、尿素酶、甘露醇、山梨醇、衛(wèi)矛醇、乳糖、木糖、水楊苷、鼠李糖、棉 子糖、木糖明膠、西蒙氏枸櫞酸鹽、賴氨酸脫羧酶和色氨酸肉湯為陰性。
[0024] 分子生物學(xué)鑒定：
[0025] 采用苯酚-氯仿法對菌株FJAT-10151進(jìn)行DNA提??；以提取所獲 得的菌株DNA為模板，以細(xì)菌通用引物（如SEQ ID NO :1、2所示：正向引物 5' -GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物 5' -ACGGCTACCTTGTTA CGACTT-3')為引物對 進(jìn)行PCR擴(kuò)增：
[0026] ?0?擴(kuò)增反應(yīng)體系（25 4 1^體系）：1414莫板、0.5 41^0.0